携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的制作方法

携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，涉及携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。所涉及的严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn核酸疫苗由密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn基因序列和真核表达载体pJW4303组成，其5’端连接tPA信号肽序列。相对于野生型状态下的核酸疫苗，该核酸疫苗在体外表达中可更高效地表达目的蛋白且可将目的蛋白有效地分泌到胞外，在免疫哺乳动物后可有效地刺激免疫系统产生较好的体液免疫应答。
【专利说明】
携带tPA信号化及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其 核酸疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，设及携带巧A信号肤及密码子优化的严重发热伴 血小板减少综合征病毒氨基端糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。
【背景技术】
[0002] 严重发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with th;romboc5ftopenia 3711化加1日￥；[1'113,5。了5\0是我国学者在2010年首次发现并鉴定的一种新型病毒。发热伴血 小板减少综合征(SFTS)是由SFTSV感染引起的一种W发热、血小板减少、白细胞减少为主要 特征的新发传染病，病情严重者可出现神经系统损伤、隧血细胞现象、多器官功能衰竭等， 病死率可达12%-16.3%，甚至有报道为30%。
[0003] SFTSV属于布尼亚病毒科白略病毒属。基因组序列分析显示，其基因组为单股负链 RNA，由大片段L、中片段Μ和小片段SS个片段构成，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)， 氨基端糖蛋白（Gn)和簇基端糖蛋白（Gc)，核蛋白（NP)和非结构蛋白（NSs)。作为一种新发现 的病毒，其基因组编码的各种蛋白尤其是Gn的生物学特性、在疾病发生发展过程中的作用、 W及免疫学特点还知之甚少；同时，从流行病学及临床诊疗过程的需求来看，亟需开发SFTS 相关的预防用疫苗、诊断用抗体及治疗性抗体。
[0004] 核酸疫苗，又称DNA疫苗，其作用机制主要有W下Ξ种:DNA编码的抗原通过体细胞 经MHC I类途径递呈给CD8巧细胞;DNA免疫直接转染专职的抗原递呈细胞(如树突状细胞） 经MHC 1/ Π 类途径将抗原递呈给CTL、CD4巧细胞，并激活B细胞应答;被转染的体细胞被抗 原递呈细胞吞隧后，发生交叉激活，将抗原递呈给T细胞。它具有如下优点：能够充分模拟自 然感染状态，在动物体内合成具有相应空间构象的蛋白，不仅可W激发机体产生体液免疫 反应还能够诱导产生特异性的细胞免疫反应;和重组蛋白免疫相比，核酸疫苗可在DNA水平 对密码子进行优化、修饰，能更好的保证抗原蛋白的纯度，而且成本低廉，稳定性好，同时可 W避免蛋白免疫原半衰期短的缺陷而建立更有效的长期免疫应答;基因免疫通过扩增的基 因序列来编码蛋白抗原，能够避免直接接触危险性较高的病原体。
[0005] 但核酸疫苗也存在着诸多缺点，其中最主要的是核酸疫苗研究和应用的对象主要 为真核生物，而目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而原核生物与真核生物 在密码子使用偏好上存在明显差异，运就导致了核酸疫苗的外源基因在真核细胞内不能高 效地表达，不能有效地刺激机体的免疫系统产生应答。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序 列。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种携带tPA信号肤并进行密码子优化的SFTSV Gn的 核酸疫苗。
[000引本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0009] 一种含有野生型信号肤(WSP)的SFTSV糖蛋白Gn的原始基因序列，序列为SEQ ID N0.1。
[0010] 一种密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn的基因序列，序列为SEQ ID NO.2。
[00川一种SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO. 1的SFTSV Gn的基因序列插 入到真核表达载体化nd虹和BamH I酶切位点之间所得。
