一种红色糖多孢菌工业生产菌株的接合转移方法
【专利摘要】本发明公开了一种红色糖多孢菌工业生产菌株的接合转移方法。该方法选择成熟的红色糖多孢菌孢子经前处理后放于含有Mg2+的TSB液体培养基中，在静止水浴中萌发后经清洗、悬浮处理得受体菌；将供体菌与受体菌孢子混合，在涂布2CMY固体接合转移平板培养基中培养即可生长出接合转移子。该方法操作方便，简单易行，且红色糖多孢菌的接合转移效率可达到2×10-5，可以很好地克服目前红色糖多孢菌工业生产菌株遗传操作困难的局面，为红色糖多孢菌工业菌株的定向遗传改造及基因功能研究提供了便利条件。
【专利说明】
-种红色糖多抱菌工业生产菌株的接合转移方法
技术领域
[0001] 本发明设及微生物领域，具体设及一种红色糖多抱菌工业生产菌株的接合转移方 法。
【背景技术】
[0002] 红色糖多抱菌（Saccharopolyspora e巧thraea)最初是由Me加 ire等人于1952年 从±壤中分离得到的，是一种革兰氏阳性放线菌，属糖多抱菌属，与链霉菌具有较高的生物 同源性。最近几年来，因其用于工业规模的红霉素生产而受到广泛关注和深入研究。2007 年，Markiyan Oliynyk在《化ture》上刊登了红色糖多抱菌模式菌株NRI?L23338的全基因组 测序信息，为红色糖多抱菌基因功能研究创造了条件，但迄今仍有大量的红色糖多抱菌基 因功能未知，尤其是与红霉素合成相关的调控基因方面，知之甚少。
[0003] 为了研究红色糖多抱菌中相关未知功能基因，进一步阐明相关代谢产物的合成机 理，方便于构建基因工程菌株，首先需要建立一个合理高效的遗传操作系统。虽然有报道过 使用原生质体转化的方法巧IJ惠等，《军事医学科学院院刊》2009年第33卷第4期），但其只适 合用于基因失活，对于基因功能研究有一定局限性，而且未见相关遗传转化效率报道。
[0004] 由于红色糖多抱菌与链霉菌高度同源，因此，接合转移方法仍是目前尝试最多的 遗传操作方式。不过，在红色糖多抱菌中，其染色体上缺失或变异了被私1整合酶识别的特 异性位点attBQiequn Wu,A卵1 .Environ.Microbiol. 2011 ,ρ. 7508-7516)，导致使用整合 型的穿梭载体接合效率非常低;再加上其也是一个高度分化的菌属，不同的红色糖多抱菌 的接合转移效率不同，属间的基因水平转移(接合转移)受很多因素影响，例如，受体菌抱子 是否成熟、供体菌的选择、穿梭质粒的选择、抱子萌发条件、供受比、接合转移培养基的选择 和培养溫度等等，运些因素都会影响接合转移的发生或者影响接合转移的效率。目前，红色 糖多抱菌的遗传操作方式没有一种高效统一的方法，尤其对工业生产菌株而言，存在更多 不可预知因素，接合转移效率普遍效率比较低。因此，需要提供一种能够明显提高红色糖多 抱菌工业生产菌株接合转移效率的方法。
[0005] 目前，通过接合转移方法对红色糖多抱菌株建立遗传操作系统的报道很多，其中 相对比较成熟的方法主要有两种，Bierman Μ公开了一种用于红色糖多抱菌的接合转移方 法，采用的是链霉菌属中常规的接合转移条件(Bierman M，et al.Gene,1992,116(1 ):43- 49)，虽然报道该结合转移方法能够成功，但是接合转移效率非常低，不适合用于建立红色 糖多抱菌的遗传操作系统，对于体内研究基因功能有一定局限性;Yun化en公开了一种利 用溫敏型的穿梭质粒进行接合转移的方法(化en,化n,et al.Applied and enviremmen化1 microbiology,2008,74(6) :1820-1828),并将其应用于红色糖多抱菌株的遗传改造，不过 其接合转移效率未见报道，而且仅限于使用溫敏型的穿梭载体，对于其它载体，如整合型、 自杀型穿梭质粒并不适用，在一定程度上限制了该方法的应用。因此，要想进一步的推进红 色糖多抱菌工业菌株进行定向遗传改造及基因功能研究，需要继续优化接合转移的方法， 提高接合转移的转移率。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种红色糖多抱菌工业 生产菌株接合转移的优化方法，该方法简单易行，操作方便，具有较高的红色糖多抱菌接合 转移效率。
