一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法
【专利摘要】本发明公开了一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：A、诱导紫萍愈伤组织；B、目的基因与T载体连接；C、目的基因与植物表达载体连接；D、植物表达载体在根癌农杆菌LBA4404中的转化；E、制备侵染菌液；F、愈伤组织与农杆菌共培养；G、再生及选择培养：叶状体GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，且叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。通过将目的基因插入植物表达载体后再转入根癌农杆菌LBA4404用于侵染愈伤组织，最后控制抗生素的浓度筛选出阳性植株，得到转基因紫萍，建立的转化体系经过紫萍无性繁殖仍可持续稳定遗传，具有生物安全性和开发应用价值。
【专利说明】
一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的紫萍(Spirodela polyrhiza)稳定转化体系建立的方法。紫萍稳定转化体系的建立为开发利用紫萍作为生物反应器生产蛋白(药用疫苗和抗体)，酶、糖类和脂类等次生代谢产物，以及通过过表达或抑制特定基因增强对高低温、盐、重金属、氮磷等耐受性用于生物修复奠定了基础。
【背景技术】
[0002]自1983年世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用，其巨大的生产潜力为人类带来很大的经济效益和社会效益。植物转基因技术主要应用于农业、生物和医学等领域，进行植物品种的改良、新品种的培育以及作为生物反应器等。植物转基因技术可尚效、快速提尚粮食作物、疏采、林木树种和花卉草种的产量、品质和抗耐性，培育高产、高抗、多抗(如抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、抗盐碱等)、优质的新品种。转基因技术已在棉花、大豆、玉米等主要农作物上得到了很好的应用，对全球农业产生了深刻的影响。转基因技术可以把植物作为“生物反应器”，进行药物蛋白(疫苗、抗体等)、工业用酶、糖类、脂类等一些有益次生代谢产物的生产，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特点(朱彦涛等，2008)。此外，通过植物转化技术过表达或克隆超富集植物中的特定基因，获得高效去除环境中污染物的转基因植物，对于污染场地的植物修复应用具有非常大的潜力。
[0003]浮萍(Duckweed)是一种世界性范围分布的水生单子叶植物，包括Spi rode I a ,Landoltia，Lemna，Wolffiella 和 Wolffia 5 个属，共 37 个种(Landolt，1998; Les et al.,2002； Appenroth et al.,2013)。浮萍个体微小(0.5-15mm)，结构简单，仅由叶状体和不定根(仅限 Spirodela，Landoltia 和 Lemna)组成，无性繁殖速度快(Ziegler et al.,2015;Hi 11-man and Cul ley，1978)，富含淀粉(Reid and Bieleski , 1970； Landolt andKandeler，1987)，并能大量富集水体中的污染物(Bergmann et al.,2002；Reinhold andSaunders ,2006)。紫萍(Spirodela polyrhiza)属浮萍科的一种，广泛分布于池沼、稻田、水塘及静水的河面，中国只此一种。它具有繁殖快，生物量大，淀粉和蛋白含量高，快速富集水体氨氮，重金属等(杨凤岩等，2011)优点。此外，紫萍(Spirodela polyrhiza)全基因组测序结果表明其基因组很小，仅为 158Mbp，低于Landoltia(372-427Mbp)，Wolff iella(623_973Mbp)，Lemna(323-760Mbp)and Wolffia(357-1881Mbp)(Wang et al.,2011；Bog etal.，2015)，紫萍的这些优势使其快速吸引人们的注意力，并广泛应用于生物反应器、水体环境修复，以及开发生物能源。
[0004]基因转化是利用重组DNA的方法直接将目的基因导入到植物细胞，并在其中进行表达，人为地有目的地组合基因，改变生物的遗传性能，建立一种稳定的基因转化体系是开发利用转基因植物的基础。基因转化的方法，包括农杆菌介导法，DNA直接导入法，花粉管通道法，植物病毒介导法等。目前，大多数转基因是通过农杆菌介导法和基因枪法这两种方法获得的，其中农杆菌介导法具有单一位点整合，遗传稳定性好，以及外源基因拷贝数低的优势，在植物转化体系中占有优势。目前，浮萍科的许多物种都已建立其基因转化体系，如Spirodela punctata(EdeIman et al.，1998)，Spirodela oligorrhiza(Rival et al.,2008；Vunsh et al.，2007)，Lemna gibba(Stomp and Rajbhandari，2000)，Lemna minor(Gasdaska et al.,2003) ,and Wolffia arrhiza(Khvatkov et al.,2015)，而有关紫萍(Spirodela polyrhiza)基因转化体系的建立尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种农杆菌介导的紫萍(Spirodelapolyrhiza)稳定转化体系建立的方法。通过将目的基因插入植物表达载体，再转化到根癌农杆菌LBA4404(购自上海迈其生物科技有限公司，以下相同)，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物愈伤组织细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，在选择培养过程中通过调节激素的比例诱导再生植株，同时控制抗生素的浓度筛选阳性植株，得到转基因紫萍，且建立的转化体系经过紫萍无性繁殖仍可持续稳定遗传。此方法操作简单，结果稳定可靠，具有生物安全性和开发应用价值。