[0012] 一种SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO.2的SFTSV Gn基因序列插入 到真核表达载体化e I和BamH I酶切位点之间所得，其5'端连接tPA信号肤序列。
[0013] 所述的真核表达载体为PJW4303。
[0014] 本发明提供的基因修饰的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如 下：
[001引（1)含WSP信号肤的SFTSV Gn原始序列基因片段的获得
[0016] WSFTSV皿29株为参考序列（GenBank:HM745931.1)，选取含WSP信号肤的糖蛋白 Gn编码基因（即优化前的原始序列SEQ ID NO.1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并 装入载体pUC57，即pUC57-WSP-Gn。设计引物WSP-Gn-F: CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG(沈Q ID NO.3) ；WSP-Gn-R：GAGCTCGGATCCC TAT TACTCAATCCTAACATCATC(SEQ ID 側.4)。通过口0? 扩增，分别引入化nd虹和Ba恤I酶切位点。扩增产物用化nd虹和BamH I双酶切，并用DNA凝 胶回收试剂盒（Omega Agarose Gel DNA化rification Kit,美国Omega公司）回收纯化目 的片段，该片段为含有WSP信号肤的原始序列的SFTSV糖蛋白Gn基因序列，两端分别连接有 Hind虹和BamH I酶切位点，W便于核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn的构建。
[0017] (2)密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的设计和合成
[0018] WSFTSV皿29株为参考序列（GenBank:HM745931.1)，首先选取含WSP信号肤基因 的SFTSV Gn基因，全长1605bp，然后运用软件化timumGene?分析其基因序列，找出其密码子 使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物偏好的密码 子替代SFTSV糖蛋白Gn基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的SFTSV Gn 基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体pTC57,即pU巧7-WSP-Gn-opt。 密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。密码子 优化后的SFTSV Gn基因序列为沈Q ID NO.2。
[0019] (3)携带tPA信号肤并密码子优化后的SFTSV Gn基因片段的获得
[0020] 对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pU巧7-WSP-Gn- opt，设计引物巧A-Gn-opt-F:GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG(SEQ ID NO.5)； tPA-Gn-〇pt-R:GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC(WQ ID NO. 6)。通过PCR扩增， 在优化Gn序列的5 '端和3 '端分别引入酶切位点Nhe巧邮amH I，将Gn-opt基因序列连在质 粒PJW4303的巧A信号肤序列下游。扩增产物用Nhe巧邮amH I双酶切，并用DNA凝胶回收试 剂盒(Omega Agarose Gel DNA化rification Kit,美国Omega公司）回收纯化目的片段，该 片段为优化的SFTSV Gn基因序列，两端分别连接有化e巧邮amH I酶切位点，W便于核酸疫 苗 pJW4303-tPA-Gn-〇pt 的构建。
[0021] (4)将步骤（1)得到的基因片段克隆到真核表达载体PJW4303中，得到重组质粒 pJW4303-WSP-Gn。将步骤(3)得到的基因片段克隆到真核表达载体PJW4303中，得到重组质 粒口1￥4303-*?4-611-〇9*。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒， 即为本发明所述的SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗。
[0022] 本发明的有益成果：
