一种短杆菌发酵生产琥珀酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种短杆菌发酵生产琥珀酸的方法，该包括：活化菌种，发酵培养，获得含延胡索酸还原酶的混合液，构建电化学催化体系，通过电化学检测和高效液相色谱?质谱分析电化学驱动延胡索酸代谢生成琥珀酸的效率。本方法工艺简单，生产周期短，操作简便，与传统催化途径相比，催化效率明显提高。CGMCC No.252020080526
【专利说明】
-种短杆菌发酵生产虎巧酸的方法
技术领域
[0001] 本发明设及酶工程领域，主要设及一种短杆菌发酵生产班巧酸的方法。
【背景技术】
[0002] 班巧酸，C边6化，可产生酸味、呈味，可用于豆酱、酱油、日本酒、调味料等，在食品工 业中用做调味剂、酸味剂、缓冲剂，用于火腿、香肠、水产品、调味液等;班巧酸可W用做防腐 剂，pH值调节剂，助溶剂;还可W用来合成解毒剂、利尿剂、镇静剂、止血药、合成抗生素 W及 维生素 A、维生素 B等;作为离子馨合剂，班巧酸用于在电锻行业防止金属的溶蚀和点蚀;班 巧酸是一种良好的表面活性剂，是去垢剂、肥皂和破乳剂的组分;班巧酸可生产脱毛剂、牙 膏、清洗剂、高效去皱美容醋;还用于润滑剂、添加剂、弹性体中；纺织品加工中可上浆防收 缩，改进染色性，改进己内酷胺黏度与防火性等。
[0003] 班巧酸存在四种主要的市场:最大的市场是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起 泡剂;第二个市场是作为离子藝合剂，用于在电锻行业防止金属的溶蚀和点蚀;第Ξ个市场 是在食品行业中作为酸化剂、K1改良剂、风味物质和抗菌剂;第四个市场是和健康有关的产 品，包括医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产。班巧酸能抑制被动及主动皮肤过敏反应，并 能减少动物血清I巧抗体形成;班巧酸对中眼镜蛇毒的小鼠有明显的保护作用。
[0004] 工业制法较多，主要有W下几种:氧化法、加氨法、丙締酸幾基合成法、电解氧化 法、乙烘法、新兴的发酵法。与传统化学方法相比，微生物发酵法生产班巧酸具有诸多优点： 生产成本具有竞争力；利用可再生的农业资源包括二氧化碳作为原料，避免了对石化原料 的依赖;减少了化学合成工艺对环境的污染。现有的短杆菌发酵产班巧酸法建立在传统的 酶催化体系上，需要辅酶参与W及ATP提供能量，催化效率不高。
【发明内容】
[0005] 本发明针对短杆菌催化延胡索酸生成班巧酸过程中反应要求高，需提供辅酶、电 子和小分子物质等问题，提出一种短杆菌发酵生产班巧酸的方法。
[0006] 本发明的技术方案为:一种短杆菌发酵生产班巧酸的方法，其具体步骤为：
[0007] (1)活化培养:将短杆菌NJWGY2133单菌落接入活化培养基中，控制培养液体积装 液量为15~25%，在转速为160~20化/min,活化培养溫度为30~34°C下活化培养2~3天 后，获得种子液；
[000引（2)发酵培养：W2~10%的体积接种量将步骤（1)种子液接种于发酵培养基中，在 转速为160~2(K)r/min，发酵培养溫度为30~34°C下发酵培养2~3天后，离屯、获菌丝体，超 声破碎，冷冻离屯、，获得含有延胡索酸还原酶的混合液；
[0009] (3)构建电化学催化体系:将步骤(2)获得的混合液固定在玻碳电极表面后的玻碳 电极作为工作电极，销丝电极作为对电极，饱和甘隶电极作为参比电极，电极池液是憐酸盐 缓冲液，构建催化体系;连接电化学工作站，设置参数为:初始电位为-0.2~-IV，高电位为 0.8~IV，低电位为-0.2~-IV，起始扫描极性posi tive，扫描速度为0.1~0.2V/S，扫描段数 为2~3W，采样间隔为0.001~0.002￥，静置时间为2~33，灵敏度为1心^4~1心〇〇64/乂;在电 极池液中加入体积量为电极池液的10~20 %的延胡索酸液，点击开始采样，待采样结束即 酶反应达到饱和状态，得到含班巧酸的电极池液;其中延胡索酸液的浓度为1~2mol/L; [0010] (4)回收:将步骤(3)得到的含班巧酸的电解池液浓缩、萃取、结晶，即得至峨巧酸。