[0006]为了实现上述的目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]—种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是:
[0008]1、诱导紫萍愈伤组织:
[0009]野生紫萍(采自武汉东湖)采用0.1%(w/v)氯化汞灭菌2-3分钟后，培养于1/2MS固体培养基中:1% (w/v，以下相同)鹿糖、0.6% (w/v，以下相同)琼脂、0.5mg/L TDZ、pH 5.8，待长出芽后，转移至1/2MS液体培养基中:1%蔗糖、pH5.8，用作长期保存。取20-30片叶状体置于愈伤诱导培养基:1/2MS培养基、1%蔗糖、0.6%琼脂、5mg/L 2，4_D、2mg/L 6-BA, pH5.8，直至愈伤组织长出，期间每两周更换一次培养基，培养出的绿色松软的愈伤组织用于后续基因转化。
[0010]2、目的基因与T载体连接:
[0011 ]通过PCR扩增目的基因用于后续试验，20yL的PCR扩增体系(以下相同)包括:模板IyL (约 50ng)，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，Easy Taq酶0.2单位，10 X buffer (含MgCl2 )2yL，补水至20yL。根据具体情况设置PCR反应条件及循环参数。PCR产物检测方法(以下相同)为:取5-10yLPCR产物与l-2yL 6 X Loadin g Buffer混勾后，经1.2% (w/v，以下相同)琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10-15min后，凝胶成像仪观察拍照。检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增获得目的基因DNA。
[0012]购买Promega公司pGEM-Teasy载体连接试剂盒连接目的基因与pGEM-Teasyvector，步骤如下:
[0013](I)1yL PCR 产物与 pGEM-Teasy vector 连接体系，包括:2 X rapid ligat1nbuffer 5yL,pGEM-Teasy vector(50mg/yL)lyL,PCR product 3yL，T4 DNA ligase lyL，反应体系于4°C过夜；
[0014](2)将(I)步骤过夜混合物转化到大肠杆菌(DH5a)(购自上海迈其生物科技有限公司，以下相同)，采用电转化(以下相同)的方法，具体步骤如下:
[0015]①每50yL大肠杆菌(DH5a)电转感受态细胞中加入2yL(I)步骤过夜混合物，置于冰上1min，电极杯也提前置于冰上预冷18_22min左右；
[0016]②打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；
[0017]③将电极杯推入电转化仪(型号BTX细胞转基因仪ECM399，以下相同)，按一下pul se键，听到蜂鸣声后立即向电极杯中加入800yL SOC液体培养基(以下相同):2 % (W/V)胰蛋白胨，0.5 % (W/V)酵母提取物，0.05 WVNaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl2，20mM葡萄糖，pH 7.0，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37°C，180rpm复苏一小时；
[0018]④准备8yLIPTG( 10011^/1111^)和4(^1^(飞&1(2011^/1]11^)涂布于添加10011^/1^氨节青霉素Ampici 11 in的固体LB培养基(以下相同):10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl，6g/L琼脂，pH 7.0。将(3)步骤转化产物于12000印111离心11^11后去上清涂板，37°(:过夜培养；
[0019]⑤挑取3-5个白斑单克隆置于5mL添加100mg/L氨苄青霉素Ampicillin的液体LB(以下相同):10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl ,pH 7.0，摇菌过夜；
[0020]⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒后于-20°C保存，并进行PCR检测和测序分析。PCR检测显示成功将带有目的基因的pGEM-Teasy vector载体转入大肠杆菌(DH5a)中，测序分析显示目的基因未发生碱基突变。
[0021 ] 3、目的基因与植物表达载体连接:
[0022](I)首先根据具体情况选择需要的植物表达载体种类，并采用电转化的方法将植物表达载体转化至大肠杆菌(DH5a)进行扩增，具体步骤如下:
[0023]①每50yL大肠杆菌(DH5a)电转感受态细胞中加入2yL植物表达载体，置于冰上9_Ilmin，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min左右；
[0024]②打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；
[0025]③将电极杯推入电转化仪(型号BTX细胞转基因仪ECM399，以下相同)，按一下pulse键，听到蜂鸣声后立即向电极杯中加入800yL SOC液体培养基:，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37°C，180rpm复苏一小时；