[0023] SFTSV是一种新发现的病原体，目前对其基因组编码的各种蛋白尤其是Gn的生物 学特性、在疾病发生发展过程中的作用、其抗体是否合适临床及流行病学运用等都尚不清 楚。此外，由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的SFTSV Gn基因克隆在异 源宿主体内难W有效表达，因此就不能有效的刺激异源宿主的免疫系统，使之产生较好的 免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物中的表达效率，往往需要对核巧酸编码序列 进行优化。由于目前对核巧酸序列的优化尚没有统一的标准或原则。因此针对相同的氨基 酸序列，不同的研究人员完全会设计出不同的核巧酸序列用于目标多肤或蛋白的表达和制 造，相应地表达效率也可能存在差异。发明人WSFTSV皿29株的SFTSV Gn基因为基础，设计 了多条密码子优化后的SFTSV Gn序列，并通过实验筛选出表达效率最高的一条。同时，发明 人将SFTSV Gn原有信号肤(WSP)置换为tPA。与野生型基因相比，经过tPA信号肤引入及密码 子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的SFTSV Gn氨基酸 序列不变。利用体外基因重组将目的蛋白的基因序列克隆入真核表达载体PJW4303构建了 SFTSV 的核酸疫苗 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt。
[0024] 通过体外转染的方法研究Gn的表达，发明人发现核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn、 pJW4303-tPA-Gn-〇pt均能够在真核细胞293T细胞中表达，但pJW4303-tPA-Gn-〇pt的目的蛋 白Gn表达量更高，且仅pJW4303-tPA-Gn-〇pt可W将Gn可W分泌到293T细胞外。由此可见，相 较于野生型状态的pJW4303-WSP-Gn，经过我们的基因改造后的pJW4303-tPA-Gn-〇pt更适于 在哺乳动物细胞中的蛋白表达。
[0025] 通过DNA免疫动物的方法研究Gn的体液免疫原性，发明人发现核酸疫苗PJW4303- WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt均能够诱导机体产生特异性体液免疫应答，但pJW4303-tPA- Gn-opt能更快地诱导机体产生体液免疫应答且产生的特异性抗体滴度更高。由此可见，相 较于野生型状态的pJW4303-WSP-Gn，经过我们的基因改造后的pJW4303-tPA-Gn-〇pt核酸疫 苗具有更好的体液免疫原性。
【附图说明】
[0026] 图1野生型和密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的密码子偏好性比较结果
[0027] 其中，图1A和1B分别为密码子适应指数(CAI)和最优密码子使用频率，两图左侧部 分均为优化后的结果，右侧部分均为未经优化的野生型结果，图1A和1B提示密码子优化后 SFTSV糖蛋白Gn基因序列编码区同义密码子与哺乳动物细胞中密码子最佳使用的符合程度 及所使用的最优密码子比例明显提高；图1C为GC含量的调整，提示经密码子优化后的SFTSV 糖蛋白Gn基因序列中碱基组分未见明显变化，保证了基因合成过程中均匀的退火溫度，保 证了动物体内mRNA的表达水平；图1D为限制性内切酶及顺式作用元件的优化，提示原本会 影响质粒构建的特定基因序列通过密码子优化有效清除；图化为重复序列的优化，提示密 码子优化后的基因序列不能形成茎环结构，从而保证了核糖体与核巧酸序列的有效结合及 mRNA的稳定。
[002引图2目的片段WSP-Gn、tPA-Gn-optPCR扩增后双酶切电泳图
[0029] A图：1，化b DNA ladder;2，WSP-Gn经Hind虹和BamH I双酶切产物；3，100bp DNA ladder;
[0030] B图：l，tPA-Gn-〇pt经Nhe 巧PBamH I双酶切产物；2，100bp DNA ladder;3,化b DM ladder。
[0031] 图3 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的酶切电泳图
[0032] A图：l，化bDNAladder;2，pJW4303-WSP-Gn经Hind虹和BamHI双酶切产物；
[0033] B图：1，化b DM ladder;2，pJW4303-tPA-Gn-〇pt经Mie I和BamH I双酶切产物。
[0034] 图4 pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt转染293T细胞后目的蛋白Gn 表达的Western Blot结果