[OOW 优选步骤(1)中活化培养基成分为(g/l):葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~2.0、酵母 膏0.5~2.0、船(：10.1~0.3、]\%504*7出00.1~0.3;口出％6.5~7.0。
[001^ 优选步骤(2)中发酵培养基成分为(g/U:葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~1.5、酵母 膏0.5~1.5、船(：10.10~0.50、]\%504*7出00.1~0.4;口出％6.5~7.0。
[0013] 优选步骤（2)中离屯、获菌丝体的离屯、转速为6000~8000r/min，离屯、时间为15~ 20min;超声破碎的超声功率为150~200W，破碎时间为25~30s，间歇时间为10~15s;冷冻 离屯、的离屯、转速为8000~12000r/min，离屯、时间为25~30min。
[0014] 优选步骤(3)所述的工作电极由W下方法制备得到，其具体步骤为:玻碳电极表面 铺满一层厚度为2~3mm的石墨締聚乙締亚胺混合液，4~5°C惊干后，取步骤(2)获得的发酵 混合液，从玻碳电极表面中屯、点开始，滴加发酵混合液，直到铺满玻碳电极表面积的50~ 60%，控制发酵混合液厚度为2~3mm，4~5°C干燥至表面无液体，制得工作电极。
[0015] 优选上述石墨締聚乙締亚胺混合液的浓度为2~3mg/ml;石墨締和聚乙締亚胺体 积比为为5~6:1。
[0016] 优选电极池液是浓度为0.1~0.2mmol/L且抑为7.2~7.4的憐酸盐缓冲液。
[0017] 本发明所述的一种短杆菌，菌种的拉下学名化evibacterium sp.。菌种保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏中屯、登记入册编号是CGMCC No . 2520，参据的微生物株NJWGY2133，保藏日期是2008.05.26，保藏地址是:北京市朝阳区 大屯路，中国科学院微生物研究所。
[0018] 短杆菌具有下述性质：
[0019] 1、形态与培养特征：
[0020] 细胞形状:杆状，端圆，（1.4 X 1.7)μπι X 0.祉m，单个排列，无芙膜，不运动，革兰氏 阳性。在平板培养基上菌落呈圆形，平坦光滑，全缘，灰色，偶尔产生微黄色素。
[0021] 2、生理生化特性：
[0022] 短杆菌的主要生理生化特征见表1:
[0023] 表1菌株的生理生化特征
[0024：
[0025：
[0026] 注:+ :阳性或生长；一:阴性或不生长
[0027] 有益效果：
[0028] 本发明公开了一种短杆菌及利用该菌株发酵生产班巧酸的工艺方法，具有W下优 占 . y ?、、·
[0029] (1)我们筛选到一株短杆菌，能催化延胡索酸生成产班巧酸。
[0030] (2)本发明使用的短杆菌能产生高酶活的延胡索酸还原酶，该酶可将延胡索酸还 原成班巧酸，班巧酸回收率在70~85%。传统的催化过程需要辅酶提供电子，本发明利用短 杆菌发酵液和电极构建电化学催化体系，用电极代替辅酶给发酵液中延胡索酸还原酶将延 胡索酸还原生成班巧酸，得到循环伏安图，通过谱图可W得到短杆菌发酵液中延胡索酸还 原酶催化延胡索酸生成班巧酸的能力；用高效液相色谱-质谱连用检测班巧酸含量。与传统 方法相比，其他条件相同且适宜，发现在相同底物量和催化生成等量产物条件下，本发明催 化效率提高5倍W上。
【具体实施方式】
[0031] W下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限 定。
[0032] W下例子中设及到的传统催化途径一般为：
[0033] a、活化培养:将短杆菌NJWGY2133单菌落接入活化培养基中，活化培养基装液量为 15~25%，活化培养基成分为(g/L):葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~2.0、酵母膏0.5~2.0、 胞(：10.1~0.3、]\%504?7出0 0.1~0.3;控制活化培养溫度为30~34°(：，口出％6.5~7.0，转 速为160~20化/min;活化培养2~3天后，获得种子液；