[0026]④将上步转化产物于添加了50mg/L卡那霉素Kanamyc in的固体LB培养基涂板后37°C过夜培养；
[0027]⑤挑取3-5个单克隆置于5mL液体LB(添加50mg/L卡那霉素Kanamycin)摇菌；
[0028]⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于-20°C保存。
[0029](2)目的基因与植物表达载体连接:
[0030]目的基因连接至植物表达载体的步骤与连接至T载体相同，具体步骤如下:
[0031]①根据选择的植物表达载体设计引物，在I步骤获得的目的基因两端加上酶切位点，PCR及电泳鉴定后产物切胶回收纯化(B1Flux公司切胶回收试剂盒)，PCR检测显示已成功在基因片段两端加上酶切位点；
[0032]②使用相同的内切酶同时双酶切①步骤的目的基因和植物表达载体，反应体系为:IyLDNA或植物表达载体，IyL内切酶A，IyL内切酶A buffer，IyL内切酶B，IyL内切酶Bbuffer，补水至20yL，37 °C培养至少4h ；
[0033]③将双酶切目的基因产物与双酶切植物表达载体连接，1yL反应体系为:2Xrapid ligat1n buffer 5yL，酶切植物表达载体lyL，酶切目的基因3yL，T4 DNA ligase IyL，反应体系于4°C过夜；
[0034]④将③步骤过夜混合物电转化的方法转入大肠杆菌(DH5a)后涂布于添加50mg/L卡那霉素Kanamy c in的固体LB培养基，37 °C过夜；
[0035]⑤挑3-5个单克隆置于5mL液体LB(添加50mg/L卡那霉素Kanamycin)摇菌过夜；
[0036]⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于-20°C保存。PCR检测显示成功将带有目的基因与植物表达载体连接并转入大肠杆菌(DH5a)中。
[0037]4、植物表达载体在根癌农杆菌(LBA4404)中的转化。
[0038]将3步骤中获得的植物表达载体再转化到根癌农杆菌(LBA4404)中用于侵染植物，步骤如下:
[0039 ] (I)每50yL农杆菌(LBA4404)电转感受态细胞中加入2yL步骤3获得植物载体，置于冰上1min，电极杯也提前置于冰上预冷18 — 22min左右；
[0040] (2)打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；
[0041 ] (3)将电极杯推入电转化仪，按一下pu I s e键，听到蜂鸣声后立即向电极杯中加入800yL SOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于28°C，200rpm复苏一小时；
[0042](4)离心，去上清后取转化产物于固体YEB培养基(添加20ug/mL利福平Rifampici和10ug/mL壮观霉素Spectinomycin): 6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、6g/L琼脂、pH 7.0，涂板；
[0043](5)挑取单克隆置于5mL液体YEB(添加20ug/mL利福平Rifampici和100ug/mL壮观霉素Spectinomycin):6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、pH 7.0，摇菌；
[0044](6)取2mL菌液分装于4个1.5mL灭菌离心管中按1:1储存于40 % v/v甘油，并置于-80°C保存用于后续试验，剩余菌液采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒，PCR检测结果显示带有目的基因的植物表达载体已成功转入农杆菌(LBA4404)中。
[0045]5、制备侵染菌液:
[0046]按照平板划线法，蘸取转化的根癌农杆菌LBA4404菌液在添加了20ug/mL利福平(Rifampici)和100ug/mL壮观霉素(Spectinomycin)的固体YEB培养基上划线，28°C培养2 —3天，另需准备添加20ug/mL利福平的YEB培养基培养电转化LBA4404感受态细胞用作空白对照。第2 — 3天进行继代培养，即蘸取少量根癌农杆菌LBA4404菌体于固体YEB平板上划线培养2 — 3天，刮取适量培养的根癌农杆菌LBA4404菌体至液体YEB悬浮，使用b1drop微量核酸蛋白测定仪测得悬浮菌体600nm吸光度OD值为1.0-1.5时农杆菌侵染力最强，即可用于下一步侵染转化。
[0047]6、愈伤组织与农杆菌共培养:
[0048]向悬浮根癌农杆菌LBA4404中加入10uM乙酰丁香酮(Acetosyringone)混勾备用。选取生长状态良好，分裂旺盛的紫萍愈伤组织，并使用灭菌解剖刀切成直径约3-5mm大小后浸入菌液中28 — 32min。期间将共培养培养基:1/2MS培养基、I %蔗糖、0.976g/L脂肪酸甲酯横酸纳MES、5mg/L 2，4_D、2mg/L 6-BA、10uM Acetosyringone、pH 5.2，分装于 100 X 15mm灭菌培养皿(购自b1sharp公司，以下相同)中，每个皿约7_9mL液体，并在培养基中放入彡5层灭菌滤纸，以液体培养基完全浸湿滤纸，且皿中留有约0.5-lmL培养基为宜。最后转移浸泡后的愈伤组织至每个皿中的最上层滤纸，每个皿放6-8团愈伤组织，24 — 26 °C暗培养3 — 5天。
[0049]7、再生及选择培养:
[0050]4一6天后将上一步共培养后的愈伤组织转移到再生培养基:1/2MS培养基、I %蔗糖、0.6 % 琼脂、I.32g/L硫酸铵、5mg/L 2，4-D、2mg/L 6-BA、300mg/L头孢霉素Cef otaximesodium、pH 5.8，持续光照下培养3 — 5天。之后转入选择培养基:1/2MS、I %蔗糖、0.6 %琼脂、I.32g/L硫酸钱、0.5mg/L TDZ、300mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/L G418、pH 5.8,进行转化植株的筛选，选择培养需至少保持一个月，同时要注意观察空白对照组全部死亡，每周更换一次培养基。期间，再生出的芽需分离出来置于芽增殖培养基:1/2MS培养基、1%鹿糖、0.6 % 琼脂、I.32g/L 硫酸钱、0.4mg/L 6_BA、0.1mg/L NAA、150mg/L Cefotaximesodium,66.67mg/L G418、pH 5.8，以保证不同转化系区分开培养。芽增殖过程中可取不同生长阶段的叶状体检测，每个系单独每次各取8-10片叶状体分别用于提取基因组(采用康为世纪植物基因组提取试剂盒)进行PCR阳性检测，以及⑶S染色检测。
[0051 ] GUS染色(以下相同)过程如下:将样品浸泡在⑶S染液(0.5mg/mLX-gluc，10mmoI/L(pH 7.0)磷酸钾缓冲液，0.5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，5mmol/L EDTA)真空抽气Ih，37 °C过夜，之后用40 % v/v乙醇进行脱色，叶片脱色后置于储存液(25 % v/v甘油和5 % v/v乙醇混合液)长期保存，观察时用体式显微镜(OLYMPUS SZX16)和解剖镜拍照。⑶S基因产物为水解酶:葡萄糖苷酸酶。若组织细胞发生了 GUS基因的转化，并表达出GUS基因活性，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。它使具GUS基因活性的部位或位点呈现蓝色，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源目的基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。本发明中GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。
[0052]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0053]本发明成功建立了紫萍稳定转化体系，本发明中的方法可将不受生物体间亲缘关系限制的基因转化到紫萍中，且一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期，这是对传统育种技术的发展和补充，大大地提高植物品种改良效率。本发明可充分利用紫萍(Spirodela polyrhiza)结构简单，生长繁殖快，生物量大，富含淀粉和蛋白质，快速富集水体氨氮，重金属等水体污染物，且基因组很小这些优势，使其经改造后应用于医药、工业、农业、环保、能源、新材料等领域，按照人们的意愿和需求，定向地改造生物的遗传性状，产生出人类需要的基因产物，解决人类日益增长的需求，缓解能源和环境危机。
[0054]本发明可开发紫萍作为生物反应器表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等，且作为表达系统还具有一些无法取代的优点:I)无性繁殖，表达的品系可稳定遗传;2)生产周期短，紫萍大约2-3天繁殖一代，生物产量每36小时翻一番;3)表达的蛋白含量高，约占鲜重的30 %左右;4)便于分离和纯化表达产物，表达的外源蛋白可直接分泌到培养液中，加之培养液成分简单，便于分离纯化;5)表达产物安全，紫萍的整个生活史可以在严格的无菌条件完成，排除了微生物和动物细胞反应器中病原微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病源微生物的程序，大大降低了成本;6)表达产物易于糖基化，增加了效力，减少了副作用；7)成本低于50USD/g，而动物细胞生物反应器的生产成本高达300-10000USD/g。有科学家预测，未来5-10年植物将成为临床治疗或诊断药品的主要生产系统。本发明还可将对重金属以及其它水体污染物相关耐受基因转入紫萍，开发利用紫萍用于水体生态修复，且与传统物理和化学生物修复相比成本低，不产生二次污染境，净化水质同时收获生物质能源等优势。此外，木质素是细胞形态建成的重要物质，而木质素与生物能量/造纸行业密切相关。有关木质素的生物合成途径，近年由于新的基因工程方法的出现和分析手段的提高，又有很多新的发现，提出了一些新的代谢途径，但仍然不完整。紫萍由于维管束退化，木质素含量低，紫萍研究系统为研究木质素生物合成和降解的提供了新的机遇。通过查找和克隆紫萍中木质素代谢途径中蛋白质的同源基因，对这些同源基因上的抑制、突变和过表达分析，致使植物木质素合成受阻，木质素含量下，或将植物的木质素降解为简单的可以直接用于发酵的小分子，大大节约工业成本。
[0055]本发明是国内外首次公开紫萍稳定基因转化的方法，建立的是紫萍稳定转化体系可通过无性繁殖快速产生后代，与水稻，小麦等有性繁殖物种相比，已转化植株的后代不会因有性杂交性状分离出现外源基因的沉默。本方法使用愈伤组织直接进行基因转化，与传统使用叶片或茎段作为侵染材料相比，由于愈伤组织分化程度低，更易于农杆菌侵染，且省略了转化过程中从植株组织-愈伤-再生植株的过程，直接在转化选择开始就通过调节激素比例和浓度有选择的诱导需要的器官和组织，同时筛选阳性植株。本方法转化时间为40天左右，相比小麦至少(77天)和水稻稳定转化体系(至少50天)缩短了转化时间10-30天；
【附图说明】
[0056]图1为一种带有目的基因的植物表达载体转入大肠杆菌(DH5a)中的PCR阳性鉴定图。
[0057]图2为一种带有目的基因的植物表达载体转入根癌农杆菌(LBA4404)中的PCR阳性鉴定图。
[0058]图3为一种转基因植株与野生植株PCR阳性鉴定图。
[0059]M:250bp DNA marker;T:TCS基因条带；D:DR5基因调点；T空:添加TCS基因正反引物的空白对照组;D空:添加DR5基因正反引物的空白对照组。
[0060]图4为一种TCS:⑶S组织化学染色结果示意图。