[OO%] 1，PJW4303转染 293T 细胞上清；2，pJW4303 转染 293T 细胞裂解液；3，pJW4303-WSP- Gn 转染 293T 细胞上清；4，P JW4303-WSP-Gn 转染 293T 细胞裂解液；5，P JW4303-tPA-Gn-〇pt 转 染293T细胞上清；，6，pJW4303-tPA-Gn-〇pt转染293T细胞裂解液。一抗为1:300稀释的 P JW4303-tPA-Gn-〇pt 免疫 BALB/c 小鼠血清。
[0036] 图 5 PJW4303、PJW4303-WSP-Gn、PJW4303-tPA-Gn-〇pt免疫BALB/c小鼠后血清中特 异性IgG应答时间曲线
[0037] PJW4303表示空载体PJW4303免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7 只；
[003引 pJW4303-WSP-Gn表示pJW4303-WSP-Gn免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲 线，共7只；
[0039] PJW4303-巧 A-Gn-opt 表示 pJW4303-tPA-Gn-〇pt 免疫 BALB/c 小鼠后的特异性 IgG 抗 体时间曲线，共7只。
[0040] 图6 PJW4303、PJW4303-WSP-Gn、PJW4303-tPA-Gn-〇pt免疫BALB/c小鼠后第 10周特 异性IgG抗体滴度
[0041 ] PJW4303表示空载体免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG滴度，共7只；
[0042] pJW4303-WSP-Gn 表示 pJW4303-WSP-Gn 免疫 BALB/c小鼠后的特异性 IgG 滴度，共7 只；
[0043] pJW4303-tPA-Gn-〇pt 表示 pJW4303-tPA-Gn-〇pt 免疫 BALB/c 小鼠后的特异性 IgG 滴 度，共7只。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1.密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列的设计与合成
[0045] 用软件化timumGene?分析编码SFTSV糖蛋白Gn的基因序列沈Q ID N0.1，找出其密 码子使用偏好W及与哺乳动物使用偏好不同的位点。对于使用偏好不同的密码子位点，用 哺乳动物细胞偏好的密码子替代，设计筛选出密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列SEQ ID NO.2。上述密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与其原有的氨基酸序列 一致。上述密码子优化的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，装入载体pU巧7， 构建成重组质粒pU巧7-WSP-Gn-opt。经测序证实合成的序列正确。
[0046] 为了明确显示进行密码子优化的位点，现将密码子优化后的核酸序列WSP-Gn-opt 与密码子优化前的核酸序列WSP-Gn进行对比。比较结果如下(*为终止密码子）：




[0化2] 上述密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列与野生型序列比较密码子偏好性发生 了改变。从图1中由软件化timumGene?模拟出的结果可W看出，与野生型基因序列相比，密 码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序 列不变，从而使SFTSV糖蛋白Gn更适于在哺乳动物细胞中的蛋白表达。
[0化3] 实施例2.真核表达载体pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的构建
[0054] (1)目的片段和载体的获得
[005引1 )WSP-Gn片段、质粒PJW4303线性大片段的获得：WpUC57-WSP-Gn为模板，用引物 WSP-Gn-F(CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG)和WSP-Gn-R(GAGCTCGGATCCCTATTAC TCAATCCTAACATCATC)PCR扩增SFTSV糖蛋白Gn基因序列，扩增产物用Hind虹和BamH I双酶 切。并用化nd虹和BamH I双酶切载体质粒PJW4303。酶切反应体系为：10XBuffer Tango? 4 yl，pJW4303或相应PCR产物 10yl，Hind虹 2yl，BamH I 化1，补水至40yl，37°C，2h。
[0056] 2HPA-Gn-〇pt片段、质粒PJW4303线性大片段的获得：WpUC57-WSP-Gn-〇pt为模 板，用引物巧 A-Gn-opt-F(GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG)和巧 A-Gn-opt-R (GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC) PCR扩增密码子优化的 SFTSV糖蛋白 Gn基因序 列，扩增产物用化e巧邮amH I双酶切。并用Nhe I和Ba恤I双酶切载体质粒PJW4303。酶切 反应体系同1)。