[0007] 本发明的技术方案提供了一种红色糖多抱菌工业生产菌株接合转移的优化方法， 包括W下步骤：
[000引1)选择成熟的红色糖多抱菌抱子经前处理后悬浮于含有Mgh的TSB液体培养基中， 在静止水浴中萌发后经清洗、悬浮处理得受体菌；
[0009] 2)将处理好的供体菌与受体菌抱子混合，在涂布2CMY固体接合转移平板培养基中 培养即可生长出接合转移子。
[0010] 根据上述技术方案提供的方法，优化的TSB液体培养基中Mgh的浓度为8~12mM。
[0011] 根据上述技术方案提供的方法，TSB液体培养基的组分为1.5g/100mL膜蛋白腺、 0.5g/100mL大豆蛋白腺、0.5g/100mL氯化钢和0.2g/100mL氯化儀，用水配制而成。
[0012] 根据上述技术方案提供的方法，萌发的溫度为37°C，萌发时间为3~化。
[0013] 根据上述技术方案提供的方法，供体菌和受体菌抱子的细胞数量比为3~7:1。
[0014] 根据上述技术方案提供的方法，步骤2)中的培养是先在33Γ培养22~26h，用糞晚 酬酸和安普霉素覆盖后，再继续于30~34°C下培养7~8天。
[0015] 根据上述技术方案提供的方法，糞晚酬酸和安普霉素的终浓度分别为50yg/mL和 50μ邑/mL。
[0016] 根据上述技术方案提供的方法，供体菌与受体菌细胞数量比为4~7:1。
[0017] 根据上述技术方案提供的方法，前处理是指经LB清洗、在TES Buffer悬浮、50°C下 热激处理。
[0018] 根据上述技术方案提供的方法，供体菌是经过离屯、、LB漂洗和悬浮处理后的菌株。
[0019] 根据上述技术方案提供的方法，接合转移效率可达到2.0Χ10-5。
[0020] 根据上述技术方案提供的方法，供体菌为大肠杆菌S17-1，所述受体菌的成熟抱子 为红色糖多抱菌工业生产菌株抱子。
[0021 ]在本发明的一些水实施方式中，所述的水为蒸馈水。
[0022] 本发明中所述的"2CMY固体接合转移平板培养基"是指组成为"可溶性淀粉lOg，膜 蛋白腺2g，NaCl lg，（NH4)2S〇4 2g，K2册〇4，CaC〇3 2g，无机盐溶液 1ml，琼脂20g，蒸馈水 1000ml，pH7.2;其中无机盐溶液为一升溶液中含有FeS04·7H20 1g，MgCl·6H20 1g， 化S04'7出0 Ig"的培养基。
[0023] 本发明中所述的"LB培养基"是指"Luria-Bertani培养基"，其基本组成为:膜蛋白 腺10g，酵母抽提物5g，化C15g，葡萄糖lg，蒸馈水加至1000ml，pH7.3左右(灭菌后第一次 用时还要调一次）。
[0024] 本发明的有益效果为：
[0025] 本发明根据红色糖多抱菌属的生长发育特点，通过大量摸索实验，首次发现儀离 子在接合转移过程中的抱子萌发阶段发挥着关键作用，有利于接合转移的进行；
[0026] 本发明中2CMY培养基的创新性尝试使用，对红色糖多抱菌属说我接合转移效率有 明显的提局；
[0027] 本发明通过在接合转移过程中抱子萌发阶段的萌发培养基中添加适量儀离子，并 控制抱子萌发的溫度、时间和培养方式等条件，及在平板生长阶段，控制受体菌和供体菌的 比例，选择2CMY培养基和优化后的具有适宜培养溫度的培养基中培养数天后，可明显看见 平板培养基上长有大量的接合子.较大的提高了红色糖多抱菌工业生产菌株的接合转移效 率，其转移率相对于目前较为成熟的两种接合转移方法提高了 25倍，有利于对红色糖多抱 菌工业菌株进行定向遗传改造及基因功能研究。
【具体实施方式】