[0061]图4中黑色部位即为⑶S报告基因染色结果，黑色(代表⑶S染色结果中的蓝色)显示为紫萍生长发育过程细胞分裂素分布图。
[0062]图5为一种TCS::GUS组织化学染色结果示意图。
[0063]图5中黑色部位即为⑶S报告基因染色结果，黑色(代表⑶S染色结果中的蓝色)显不为紫萍生长发育过程生长素分布图。
【具体实施方式】
[0064]实施例1:
[0065]一种农杆菌介导的紫萍基因稳定转化体系建立的方法{生长素报告基因(DR5::GUS)和细胞分裂素报告基因(TCS::GUS)}oDR5::GUS是一个人工合成的标识生长素反应的构建(Ulmasov et al.，1997)。01?5由多个11碱基重复序列组成，其中包括生长素反应元件TGTCTC序列，它与GUS报告基因的融合标识生长素反应;TCS:: GUS也是人工合成的标识细胞分裂素分布的构建，由细胞分裂素B型反应调节位点和最弱化35S启动子(minimalpromoter)构成，它与⑶S报告基因的融合而成(Muller and Sheen，2008)。具体实施步骤如下:
[0066]1、植物表达载体pKGWFS7.0在大肠杆菌(DH5a)中的转化:
[0067]将带有生长素报告基因(DR5::GUS)和细胞分裂素报告基因(TCS::GUS)的植物表达载体PKGWFS7.0(购自上海迈其生物科技有限公司，以下相同)转入大肠杆菌(DH5a)。生长素报告基因(DR5::GUS)采用电转化的方法，具体步骤如下:
[0068](I)每50yL大肠杆菌(DH5a)电转感受态细胞中加入2yL带有生长素报告基因(DR5::⑶S)和细胞分裂素报告基因(TCS::⑶S)的pKGWFS7.0质粒，置于冰上lOmin，电极杯也提前置于冰上预冷20min左右；
[0069](2)打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；
[0070](3)将电极杯推入电转化仪(型号BTX细胞转基因仪ECM 399，以下相同)，按一下pulse键，听到蜂鸣声后立即向电极杯中加入800yL SOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37°C，180rpm复苏一小时；
[0071 ] (4)12000rpm离心lmin，去上清后取转化产物于添加50mg/L卡那霉素Kanamycin的固体LB培养基，涂板后37 °C过夜培养；
[0072](5)挑取单克隆置于5mL液体LB(添加50mg/L卡那霉素Kanamycin)摇菌过夜；
[0073](6)采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于_20°C保存。PCR检测所采用的引物为(以下相同)，TCS-F: 5 ’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGCTTTGCTAGCAAAATCTACA-3 ’ ；TCS-R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTTATATCTCCTTGGATCGAT-3’；DR5-F:5 ’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGAATTCGTCGACGGTATCGCAG-3’；DR5-R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCTCCTTGGATCGATCCCCTG-3 ’。PCR反应为20yL扩增体系(以下相同):模板 UL，dNTPs 0.2mM，引物 0.5mM，Easy Taq酶0.2 单位，10 X buffer (含MgCl2)2yL，补水至20yL。反应条件(以下相同)均为:94°C预变性5min;94°C变形30s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环;72°C延伸SmiruPCR检测方法(以下相同)为:取PCR产物5-10yL与l-2yL 6 X Loading Buffer混勾后，经1.2% (w/v，以下相同)琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10-15min后，凝胶成像仪观察拍照。检测显示成功将带有生长素报告基因(DR5:: GUS)和细胞分裂素报告基因(TCS:: GUS)的载体pKGWFS7.0转入大肠杆菌(DH5a)中。
[0074]2、植物表达载体pKGWFS7.0在根癌农杆菌(LBA4404)中的转化:
[0075]将I步骤中获得的质粒再转化到根癌农杆菌(LBA4404)中用于侵染植物，步骤如下:
[0076](I)每50yL农杆菌(LBA4404)电转感受态细胞中加入2yL步骤I获得质粒，置于冰上9或10或I Imin，电极杯也提前置于冰上预冷20min ；
[0077](2)打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；
[0078](3)将电极杯推入电转化仪，按一下pu I s e键，听到蜂鸣声后立即向电极杯中加入800yL SOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于28°C，200rpm复苏一小时；
[0079](4)离心，去上清后取转化产物于固体YEB培养基(添加20ug/mL利福平Rifampici和 100ug/mL 壮观霉素 Spect inomycin)涂板；
[0080](5)挑取单克隆置于5mL液体YEB(添加20ug/mL利福平Rifampici和100ug/mL壮观霉素 Spectinomycin)摇菌；