[0057] (2)酶切产物纯化:TAE缓冲液制作1 %琼脂糖凝胶，酶切产物进行电泳，100V，化； 称重空1.5παΕρ管，紫外灯下切下含目的DM的凝胶置入化管;切碎胶块，分析天平称胶块的 质量，按l〇〇mg= 10化1进行计算胶块的体积;加入至少1倍等体积的Binding Buffer;把混 合物置于55°C~65°C水浴中溫浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次;转移 700μ1冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个化BindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集 管内，室溫下，10，000 X g离屯、Imin，弃去液体;将柱子重新套回收集管中，加300μ1 Binding Buffer至化Bind DNA柱子中，室溫下，10，000 X g离屯、1分钟，弃去滤出液;将柱子重新套回 收集管中，加入700μ1 SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000Xg离屯、1分 钟，弃滤出液;重复洗涂一次，将空柱子重新套回收集管中，10，000 X g离屯、Imin W甩干柱基 质残余的液体;把柱子装在一个干净的1.5ml离屯、管上，加入30~50μ1洗脱液或灭菌水上柱 子膜上，10，000 X g离屯、1分钟，离屯、管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存 于-2(TC。
[0058] (3)连接反应:用T4DNA连接酶将各目的片段与相应的质粒PJW4303线性大片段连 接，得到91巧4303-胖5?-611、91胖4303-1?4-611-〇91重组表达质粒，即为本发明所提供的5。了5￥ 糖蛋白Gn的核酸疫苗。连接反应体系为：10XT4DNA Ligase Buffer化1，线性化的PJW4303 化1，纯化的Gn相关目的片段化1，T4DNA Ligase化1，混匀，4°C放置16h。连接物转化皿101 感受态细胞。
[0化9]实施例 3.重组质粒 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt 的鉴定
[0060] 3.1 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt 分别转化皿 101 感受态细胞
[0061 ] 1)无菌条件下，将化 1 的pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt分别加入到100μΙ 大肠杆菌皿101感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。
[0062] 2)将含细胞悬浮液的化管置于42°C水浴热击90s。
[0063] 3)热冲击处理后细胞迅速置于冰上2~3min。
[0064] 4)加入不含氨节青霉素的LB培养液80化1，置于恒溫振荡培养箱中，37°C，100rpm， 培养50min。
[00化]5)用移液器取0.2ml pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt转化菌液涂布于含 lOOμg/ml氨节青霉素的琼脂培养板上。
[0066] 6)将培养皿正面朝上并置于室溫20min左右，待涂布的菌液干燥后倒置放于隔水 式恒溫箱中，37 °C培养过夜。
[0067] 3.2筛选阳性克隆
[0068] 按照QIAGEN公司的Mini Plasmid Purification Kit质粒小量提取试剂盒说明书 操作。
[0069] 1)细菌接种:挑取pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt转化平皿上的单菌落接 种于5ml含l(K)μg/ml氨节青霉素的LB培养液中，37°C，180巧m，过夜培养。
[0070] 2)将小摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.5ml离屯、管中，培养试管中剩下 少量菌液保存于4°C。
[0071] 3)菌体收集:离屯、管中菌液，常溫下13，OOOg离屯、Imin，弃上清。
[0072] 4)悬浮菌体:加入25化1 buffer P1充分悬浮细菌沉淀。
[0073] 5)碱变性:加入25化1 buffer P2,溫和颠倒5-6次，形成透明溶液。
[0074] 6)复性:加入40化1 4°C预冷的buffer N3,溫和颠倒5-6次，然后室溫静置2min。