[0028] 本发明实施例公开了一种红色糖多抱菌工业生产菌株接合转移的优化方法。本领 域技术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方 法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内 对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[00巧]实施例1
[0030] 将大肠杆菌S17-1 (含PSET152穿梭质粒)作为供体菌，过夜培养至ODsgg为0.4~ 0.6，离屯、收集25mL菌体，用等体积无菌的LB漂洗菌体两次，0.1倍体积的LB悬浮备用。取约1 X108个红色糖多抱菌工业生产菌株抱子用LB洗两次，再用50化L TES Buffer悬浮，50°C热 激lOmin，然后加等体积优化后的TSB液体培养基(Mgh的浓度为8mM)，37°C静止水浴萌发化。 用LB清洗两次，最后悬浮在ImL LB中，作为受体菌。根据供体菌和受体菌细胞数量比约3:1， 取适量进行混匀，涂布2CMY固体平板培养基，30°C过夜培养22h后，用糞晚酬酸(终浓度为50 yg/mU和安普霉素(终浓度为50yg/mL)覆盖。7~8天后即可生长出接合转移子。
[0031] 结合转移效率：
[0032] 通过统计出结合平板上长出的阳性结合转移子的数目、受体菌落形成单位数，根 据两者的比值计算出结合转移效率。
[0033] 计算本次接合转移效率为2.1 Xl〇-6。
[0034] 实施例2
[00巧]将大肠杆菌S17-1 (含PSET152穿梭质粒）作为供体菌，过夜培养至0D6日日为0.4~ 0.6，离屯、收集25mL菌体，用等体积无菌的LB漂洗菌体两次，0.1倍体积的LB悬浮备用。取约1 X108个红色糖多抱菌工业生产菌株抱子用LB洗两次，再用50化L TES Buffer悬浮，50°C热 激lOmin，然后加等体积优化后的TSB液体培养基(Mgh的浓度为12mM)，37°C静止水浴分别萌 发化。用LB清洗两次，最后悬浮在ImL LB中，作为受体菌。根据供体菌和受体菌细胞数量比 约7:1，取适量进行混匀，涂布2CMY固体平板培养基，34Γ过夜培养22h后，用糞晚酬酸(终浓 度为50yg/mL)和安普霉素(终浓度为50yg/mL)覆盖。7~8天后即可生长出接合转移子，结合 转移效率的计算方法同实施例1，测得接合转移效率为10.3 X 10-6。
[0036] 实施例3
[0037] 将大肠杆菌S17-1 (含PSET152穿梭质粒)作为供体菌，过夜培养至ODsgg为0.4~ 0.6，离屯、收集25mL菌体，用等体积无菌的LB漂洗菌体两次，0.1倍体积的LB悬浮备用。取约1 X108个红色糖多抱菌工业生产菌株抱子用LB洗两次，再用50化L TES Buffer悬浮，50°C热 激lOmin，然后加等体积优化后的TSB液体培养基(Mg2+的浓度为10mM)，37°C静止水浴培养 祉。用LB清洗两次，最后悬浮在ImL LB中，作为受体菌。根据供体菌和受体菌细胞数量比约 5:1，取适量进行混匀，涂布2CMY固体平板培养基，32 °C过夜培养24h后，用糞晚酬酸(终浓度 为50yg/mL)和安普霉素(终浓度为50yg/mL)覆盖。7~8天后即可生长出接合转移子，结合转 移效率的计算方法同实施例1，测得接合转移效率可达到3.1 X 10-6。
[003引实施例4
[0039] 将大肠杆菌S17-1 (含PSET152穿梭质粒)作为供体菌，过夜培养至ODsgg为0.4~ 0.6，离屯、收集25mL菌体，用等体积无菌的LB漂洗菌体两次，0.1倍体积的LB悬浮备用。取约1 X108个红色糖多抱菌工业生产菌株抱子用LB洗两次，再用50化L TES Buffer悬浮，50°C热 激lOmin，然后加等体积优化后的TSB液体培养基(Mgh的浓度为10mM)，37°C摇床动态培养萌 发化后。用LB清洗两次，最后悬浮在ImL LB中，作为受体菌。根据供体菌和受体菌细胞数量 比分别约为5:1，取适量进行混匀，涂布2CMY固体平板培养基，32 °C过夜培养2加后，用糞晚 酬酸(终浓度为50yg/mL)和安普霉素(终浓度为50yg/mL)覆盖。7~8天后即可生长出接合转 移子，结合转移效率的计算方法同实施例1，测得接合转移效率为9.1 X 10-6。
