一种特异识别psa蛋白的寡核苷酸配基p7-26的序列和应用
【专利摘要】本发明公开了属于分子生物医学技术领域的一种特异识别PSA蛋白的寡核苷酸配基P7-26的序列和应用。本发明设计P7-26特异性的序列，采用5’端或3’端修饰、标记(如同位素、生物素或者地高辛等)的方法检测P7-26能够特异识别PSA蛋白。P7-26作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于前列腺癌的辅助诊断、靶向治疗或者进行前列腺癌疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于临床前列腺癌标本的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗，具有广泛临床应用和基础应用前景。
【专利说明】-种特异识别PSA蛋白的真核昔酸配基P7-26的序列和应 用 发明领域：
[0001] 本发明设及特异识别PSA蛋白的寡核巧酸配基P7-26的序列和修饰，W及修饰后 的P7-26在识别PSA蛋白方面的应用。本发明设及P7-26在生物医药方面的应用。P7-26 作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于前列腺癌的辅助诊断或者进行前列腺癌疾病发 生、发展、进程相关的基础研究等。P7-26作为载体递送药物祀向前列腺癌细胞方面的应用。
【背景技术】： 阳00引指数富集的配基系统进化技术，简称沈LEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛 选技术。应用大容量的随机寡核巧酸文库（ssDNA文库和RNA文库），结合PCR体外扩增 技术，W指数级富集与祀分子特异结合的寡核巧酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得 的寡核巧酸配基（aptamer)基于空间结构与祀分子呈高特异性和高亲和力的结合。由于 aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为"人工替代抗体"，在 基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合祀 SELEX技术，使得对未知祀分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得 特异识别两组复合祀子中差异存在分子的aptamer,并能利用该配基反过来对差异祀分子 进行研究，运就为开发新型分子探针W及鉴定生物标志物，尤其是肿瘤标志物分子开辟了 新的途径。
[0003] 前列腺癌是威胁男性健康的重要恶性肿瘤之一，严重威胁男性的健康。在美国，前 列腺癌的发病率排在男性恶性肿瘤的第1位，病死率是11 %，仅次于肺癌，列在肿瘤性死亡 的第2位，在全球范围，前列腺癌的发病率排在男性恶性肿瘤的第3位。由于前列腺癌严重 威胁男性的健康，早发现、早诊断、早治疗是人们重点关注的问题。临床上需要用一些诊断 试验来预测前列腺癌的发生，提高对前列腺癌的早期诊断W及避免不必要的病理活组织检 查。血清中前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen,PSA)的检测为前列腺癌的诊 断提供了很好的平台。近年来血清中不同存在形式的PSA已成为前列腺癌的首选标志物， 被广泛应用于临床检测。
[0004] 本发明是通过SELEX技术获得了一个寡核巧酸配基P7-26。经鉴定，P7-26能够特 异识别PSA蛋白，而不结合其他蛋白，对照核酸序列与上述蛋白均无结合，目前尚未见能特 异结合PSA蛋白的核酸适配体的相关研究报道。
【发明内容】
： 阳0化]本发明目的在于提出特异识别PSA蛋白的寡核巧酸配基P7-26的序列及其应用领 域，包括P7-26作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于前列腺癌的辅助诊断或者进行 前列腺癌疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。P7-26作为载体递送药物祀向前列腺癌 细胞方面的应用。
[0006] 本发明通过W下技术方案实现：
[0007] 首先由Invitrogen公司合成P7-26序列，并在5'端或3'端修饰、标记（如生物 素或者同位素），然后进行应用研究：EMSA或化ISA方法检测P7-26识别PSA蛋白。 阳00引本发明优点：
[0009] 1)与蛋白类的抗体相比，单链的寡核巧酸更加稳定；aptamer可直接体外合成、标 记，因此不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成 本低，周期短。
[0010] 2)本发明证实P7-26能够特异识别PSA蛋白。因此，P7-26序列在临床医学与基 础医学的肿瘤研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
【附图说明】： 1] 图1 EMSA实验证实P7-26所结合的祀蛋白为PSA蛋白。
[0012] 图2 ELISA实验证实P7-26所结合的祀蛋白为PSA蛋白。
[0013] 图3 P7-26与PSA蛋白结合的平衡解离常数（KD值）的测定
【具体实施方式】：
[0014] 下面通过P7-26对PSA蛋白的识别来进一步描述本发明。
[0015] 本发明通过W下技术方案实现：
[0016] 1.通过同位素 W及生物素标记的P7-26对PSA蛋白的特异识别来进一步描述本发 明。