[0081 ] (6)取2mL菌液分装于4个1.5mL灭菌离心管中按1:1储存于40 % v/v甘油，并置于-80°C保存用于后续试验，剩余菌液采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒，PCR检测显示成功将带有生长素报告基因(DR5::GUS)和细胞分裂素报告基因(TCS::GUS)的载体pKGWFS7.0转入农杆菌(LBA4404)中。
[0082]3、制备菌液:
[0083]按照平板划线法，蘸取转化根癌农杆菌LBA4404菌液在添加了20ug/mL利福平(Rifampici)和100ug/mL壮观霉素(Spectinomycin)的固体YEB培养基上划线，28°C培养3天，另需准备添加20ug/mL利福平的YEB培养基培养根癌农杆菌LBA4404感受态细胞用作空白对照。第3天进行继代培养，即蘸取少量根癌农杆菌LBA4404菌体于固体YEB平板上划线培养3天，刮取适量培养的根癌农杆菌LBA4404菌体至液体YEB，使用b1drop微量核酸蛋白测定仪测得悬浮菌体600nm吸光度OD值为1.0左右时农杆菌侵染力最强，即可用于下一步侵染转化。
[0084]4、愈伤组织与农杆菌共培养:
[0085]向悬浮根癌农杆菌1^1^4404菌体加入10011]\1乙酰丁香酮(Acetosyringone)混勾备用。选取生长状态良好，分裂旺盛的紫萍愈伤组织，并使用灭菌解剖刀切成直径约3-5mm大小后浸入菌液中30min。期间将共培养培养基:1/2MS培养基、I %蔗糖、0.976g/L脂肪酸甲酯横酸纳MES、5mg/L 2，4_D、2mg/L 6-BA、10uM Acetosyringone、pH 5.2，分装于 100 X 15mm灭菌培养皿(购自b1sharp公司，以下相同)中，每个皿约8mL液体，并培养基中放入6层灭菌滤纸，以液体培养基完全浸湿滤纸，且皿中留有约0.5-lmL培养基为宜。最后转移浸泡后的愈伤组织至每个皿中的最上层滤纸，每个皿放6团愈伤组织，25 0C暗培养5天。通过共培养的过程使根癌农杆菌LBA4404侵染愈伤组织伤口进入细胞，并将目的基因插入到植物基因组中。
[0086]5、再生及选择培养:
[0087]5天后将上一步愈伤组织转移到再生培养基:1/2MS培养基、I %蔗糖、0.6 %琼脂、I.32g/L硫酸钱、5mg/L 2，4_D、2mg/L 6_BA、300mg/L头抱霉素Cefotaxime sodium、pH 5.8,持续光照下培养4天。之后转入选择培养基:1/2MS、I %蔗糖、0.6%琼脂、1.32g/L硫酸铵、0.5mg/L TDZ、300mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/L G418、pH 5.8，进彳丁转化植株的筛选，选择培养需至少保持一个月，同时要注意观察空白对照组全部死亡，每周更换一次培养基。期间，再生出的芽需分离出来置于芽增殖培养基:1/2MS培养基、I %蔗糖、0.6 %琼脂、
I.32g/L硫酸钱、0.4mg/L 6_BA、0.1mg/L NAA、150mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/LG418、pH 5.8，以保证不同转化系区分开培养。
[0088]6、转化紫萍株系的筛选和验证:
[0089]芽增殖过程中可取不同生长阶段的叶状体检测，每个系单独每次各取10片叶状体分别用于提取基因组(采用康为世纪植物基因组提取试剂盒)进行PCR阳性检测，以及GUS染色检测XUS染色过程如下:将样品浸泡在⑶S染液(0.5mg/mLX-gluc，100mmol/L(pH 7.0)磷酸钾缓冲液，0.5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，5mmol/L EDTA，)真空抽气Ih，37°C过夜，之后用40 % v/v乙醇进行脱色，叶片变白后置于储存液(25 % v/v甘油和5 % v/v乙醇混合液)长期保存，观察时用体式显微镜(OLYMPUS SZX16)和解剖镜拍照XUS基因产物为水解酶:β-葡萄糖苷酸酶。若组织细胞发生了GUS基因的转化，并表达出GUS基因活性，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。它使具⑶S基因活性的部位或位点呈现蓝色，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性。因此利用该方法可观察到外源目的基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
[0090]本发明中GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。同时为了检测建立的是否为稳定转化体系，取转化紫萍无性繁殖培养的第1-3代同时进行PCR检测和GUS染色染色检测，检测结果显示第1-3代叶状体染色均出现蓝色，且PCR检测结果为阳性。转化体系隔代稳定遗传为长期开发利用紫萍作为生物反应器生产蛋白(药用疫苗和抗体)，酶、糖类和脂类等次生代谢产物，以及通过过表达或抑制特定基因增强对高低温、盐、重金属、氮磷等耐受性用于生物修复奠定了基础。
[0091]本发明的具体技术效果如下:
[0092]生长素和细胞分裂素是调节植物形态建成的基本激素，二者的相互作用和比例决定了细胞和器官发育的方向。生长素和细胞分裂素参与了植物发育的各个方面，如根和茎的发育和生长、维管束组织的发育，叶绿体分化、植物-病原体的相互作用、花和果实的发育和叶片衰老等。
[0093]维管组织是植物体的“骨架”，不同器官部位之间发生结构和功能上的联系是通过维管组织实现的，联结植物体各部分的维管系统有运输和储藏物质、传递信息、机械支持以及阻碍真菌和其他寄生物侵染等多种功能。水生植物与陆生植物最大的差别即在于维管束组织形成差异，如水生植物紫萍构造简单仅有根和叶的分化，维管束组织极为退化。目前人们对生长素、细胞分裂素在维管组织发生和发育中作用的分子机制的分析绝大多数出自于对陆生模式植物拟南芥的研究，如基因突变结合表现型分析、基因克隆和结构分析、复合突变等，这些方法由于都需要克隆出特定基因并依赖于研究对象突变体库的建立，这并不适合于水生植物，水生植物紫萍的维管束研究还处于空白阶段。采用报告基因研究生长素和细胞分裂素的表达与分布则避免了上述问题，凸显出优势。
