植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及植酸酶突变体YkAPPA?L396V、YeAPPA?L396V及其编码基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示的植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。相比于野生型，本发明的两个植酸酶突变体YkAPPA?L396V和YeAPPA?L396V的胃蛋白酶抗性和明显提高，有利于饲料酶开发和应用。
【专利说明】
植酸酶突变体化APPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和 应用
技术领域
[0001 ] 本发明设及基因工程领域，具体设及植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V 及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植酸憐是植物性饲料中憐的最普遍的储存形式，因单胃动物体内缺乏水解植酸及 其盐的植酸酶而难W吸收，因此造成了严重的环境污染。此外，矿物铁和蛋白质通常与植酸 形成不溶性复合物而无法被吸收。因此，通过植酸酶将植酸矿物化是单胃动物生产中提高 营养元素的生物利用率，降低生产成本和保护环境的有效策略。
[0003] 从1907年发现第一个植酸酶后，目前在细菌，真菌，植物，和一些动物已鉴定了众 多的植酸酶。根据催化机理，植酸酶是分为四大类:组氨酸酸性憐酸酶(HAP)、半脫胺酸憐酸 酶(CP)，紫色酸性憐酸酶(PAP)，和β-螺旋奖植酸酶(BP)。大多数微生物植酸酶属于HAP家 庭，是目前研究和商业应用最广泛的植酸酶。目前发现的ΗΑΡ植酸酶一般在pH 1.3-5.5和 45-7(TC具有最高活性，消化系统中强酸和高浓度蛋白酶却常常会降低其生物功能活性。
[0004] 抗蛋白酶消化是植酸酶作为饲料添加剂的一个先决条件。植酸酶的敏感性与暴露 的蛋白酶切割位点及其侧链结构有关，因此改变植酸酶蛋白上胃蛋白酶切割位点的结构可 能有助于提高胃蛋白酶的稳定性。本发明应用定点突变技术改造植酸酶，分别获得植酸酶 突变体YkAPPA-L396V和化APPA-L396V，其胃蛋白酶抗性明显提高，扩大了其在工业上的应 用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是通过定点突变的方法对植酸酶进行改造，使改造后的植酸酶突变 体YkAPPA-L396V或化APPA-L396V在胃蛋白酶抗性上性质更加优良。
[0006] 本发明另一目的是提供编码上述植酸酶突变体YkAPPA-L396V或化APPA-L396V的 基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述植酸酶突变体YkAPPA-L396V或化APPA-L396V 编码基因的重组载体。
[000引本发明的另一目的是提供包含上述植酸酶突变体YkAPPA-L396V或化APPA-L396V 编码基因的重组菌株。
[0009] 本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的植酸酶突变体YkAPPA-L396V或 化APPA-L396V的基因或如前所述的重组载体。
[0010] 本发明对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA或小肠结 膜炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)来源植酸酶化APPA基因进行点突变，该植酸酶的成熟 蛋白具有如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4,所示的核巧酸序列编码的。
[0019] 采用定点突变的方法，获得了2个提高胃蛋白酶抗性的突变体，分别命名为 YkAPPA-L396V和化APPA-L396V，即YkAPPA或化APPA的第396位的亮氨酸突变为鄉氨酸。
[0020] 因此根据本发明的胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体YkAPPA-L396V，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.5所示
[0021] 沈Q ID NO.5
[0022]
[0025] 本发明还提供了编码上述胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体化APPA-L396V和 化八口?4-1^396￥的基因序列，其核巧酸序列如569 10^.7和8所示。
[0026] SEQ ID NO.7
[0027]
cagcctgccatatttaa