[00巧]7)质粒与蛋白、基因组核酸的分离:室溫13,OOOg，离屯、lOmin。
[0076] 8)质粒的吸附：Spin Column安置于Collection化be上，将步骤7中上清液加入到 Spin Column中，13000g离屯、Imin，弃滤液。
[0077] 9)充分去除蛋白：将500μ1 buffer PB加入Spin Column中，13,000g离屯、30s，弃滤 液。
[007引 10)洗涂：将700μ1 wash buffer加入Spin Column中，13,000g离屯、30s，弃滤液。
[00巧]11)重复洗涂一次:重复步骤10。
[0080] 12)将Spin Column安置在1.5ml化上，在膜中央滴加50μ1的灭菌蒸馈水，室溫静 置Imin。
[0081 ] 13) 13000g离屯、Imin，洗脱液即为含有质粒的溶液。
[0082] 3.3酶切鉴定质粒 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt
[0083] pJW4303-WSP-Gn用Hind虹和BamH I进行双酶切，pJW4303-tPA-Gn-〇pt用Nhe 巧口 BamHI进行双酶切，总反应体系（10μl):10XBuffe;rTango?]_μl，质粒（约0.20μg/μl)ail， 化e I或化nd虹0.5yl，BamH I 0.扣1，用灭菌dd出0补足反应体系至10μ1η37°(：，解育化，加 入化110 X Loading buff er终止酶切反应，lOg/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图 谱见图3。图3显示两种核酸疫苗的克隆均构建正确。将酶切鉴定正确的细菌克隆连续划Ξ 次平板，然后送上海生工生物公司测序，测序正确的单克隆细菌于-80°C保存。
[0084] 实施例4.pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的大量制备（质粒大提试剂盒为 QIAGEN Plasmid Mega Kit(5)，Qiagen公司）
[0085] 1)吸取鉴定正确的细菌保存液10μ1接种于5ml含l(K)μg/ml氨节青霉素的LB培养液 中，37°C，180巧m，过夜生长。
[0086] 2)按1:500将前一天培养菌液接种于500ml含10化g/ml氨节青霉素的LB培养液中， 371：，180巧111，过夜生长。
[0087] 3)第二天将细菌移到250ml离屯、瓶中，4°C、6,000g离屯、15min，弃上清，收集细菌。
[0088] 4)加入50ml缓冲液P1，反复振摇，直至细菌全部重悬于溶液中。
[0089] 5)加入50ml缓冲液P2,溫和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。
[0090] 6)加入50ml缓冲液P3，溫和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳 白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。
[0091] 7)4°C，21，000g离屯、30min，将上清转移至另一离屯、瓶，该条件下再将上清液离屯、 10min〇
[0092] 8)取缓冲液地T 35ml平衡提取柱。
[0093] 9)将(7)中得到的上清加入到提取柱内，自然过柱，弃去滤过液体。
[0094] 10)加入洗涂缓冲液QC 200ml，自然过柱，弃去滤过液体。
[00M] 11)加入洗脱缓冲液QF 35ml，自然过柱，收集滤过液体。
[0096] 12)在收集液体中加入24.5ml异丙醇，4°C，16,000g离屯、30min，弃上清。
[0097] 13)7ml 70%乙醇重悬离屯、管中沉淀，4°C，16,000g离屯、lOmin。
[0098] 14)将有沉淀的离屯、管于超净台内自然惊干，1ml Elution Buffer溶解沉淀。
[0099] 15)紫外分光光度法测定抽提所得溶液中的质粒浓度及260/280比值，分装后冻存 于-7(TC。
[0100] 实施例5.细胞转染
[0101] 293T细胞用含lOOU/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10%胎牛血清的DMEM高糖培养 基在37 °C，5 % C〇2饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L膜酶消化后，W 5.0 X 1〇6 个细胞(6mL)接种于10cm培养皿中，待生长至80 %融合时，依据PEI转染法进行细胞转染。取 阳I 75yl，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt 20yg，加含lOOU/ml青霉素、100μg/ml链 霉素的DMEM高糖培养基至82扣1，充分混匀，室溫解育15min，然后将上述混合液加到培养皿 中并轻轻摇动使混合均匀，同时WpJW4303空质粒转染293T细胞作为阴性对照。