[0094]利用本发明建立的紫萍稳定转化体系方法，将生长素报告基因(DR5:: GUS)和细胞分裂素报告基因(TCS::⑶S)转入水生植物紫萍中，通过研究报告基因分布来分析紫萍生长发育过程中生长素和细胞分裂素作用及分布规律，以及在维管束原形成层细胞的分裂和分化中所起的作用，分析生长素、细胞分裂素在维管组织发生和发育中作用的分子机制。同时还可以分析出两者对紫萍形态建成、生长发育和繁殖等方面的一些基本过程的机理，填补紫萍生理学、遗传学、基因组学和分子生物学等方面的理论空白。
【主权项】
1.一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是: A、诱导紫萍愈伤组织: 野生紫萍采用0.1 %w/v氯化汞灭菌2-3分钟后，培养于1/2MS固体培养基中:I %w/v蔗糖、0.6% w/v琼脂、0.5mg/L TDZ、pH 5.8，待长出芽后，转移至I/2MS液体培养基中:I Wv蔗糖、pH5.8，用作长期保存；取20-30片叶状体置于愈伤诱导培养基:1/2MS培养基、I %w/v鹿糖、0.6%w/v琼脂、5mg/L 2，4_D、2mg/L 6_BA、pH 5.8，诱导愈伤组织，期间每两周更换一次培养基，培养出的绿色松软的愈伤组织用于后续基因转化； B、目的基因与T载体连接: 通过PCR扩增目的基因用于后续试验，20yL的PCR扩增体系，包括:模板IyUdNTPs0.2mM，引物0.5mM，Easy Taq酶0.2单位，10 X buffer2yL，补水至20yL，PCR产物检测方法为:取5-10yLPCR产物与l-2yL 6 X Loading Buffer混匀后，经1.2%w/v琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10-15min后，凝胶成像仪观察拍照，检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增目的基因DNA; pGEM-Teasy载体连接试剂盒连接目的基因与pGEM_Teasy vector，步骤是: (1)1yL体系PCR产物与pGEM-Teasy vector连接体系，包括:2 X rapid ligat1nbuffer 5yL,pGEM-Teasy vectorlyL，PCR product 3yL，T4DNA ligase lyL，反应体系于4°C过夜； (2)将(I)步骤过夜混合物转化到大肠杆菌DH5a，采用电转化的方法，步骤是: ①每50yL大肠杆菌DH5a电转感受态细胞中加入2yL(I)步骤过夜混合物混合物，置于冰上lOmin，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min; ②打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯； ③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800yLSOC液体培养基:2 % W/V胰蛋白胨，0.5 % W/V酵母提取物，0.05 % W/V NaCl，2.5mM KCl，1mMMgC12，20mM葡萄糖，pH 7.0，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37°C，180rpm复苏一小时； ④准备8yLIPTG( 100mg/mL)和40yLX_gal(20mg/mL)涂布于添加100mg/L氨节青霉素Ampici 11 in的固体LB培养基:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl，6g/L琼脂，pH7.0，将(3)步骤转化产物于12000印111离心11^11后去上清涂板，37°(:过夜培养； ⑤挑取3-5个白斑单克隆置于5mL添加100mg/L氨节青霉素Ampici11 in的液体LB培养基:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NacI,pH 7.0，摇菌过夜； ⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒后于_20°C保存，并进行PCR检测和测序分析； C、目的基因与植物表达载体连接: (I)选择植物表达载体种类，采用电转化的方法将植物表达载体转化至大肠杆菌DH5a进行扩增，步骤是: ①每50yL大肠杆菌DH5a电转感受态细胞中加入2yL植物表达载体，置于冰上9-1Imin，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min; ②打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯； ③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800yLSOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37°C，180rpm复苏一小时； ④将上步转化产物于添加了5011^凡卡那霉素1^1^1115^;[11的固体LB培养基涂板，37 °C过夜培养； ⑤挑取3-5个单克隆置于5mL液体LB摇菌； ⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于-20°C保存； (2)目的基因与植物表达载体连接: 目的基因连接至植物表达载体的步骤与连接至T载体相同，步骤是: ①根据选择的植物表达载体设计引物，在A步骤获得的目的基因两端加上酶切位点，PCR及电泳鉴定后产物切胶回收纯化，PCR检测； ②使用相同的内切酶同时双酶切①步骤的目的基因和植物表达载体，反应体系为:?