[0040] 实施例5
[0041 ]将大肠杆菌S17-1 (含PSET152穿梭质粒)作为供体菌，过夜培养至ODsgg为0.4~ 0.6，离屯、收集25mL菌体，用等体积无菌的LB漂洗菌体两次，0.1倍体积的LB悬浮备用。取约1 X108个红色糖多抱菌工业生产菌株抱子用LB洗两次，再用50化L TES Buffer悬浮，50°C热 激lOmin，然后加等体积优化后的TSB液体培养基(Mgh的浓度为10mM)，37°C静止水浴萌发化 后。用LB清洗两次，最后悬浮在ImL LB中，作为受体菌。根据供体菌和受体菌细胞数量比约 为5:1，取适量进行混匀，涂布2CMY固体平板培养基，分别在33°C过夜培养24h后，用糞晚酬 酸(终浓度为50yg/mL)和安普霉素(终浓度为50yg/mL)覆盖。7~8天后即可生长出接合转移 子，结合转移效率的计算方法同实施例1，测得接合转移的转移效率为20.3Χ10-6。
【主权项】
1. 一种红色糖多孢菌工业生产菌株的接合转移方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 选择成熟的红色糖多孢菌孢子经前处理后悬浮于含有Mg2+的TSB液体培养基中，在静 止水浴中萌发后经清洗、悬浮处理得受体菌； 2) 将供体菌与受体菌孢子混合，在涂布2CMY固体接合转移平板培养基中培养即可生长 出接合转移子。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述优化的TSB液体培养基中Mg2+的浓度为8 ~12mM〇3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述优化的TSB液体培养基的组分为1.5g/ lOOmL胰蛋白胨、0 · 5g/100mL大豆蛋白胨、0 · 5g/100mL氯化钠和0 · 2g/100mL氯化镁，用水配 制而成。4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述萌发的温度为37°C，萌发时间为3~6h。5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中供体菌和受体菌孢子的细胞数量比 为3~7:1〇6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中的培养是先在30~34°C培养22~ 26h，用萘啶酮酸和安普霉素覆盖后，再继续于30-34°C下培养7~8天。7. 根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述萘啶酮酸和安普霉素的终浓度分别为50 lig/mL 矛口 50iig/mL。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述前处理包括用LB清洗、在TES Buffer中 悬浮处理和50 °C下热激处理。9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述供体菌是经过离心、LB漂洗和悬浮处理 后的菌株。10. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述供体菌为大肠杆菌S17-1，所述受体菌 的成熟孢子为红色糖多孢菌工业生产菌株孢子。
【文档编号】C12N15/03GK106011128SQ201610158588
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年3月17日
【发明人】赵裕栋, 鲍素敏
【申请人】广东东阳光药业有限公司