她后更换仅 含lOOU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液。继续培养4加后收获细胞裂解物进行 Western blot分析。其中，转染细胞的细胞裂解产物收获步骤为:弃细胞培养上清液，用PBS (浓度1 OmM，抑7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2，500巧m，室溫，离屯、lOmin，弃 上清，加入裂解液（50mM Tris-HCl PH7.6，150mM 化Cl，l%Triton，临用前加入l%100mM PMSF(苯甲基横酷氣）），冰上解育15min，12.000巧m，4°C，离屯、60min，收集上清液，-20°C冻 存。
[0102] 实施例6.Western Blot检测pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的体外表达
[0103] 1)样品的制备:PJW4303、各重组质粒转染293T细胞的裂解物20μ1，加入5x上样缓 冲液化1，100°C，煮沸8min。
[0104] 2)制备分离胶：7.5ml 30% 丙締酷胺溶液，3.7ml Tris/Cl ΡΗ8.8，150μ1 10% SDS，15化1 10 %过硫酸锭，6μ1 TEMED，灌胶，在分离胶上方加入dd出0液封，室溫下聚合 30min〇
[01化]3)制备浓缩胶:倒弃液封水，制备5%的浓缩胶(4.1ml ddH20，lml 30%丙締酷胺 溶液，750μ1 Tris/Cl ΡΗ6.8,60μ1 10%SDS，60yl 10%过硫酸锭，6μ1 TEMED)，灌胶，插入 梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿，将胶转移固定至电泳槽中。
[0106] 4)上样：将上述处理好的蛋白样品加入到加样孔中进行电泳，先20mA化，然后 40mA继续电泳化。
[0107] 5)转膜：甲醇激活PVDF膜，在化is-Glycine缓冲液中平衡，W100V，化将胶上的蛋 白转到PVD刊莫上。
[010引6)封闭：转好的膜用5%脱脂奶粉封闭，37°Cah。
[0109] 7)用PBST洗膜两次。
[0110] 8)解育一抗:将膜浸在1:300稀释的BALB/c小鼠免疫血清中，4°C，解育过夜。
[0111] 9)洗膜:弃血清，PBST洗膜6次，每次1 Omin。
[0112] 10)解育二抗:弃洗涂液，加入HPR标记的羊抗鼠 IgG(1:10.000稀释），37 °C，化。
[0113] 11)弃二抗，用PBST洗膜6次，每次lOmin。
[0114] 12化化化学发光底物均匀加到膜上，Bio-Rad成像系统显影拍照。
[0115] 结果见图4，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt转染293T细胞后均可在细胞裂 解液中检出目的蛋白的表达，但PJW4303-tPA-Gn-〇pt组目的蛋白表达量更高且可同时分泌 到胞外，目的蛋白Gn表观分子量约为61kDa。阴性对照空载体PJW4303转染293T细胞的上清 及裂解液均没有检出目的蛋白的存在。
[0116] 实施例7 .pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt核酸疫苗体液免疫原性的研究
[0117] 在核酸疫苗构建和表达成功后，对BALB/c小鼠进行免疫，通过化ISA方法检测其免 疫原性。7. lpJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt免疫BALB/c小鼠，实验设计如下：
[011 引 表 1 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-0pt 免疫 BALB/c 小鼠
[0119]
[0120] 如表 1，用pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-巧A-Gn-opt各免疫一组BALB/c小 鼠。肌肉注射l(K)yg相应质粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内 电转染(针头插入深度至少2mm，电转染参数:电压50V，脉冲次数正反各3次，波宽30ms，频率 30化），W小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行DNA免疫，于每次免 疫前、第6周、末次免疫后两周采血。
[0121] 7.沈LISA检测血清中Gn特异性IgG
[0122] 用化ISA方法检测血清中特异的IgG抗体反应，评价pJW4303-WSP-Gn、pJW4303- tPA-Gn-opt核酸疫苗在BALB/c小鼠模型中诱导产生体液免疫的能力。