μLDNA或植物表达载体，IyL内切酶A，IyL内切酶A buffer，IyL内切酶B，IyL内切酶B buffer,补水至20yL，37°C培养至少4h; ③将双酶切目的基因产物与双酶切植物表达载体连接，1yL反应体系为:2Xrapidligat1n buffer 5yL，酶切植物表达载体lyL，酶切目的基因3yL，T4DNA ligase lyL，反应体系于4°C过夜； ④将③步骤过夜混合物电转化的方法转入大肠杆菌DH5a后涂布于添加50mg/L卡那霉素Kanamy c in的固体LB培养基，37 °C过夜； ⑤挑3-5个单克隆置于5mL液体LB摇菌过夜； ⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于-20°C保存，PCR检测； D、植物表达载体在根癌农杆菌LBA4404中的转化: 将C步骤中获得的植物载体再转化到根癌农杆菌LBA4404中用于侵染植物，步骤是: (1)每50yL农杆菌LBA4404电转感受态细胞中加入2yL步骤C获得植物载体，置于冰上1min，电极杯也提前置于冰上预冷18 — 22min; (2)打开电转移，调节电压为2KV，将(I)步骤混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯； (3)将电极杯推入电转化仪，按一下puIse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800yLSOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于28°C，200rpm复苏一小时； (4)离心，去上清后取转化产物于固体YEB培养基:添加20ug/mL利福平Rifampici和100ug/mL壮观霉素Spectinomycin，6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、6g/L琼脂、pH 7.0，涂板； (5)挑取单克隆置于5mL液体YEB:添加20ug/mL利福平Rifampici和100ug/mL壮观霉素Spectinomycin，6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、pH 7.0，摇菌； (6)取2mL菌液分装于4个1.5mL灭菌离心管中按I: I储存于40% v/v甘油，并置于_80°C保存用于后续试验，剩余菌液采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒，PCR检测； E、制备侵染菌液: 按照平板划线法，蘸取转化的根癌农杆菌LBA4404菌液在添加20ug/mL利福平和10ug/mL壮观霉素的固体YEB培养基上划线，28 °C培养2 — 3天，添加20ug/mL利福平的YEB培养基培养根癌农杆菌LBA4404电转感受态细胞用作空白对照，第2 — 3天进行继代培养，取根癌农杆菌LBA4404于固体YEB平板上划线培养2 — 3天后，刮取培养的根癌农杆菌LBA4404菌体至液体YEB混匀，使用b1drop微量核酸蛋白测定仪测得悬浮菌体600nm吸光度OD值为1.0-1.5时，用于下一步侵染转化； F、愈伤组织与农杆菌共培养: 向悬浮根癌农杆菌LBA4404菌体加入10uM乙酰丁香酮混匀备用，选取分裂的紫萍愈伤组织，使用灭菌解剖刀切成直径3-5mm大小后浸入菌液中28 — 32min，期间将共培养培养基:1/2MS培养基、I % w/v蔗糖、0.976g/L脂肪酸甲酯磺酸钠MES、5mg/L 2，4-D、2mg/L 6-BA、10uM Acetosyringone、pH 5.2，分装于100 X 15mm灭菌培养皿中，每个皿7_9mL液体，培养基中放入多5层灭菌滤纸，以液体培养基浸湿滤纸，且皿中留有0.5-lmL培养基，最后转移浸泡后的愈伤组织至每个皿中的最上层滤纸，每个皿放6-8团愈伤组织，24 — 26 °C暗培养3 — 5天； G、再生及选择培养:4一 6天后将上一步共培养后的愈伤组织转移到再生培养基:1/2MS培养基、I % w/v鹿糖、0.6 % w/V琼脂、I.32g/L硫酸钱、5mg/L 2,4-D、2mg/L 6-BA、300mg/L头孢霉素Cefotaxime sodium,pH 5.8，持续光照下培养3 — 5天，之后转入选择培养基:1/2MS、I %w/v鹿糖、0.6%w/v琼脂、I.32g/L硫酸钱、0.5mg/L TDZ、300mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/L G418、pH 5.8，进行转化植株的筛选，选择培养至少一个月，每周更换一次培养基，期间，再生出的芽需分离出来置于芽增殖培养基:1/2MS培养基、I % w/v蔗糖、0.6 % w/v琼脂、I.32g/L 硫酸钱、0.4mg/L 6_BA、0.1mg/L NAA、150mg/L Cefotaxime sodium、66.67mg/L G418、pH 5.8，以不同转化系区分开培养，芽增殖过程中取不同生长阶段的叶状体检测，每个系单独每次各取8-10片叶状体分别用于提取基因组进行PCR阳性检测，以及GUS染色检测； GUS染色过程如下:将样品浸泡在GUS染液真空抽气lh，37°C过夜，之后用40%v/v乙醇进行脱色，叶片变白后置于储存液保存，⑶S基因产物为水解酶:β-葡萄糖苷酸酶，组织细胞发生了 GUS基因的转化，并表达出GUS基因活性，将X-Gluc水解生成蓝色产物，它使具⑶S基因活性的部位或位点呈现蓝色，根据染色深浅反映出GUS活性，GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。
【文档编号】A01H4/00GK106011169SQ201610518360
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】杨晶晶, 侯宏伟
【申请人】中国科学院水生生物研究所