[0017] 1. 1合成P7-26(序列表中沈Q ID No. 1)、GP30(序列表中沈Q ID No. 2)和，通过 置换反应使P7-26和GP30的5'端标记上丫 -32P-ATP。 阳0化] 丫-32P-P7-26:
[0019] 5' -GCAATGGTACGGTACTTCCTATGGCGATGTGTTGGCTGTGTGTGGGGTGCAAAAGTGCACGCTACT TTG
[0020] CTAA-3'
[0021] γ -32P-GP30 ：
[0022] 5 ^ -GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACT TTG
[0023] CTAA-3'
[0024] 注：Ν代表A、T、G、C任意一种。 阳0巧]1. 2..合成P7-26和GP30序列，均在5'端标记Bio(Invitrogen公司完成）。
[0026] Β?Ο-Ρ7-26 ：
[0027] 5' -GCAATGGTACGGTACTTCCTATGGCGATGTGTTGGCTGTGTGTGGGGTGCAAAAGTGCACGCTACT TTG
[0028] CTAA-3'
[0029] Bi〇-GP30 ：
[0030] 5 ^ -GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACT TTG
[0031] CTAA-3'
[0032] 注：N代表A、T、G、C任意一种。 阳03引 1. 2 EMSA鉴定丫 -32P-ATP标记的P7-26对PSA蛋白的特异识别
[0034] 2. 1将一定浓度的丫 -32p-ATP标记的P7-26和GP30溶解于合适体积的缓冲液中 (IXPBS-lmmolMgClz)，于i〇〇°C变性5min后立即置于冰上充分冷却；
[0035] 2. 2将经过变性处理后的丫 -32p-ATP标记的P7-26和GP30与PSA蛋白在37 °C共 解育4〇min ;
[0036] 2. 3 aptamer与PSA蛋白的共同解育体系加入10XDNA上样缓冲液，6%天然PAGE 胶电泳分离；
[0037] 2.4卸胶，压片，扫描留图。
[0038] 3. ELISA方法鉴定生物素标记的P7-26特异识别PSA蛋白
[0039] 3. 1 -定量的PSA蛋白融于抑9. 7的碳酸盐缓冲液中，按照100 μ 1/孔加入到酶 联条中，4Γ包被蛋白过夜；
[0040] 3. 2弃包被液，每孔加入100μΙ含1% casein蛋白的马来酸封闭液，室溫封闭 60min ;
[0041] 3. 3将不同浓度的Bi0-P7-26和Bi〇-GP30溶解于合适体积的缓冲液中 (IXPBS-lmmolMgClz)，于l〇〇°C变性5min后立即置于冰上充分冷却；
[0042] 3. 4将经过变性处理后的Bi〇-P7-26和Bi〇-GP30文库加入酶联条中，使核酸序列 与包被的蛋白共同解育37°C化；
[00创 3. 5弃去孔内液体，每孔用350 μ 1的洗涂液洗涂，重复洗涂3次，最后一次洗涂后 要把孔内液体完全甩干； W44] 3. 6每孔加入100 μ 1按照1 : 100稀释好的HRP酶，室溫解育40min，弃去孔内液 体，洗板5次，方法同上；
[0045] 3. 7每孔加入100 μ 1 TMB显色底物，37°C避光显色，当有明显颜色变化时，加 10 μ 1终止液，酶联仪读数。
[0046] 4、Ρ7-26与PSA蛋白结合的平衡解离常数（邸值）的测定
[0047] 将不同浓度的丫 -32P-ATP-ssDNA与PSA蛋白在解育缓冲液中混匀，于37°C解育 40min，按体积加入适量10 XDNA上样缓冲液，6%天然PAGE胶电泳分离，卸胶，压片，扫描留 图。通过软件扫描获得阻滞条带的灰度值，采用Graphpad Prism 4软件绘制结合曲线，选 用函数Y = Bmax/化扣讶计算适配体与祀细胞的平衡解离常数KD值 W4引实验结果；
[0049] EMSA方法和化ISA方法均证明P7-26特异结合PSA蛋白
[0050] 由图1可W得到结论：EMSA实验证明P7-26特异识别PSA蛋白，而与对照蛋白蛋 白无结合。
[0051] 由图2可W得到结论：ELISA实验证明P7-26能够特异结合PSA蛋白，而对照序列 与PSA蛋白无结合。
[0052] 由图3可W得到结论：P7-26与PSA蛋白结合的平衡解离常数KD值，约为2. 403± 1.592 μ mol/L
[0053] 总之，P7-26能够特异识别PSA蛋白，具有广泛临床应用价值。
【主权项】
1. 一种特异识别PSA蛋白的寡核苷酸配基P7-26的序列，其特征在于，所述的核苷酸序 列如序列表中SEQ ID No. 1所示。2. 据权利要求1中所述方法，寡核苷酸适配体P7-26可以是体外化学合成的，也可以是 通过PCR或其他分子生物学方法制备的。3. 据权利要求1中所述方法，寡核苷酸适配体P7-26的5'端或3'端可以经同位素、生 物素、地高辛等标记。4. 据权利要求1中所述方法，寡核苷酸适配体P7-26在肿瘤研究领域、临床肿瘤组织切 片标本的鉴别、肿瘤生物导向治疗领域中的应用。
【文档编号】C12N15/115GK106011142SQ201510140664
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年3月26日
【发明人】邵宁生, 李慧, 李少华, 黄皑雪, 丁红梅, 梵春海, 李洁, 董洁, 赵强
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 中国科学院上海应用物理研究所