[0030] 将上述编码胃蛋白酶抗性提高的突变酶化APPA-L396V或化APPA-L396V的阅读框 插入到所述载体的EcoRI和Notl限制性酶切位点之间，使其核巧酸序列可操作的与表达调 控序列相连接。本发明优选的载体为祀T-22M + )，得到突变体的重组原核表达质粒。本发明 优选的宿主菌为化21 (DE3)。所述植酸酶突变体的核巧酸序列位于T7启动子的下游并受其 调控。相比于野生型，本发明的两个植酸酶突变体YkAPPA-L396V和化APPA-L396V的胃蛋白 酶抗性和明显提高，有利于饲料酶开发和应用。
【附图说明】
[0031] 图1为改造前后的植酸酶的蛋白酶抗性比较；
[0032] 图2为改造前后的植酸酶的耐酸性比较。
【具体实施方式】
[0033] 实验材料
[0034] 原核表达载体祀T-22b (+)购自Novagen公司。大肠杆菌化21 (DE3)细胞、PfU DNA聚 合酶、限制性内切酶和连接酶购自天根公司。植酸钢和蛋白酶购自Sigma公司，其它都为国 产试剂，均可从普通生化试剂公司购买得到。大肠杆菌培养基LB的组份为1%蛋白腺，0.5% 酵母提取物和l%NaCI(pH7.0)。
[0035] 实施例1:突变基因的获得
[0036] 采用0verlapPCR方法产生化APPA和化APPA的突变体化APPA-L396V和化APPA- L396V。该方法W含有野生植酸酶基因的重组质粒祀ASY-T3-YkAPPA和祀ASY-T3-YeAPPA为 模板，通过两轮PCR反应引入突变。扩增突变基因完整编码序列的上下游引物带有EcoR I和 Not I识别序列，分别为YkAPPA F'orward: 5 ' -cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3 ' 和 YkAPPA Reverse:5'-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcG-3'；YeAPPA Forward:5'- cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3 ' 和YeAPPA Reverse：5'- gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcg-3 '。在特定位置引入突变的上下游引物为YkAPPA- L396V Forward:5'-AGGTG町GAATTTTTCGGCCTCACCTTA-3'，化APPA-L396V Reverse:5'- TAAGGTGAGGCCGAAAAATTCA尽CACCT-3'，YkAPPA-L396A Forward :5'- CAATGCAGATAAG心GATTTGAAAAAc-3' ，YkAPPA-L396A Reverese:5'- GTTTTTCAAATCT^CTTATCTGCATTG-3 '，Y e A P P A - L 3 9 6 V Forward :5'- TGCCGAGAAA^GATATGAAAAACAAC-3 >，Y e AP P A - L 3 9 6 V Reverese : 5 ' - GTTGTTTTTCATATCTACTTTCTCGGCA-3'。所需的突变基因连接到PEASY-T3载体上并经测序证 实。酶切位点用斜^^出。突变核巧酸用下划线标出。
[0037] 实施例2:突变植酸酶与野生酶在细菌中表达与纯化
[0038] 除去信号肤序列的野生酶和突变酶，插入到表达载体祀T-22K + )上并转化到大肠 杆菌化2UDE3)细胞中，经终浓度为2mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-半乳糖巧)诱导表达植 酸酶。粗酶液经Ni-NTA(儀-次氮基Ξ乙酸)柱和DEAE(二乙基氨基乙基)柱进行纯化。经纯化 后的野生酶和突变酶在SDS-PAGE电泳时均表现为一条约46kDa的特异性蛋白条带(数据未 显示）。
[0039] 实施例3:突变植酸酶与野生酶的蛋白酶抗性比较
[0040] 野生酶YkAPPA和化APPA与突变酶YkAPPA-L396V和化APPA-L396V分别用不同浓度 的胃蛋白酶(pH2)和膜蛋白酶(pH7)在37°C下处理化后，分析处理样品中的剩余酶活，研究 蛋白酶对植酸酶活性的影响。蛋白酶和植酸酶比例在1/1000到1/20之间。植酸酶活性使用 硫酸亚铁钢蓝法测定。W1.5mmol/L植酸钢为底物，在37°C下反应30min，用TCA终止反应，再 用显色液（1%四水合钢酸锭，3.2%浓硫酸，7.32%硫酸亚铁)进行显色。对照是在加酶液之 前先加入TCA混匀使酶变性，其它相同。根据显色后的700nm光吸收计算酶活。
[0041 ] 突变酶化APPA-L396V和YeAPPA-L396V的膜蛋白酶抗性分别与野生酶化APPA和 化APPA类似，当膜蛋白酶处理浓度从1/1000上升至1/20时，突变体YKAPPA-L396V的酶活基 本不变，野生酶YkAPPA可保持一半W上酶活(图1)。