[0123] 1)抗原包被：pJW4303-tPA-Gn-〇pt转染上清作为抗原包被化ISA板（使用PBS PH7.2-7.4作为稀释液），每孔100μ1，4Γ，过夜。
[0124] 2)洗板:弃掉包被液，用0.05 % PBST(含0.05 % Tween-20的PBS)洗板5次。
[012引 3)封闭：1%BSA和4%怖ey(含0.05%1'"6611-20、1%854和4%怖巧的？85)，每孔200 μ1，37Γ，封闭化。
[0126] 4)洗板:弃掉封闭液，用0.05 % PBST洗板5次。
[0127] 5)加入待测样本:加入待检测血清，即一抗，起始稀释度为1:200,再进行1:2倍比 稀释。每孔加入1〇〇μ1，37Γ，解育化(一抗稀释液为含4%wh巧和0.5%Tween-20的PBS)。
[012引 6)洗板:弃一抗，用PBST洗板5次。
[0129] 7)加生物素标记的二抗:生物素标记的羊抗鼠 IgG( 1: 5，000稀释），每孔加入10化 1，37°C，解育化(抗体稀释液为含4%wh巧和0.5%Tween-20的PBS)。
[0130] 8)洗板:弃生物素标记的羊抗鼠 IgG，PBST洗板5次。
[0131] 9)加 HRP-标记的链亲和素:HRP标记（1:4，000稀释），每孔加入100μΙ，37°C，解育化 (稀释液为含4%wh巧和0.5%Tween-20的PBS)。
[0132] 10)弃HRP标记的链亲和素，PBST洗板5次。
[0133] 11 )TMB显色:TMB溶液配方，TMB片剂1片，0.1M憐酸盐/巧樣酸盐缓冲液5ml，双蒸水 5ml，30 %双氧水化1。每孔加入10化1，室溫下静置3.5min，每孔加入50μ1 1M的出S化终止显 色。
[0134] 12)酶标仪设定630nm为参考波长，450nm为测试波长，测定并记录各孔Α450值，计 算复孔平均值，W免疫前血清吸光度值的2.1倍作为cut-off值，而且免疫后血清吸光度值 小于0.05的孔也去除。
[0135] BALB/c小鼠血清Gn特异性IgG应答时间曲线如图5所示。pJW4303-WSP-Gn、 pJW4303-tPA-Gn-〇pt核酸疫苗免疫组小鼠血清中均可检测到Gn特异性IgG,且随着免疫次 数的增加，免疫应答强度逐步提高。PJW4303空载体组小鼠的血清中未能检测到Gn特异性 IgG应答。
[0136] BALB/c小鼠血清Gn特异性IgG抗体最高滴度如图6所示。图中显示第四次免疫后2 周的BALB/c血清中，P JW4303-WSP-Gn、P JW4303-tPA-Gn-〇pt免疫组均有较高滴度的特异性 抗体，而PJW4303空载体免疫组则未检测到抗体应答。pJW4303-tPA-Gn-〇pt组与PJW4303- WSP-Gn组、PJW4303组比较具有统计学差异。<0.05)冲1胖4303-胖5?-611组和91胖4303组比较 具有统计学差异(P<〇. 05)。
[0137] 本发明未设及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加 W实现。
[0138] 实施例中所设及的试剂信息如下表： p'fL·酶 中国TIANGEN公司 T4 DNA连接酶 加拿乂 Fcmentas公司 TMB片剂 Sigma公司
[0139] 化b ladder DNA marker (CW0641) 北京康淆世纪生物科技有限公司 ! OObp ladder DNA marker GcncDirc 限制性内切酶执》?洒'I、.紐始皿、I Fermentas公司 DNA凝胶回收试剂盒 美国Omega公司 DMEM島糖培养基 Hyclone公司 胎牛血清 Hyctone公司 质粒小量提取试剂盒 巧agen公司
[0140] 质粒大量提取试剂盒 Qiagen公司 PEI InviliOgcn 公-i I'j Η民P +小 idir;J 丫:-化 ?!;? IgG So山hcmBioicch 公 wj
【主权项】
1. 一种密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV)糖蛋白Gn基因序列， 序列为SEQ ID N0.2。2. -种SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗，其特征在于由序列为SEQ ID NO.2的SFTSV糖蛋白Gn 基因序列，插入到真核表达载体Nhel和BamHI酶切位点之间所得，其5 '端连接tPA信号肽序 列。3. 根据权利要求2所述的SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为 pJW4303〇
【文档编号】A61P31/14GK106011155SQ201610324251
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】李军, 金柯, 刘源, 徐菱遥, 韩亚萍, 刘艳, 周宜庆
【申请人】李军, 金柯, 刘源, 徐菱遥, 韩亚萍, 刘艳, 周宜庆