[0042] 突变酶YkAPPA-L396V和化APPA-L396V的胃蛋白酶抗性明显高于野生酶（图1)。在 1/1000至1/20的胃蛋白浓度下，突变酶YkAPPA-L396V可保持16.8%和10.8%^上酶活，而 野生酶YkAPPA几乎完全失去活性。当胃蛋白浓度为1/1000和1/500时，突变酶化APPA-L396V 分别保持16.5 %和12.9 % W上酶活，而野生酶YeAPPA则完全失活。因此植酸酶化APPA和 化APPA的第396位亮氨酸在蛋白酶切割中起重要作用。
[0043] 实施例4:突变植酸酶与野生酶的耐酸性比较
[0044] 野生酶和突变酶在pH 1-4下37°C处理化，研究酶的酸稳定性。突变酶化APPA- L396V与化APPA-L396V在抑1.5-3下的稳定性明显高于野生酶（图2)。在抑1.5-3下，突变酶 YkAPPA-L396V保持81.9% W上的酶活，而野生酶YkAPPA只保持68.5%的酶活性。在抑1.5-3 下，突变酶化APPA-L162V可保持7.4%的酶活，而野生酶化APPA则完全失去活性。
[0045] 实施例5:突变植酸酶与野生酶的酶学性质比较
[0046] 野生酶和突变酶在不同抑(1-12)和不同溫度(3〇-80°(：)下反应3〇111111，确定最适抑 和最适溫度。酶在抑1-9下37 °C处理化，研究其pH稳定性。在60°C下将酶液分别处理0，2，5， 10，20，30，60min后进行测定热稳定性。所用的缓冲液为:0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH l-3;0.1mol/L醋酸钢-醋酸缓冲液，pH 3-6;0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 6-8;0.1mol/L 甘氨酸-氨氧化钢缓冲液，pH 8-12。
[0047] 突变酶YkAPPA-L396V与野生酶的酶学性质比较如表1。突变酶YkAPPA-L396V的最 适抑和最适溫度相似，分别是抑4.5和55°C。突变酶化APPA-L396V在60°C下30min的热稳定 性与野生酶相似，可保持16.4%的酶活。突变酶YkAPPA-L396V在pH 2-10下处理化后，保持 与野生酶相似的酶活。突变酶化APPA-L396V在pH 1下处理化具有较好的耐酸性，可保持 80.3 %的酶活，而野生酶YkAPPA只保持63.7 %的酶活。
[004引突变酶化APPA-L396V与野生酶的酶学性质比较如表1。突变酶化APPA-L396V的最 适pH和最适溫度与野生酶相似，分别是pH 5和45°C。突变酶YeAPPA-L396V在60°C下处理 30min的热稳定性与野生酶相似。突变酶化APPA-L396V在抑3-9下处理化与野生酶保持相似 的稳定性;在pH 2下处理化较野生酶具有更好的耐酸性，可保持40.2 %的酶活，而野生酶 化APPA只保持18.4 %的酶活。
[0049]表1改造前后的植酸酶的酶学性质比较
[(Κ)加 ]
【主权项】
1. 植酸酶YkAPPA突变体YkAPPA-L396V，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.l 所示的植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。2. 植酸酶YeAPPA突变体YeAPPA-L396V，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID N0.3 所示的植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。3. 植酸酶突变体基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的植酸酶Y k A P P A突变体 YkAPPA-L396V或权利要求2所述的植酸酶YeAPPA突变体YeAPPA-L396V。4. 根据权利要求3所述的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如 SEQIDN0.7SSEQIDN0.8K*。5. 包含权利要求3所述的植酸酶突变体基因的重组载体。6. 包含权利要求3所述的植酸酶突变体基因的重组菌株。7. -种制备稳定性改良的植酸酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组的植酸酶基因表达；以及 3) 回收并纯化所表达的植酸酶突变体YkAPPA-L396V或植酸酶突变体YeAPPA-L396V。8. 权利要求1所述的植酸酶突变体YkAPPA-L396V的应用。9. 权利要求2所述的植酸酶突变体YeAPPA-L396V的应用。
【文档编号】C12N9/16GK106011102SQ201610527405
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】杨培龙, 牛灿芳, 姚斌, 闻治国, 李秀梅, 王亚茹, 罗会颖, 马锐
【申请人】中国农业科学院饲料研究所