[0034] b、发酵培养：W2~10%的体积接种量将步骤(a)种子液接种于发酵培养基中，发 酵培养基成分为(g/L):葡萄糖1.0~3.0、蛋白腺0.5~1.5、酵母膏0.5~1.5、化C1 0.10~ 0.50、MgS〇4 · 7此0 0.1~0.4;控制发酵培养溫度为30~34°C，pH为6.5~7.0，转速为160~ 20化/min;发酵培养2~3天后，6000~8000r/min离屯、获菌丝体，超声(功率150~200W，破碎 25~30s，间歇10~15s)破碎，8000~12000r/min冷冻离屯、25~30min，获得含有延胡索酸还 原酶的混合液。
[0035] C、催化体系：步骤(b)混合液中加入1~2mol/L的延胡索酸溶液，体积量为混合液 的10~15 %，混合均匀，控制反应溫度为30~34°C，pH为6.5~7.0，反应30~40min后，取混 合液ImL，稀释50倍，用高效液相色谱技术检测班巧酸含量：采用C18柱，流动相为0.1~ 0.2mol/L的拉册〇4和5~6 %的甲醇，流速为0.5~0.8mL/min，柱溫为26~28°C，波长为210~ 220nm，得到色谱图，得到班巧酸的色谱峰及对应的峰面积值为20~44mA肿S。
[0036] 实施例1:
[0037] (1)活化培养:将短杆菌NJWGY2133单菌落接入活化培养基中，控制装液量15%，活 化培养溫度为34 °C，抑为7.0，转速为18化/min，培养2天，获得种子液;其中活化培养基成分 为(邑/1):葡萄糖1.0、蛋白腺2.0、酵母膏2.0、船(：10.3、]\%504*7出0 0.3。
[0038] (2)发酵培养：W5%的体积接种量将步骤（1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培 养溫度为34°C，pH为7.0，转速为180r/min，培养2天，8000r/min离屯、20min获菌丝体，用KQ- 1001型超声机(功率200W，破碎30s，间歇10S-15S)超声破碎，12000r/min冷冻离屯、30min，获 得含有延胡索酸还原酶的混合液;其中发酵培养基成分为（g/L):葡萄糖1.0、蛋白腺1.5、 酵母膏 1.5、NaCl 0.50、]\%5〇4*7出00.4。
[0039] (3)构建电化学催化体系：取玻碳电极，表面铺满一层石墨締聚乙締亚胺混合液， 该混合液浓度为2mg/ml，体积比为石墨締：聚乙締亚胺=6:1，厚度为2mm，4°C惊干之后；取 步骤(2)获得的发酵混合液，从玻碳电极表面中屯、点开始，滴加发酵混合液，直到铺满玻碳 电极表面积的50%，发酵混合液厚度为2mm，4°C干燥至表面无液体之后，该玻碳电极作为工 作电极，销丝电极作为对电极，饱和甘隶电极作为参比电极，电极池液是浓度为为O.lmmol/ L、pH = 7.2的憐酸盐缓冲液，构建催化体系；连接电化学工作站，选择循环伏安法，设置参 数:初始电位为-0.2V，高电位为0.8V，低电位为-0.2V，起始扫描极性positive，扫描速度为 0.1 V/s，扫描段数为2W，采样间隔为0.001V，静置时间为2s，灵敏度为1. e^^A/v。电极池液 加入体积量15 %、浓度为1.5mo 1 /L的延胡索酸液，点击开始采样，2min后，采样结束即酶反 应达到饱和状态，得到的电极池液含班巧酸;得到的循环伏安图即为循环伏安法对催化体 系催化延胡索酸产班巧酸电化学行为的检测，通过谱图可w得到短杆菌发酵液中延胡索酸 还原酶催化延胡索酸生成班巧酸的能力大大提高。
[0040] (4)产量检测:取步骤(3)的电极池液ImL，稀释50倍，用高效液相色谱技术检测班 巧酸含量;采用C18柱，流动相为0.1mol/L的K2HP化和5%的甲醇，流速为0.5mL/min，柱溫为 26°C，波长为210nm，得到色谱图，得到班巧酸的色谱峰及对应的峰面积值为202.4mAU*S，是 传统催化途径得到的最大值的4.6倍。
[0041] (5)班巧酸回收:将上述含班巧酸的电解池液浓缩、萃取、结晶，即可得到班巧酸， 回收率为85 %。
[0042] 实施例2:
[0043] (1)活化培养:将短杆菌NJWGY2133单菌落接入活化培养基中，控制装液量20%，活 化培养溫度为30°C，抑为6.5，转速为16化/min，培养2天，获得种子液;其中活化培养基成分 为(邑/1):葡萄糖2.0、蛋白腺1.0、酵母膏1.0、船(：10.2、1邑504.7出0 0.2。
[0044] (2)发酵培养：W2%的体积接种量将步骤（1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培 养溫度为30°C，pH为6.5，转速为160r/min，培养2天，7000r/min离屯、15min获菌丝体，用KQ- 1001型超声机(功率180W，破碎28s，间歇12s)超声破碎，lOOOOr/min冷冻离屯、28min，获得含 有延胡索酸还原酶的混合液;其中发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖2.0、蛋白腺1.0、酵母膏 1.0、船(：10.25、]\%5〇4*7出0 0.2。
[0045] (3)构建电化学催化体系：取玻碳电极，表面铺满一层石墨締聚乙締亚胺混合液， 该混合液浓度为2.5mg/ml，体积比为石墨締：聚乙締亚胺= 5:1，厚度为2.5mm，5°C惊干之 后;取步骤(2)获得的发酵混合液，从玻碳电极表面中屯、点开始，滴加发酵混合液，直到铺满 玻碳电极表面积的55%，发酵混合液厚度为2.5mm，5°C干燥至表面无液体之后，该玻碳电极 作为工作电极，销丝电极作为对电极，饱和甘隶电极作为参比电极，电极池液为〇.15mmol/ L、pH = 7.3的憐酸盐缓冲液，构建催化体系；连接电化学工作站，选择循环伏安法，设置参 数:初始电位为-1.0V，高电位为1.0V，低电位为-1.0V，起始扫描极性positive，扫描速度为 0.1 V/s，扫描段数为2W，采样间隔为0.00IV，静置时为3s，灵敏度为1. e^^A/v;电极池液加 入体积量10%、浓度为Imol/L的延胡索酸液，点击开始采样，3min后，采样结束即酶反应达 到饱和状态，得到的电极池液含班巧酸;得到循环伏安图即为循环伏安法对催化体系催化 延胡索酸产班巧酸电化学行为的检测，通过谱图可W得到短杆菌发酵液中延胡索酸还原酶 催化延胡索酸生成班巧酸的能力提高了。
[0046] (4)产量检测:取步骤(3)的电极池液ImL，稀释50倍，用高效液相色谱技术检测班 巧酸含量;采用C18柱，流动相为0.1mol/L的K2HP化和6%的甲醇，流速为0.6mL/min，柱溫为 27°C，波长为21化m，得到色谱图，得到班巧酸的色谱峰及对应的峰面积值为171.6mAU*S， 是传统催化途径得到的最大值的3.9倍。
[0047] (5)回收:将上述含班巧酸的电解池液浓缩、萃取、结晶，即可得到班巧酸，回收率 为 82%。
[004引实施例3:
[0049] (1)活化培养:将短杆菌NJWGY2133单菌落接入活化培养基中，控制装液量25%，活 化培养溫度为32°C，抑为6.8，转速为20化/min，培养3天，获得种子液;其中活化培养基成分 为(邑/1):葡萄糖3.0、蛋白腺0.5、酵母膏0.5、船(：10.1、]\%504*7出0 0.1。
[0050] (2)发酵培养：W2.5%的接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养 溫度为32°C，pH为6.8，转速为200r/min，培养3天，6000r/min离屯、20min获上菌丝体，用KQ- 1001型超声机(功率150W，破碎25s，间歇10s)超声破碎，80(K)r/min冷冻离屯、25min，获得混 合液；其中发酵培养基成分为（g/L):葡萄糖1.0、蛋白腺0.5、酵母膏0.5、化C1 0.10、 MgS〇4· 7出0 0.1。
[0051] (3)构建电化学催化体系：取玻碳电极，表面铺满一层石墨締聚乙締亚胺混合液， 该混合液浓度为3mg/ml，体积比为石墨締：聚乙締亚胺=6:1，厚度为3mm，4°C惊干之后；取 步骤(2)获得的发酵混合液，从玻碳电极表面中屯、点开始，滴加发酵混合液，直到铺满玻碳 电极表面积的60%，发酵混合液厚度为3mm，4°C干燥至表面无液体之后，该玻碳电极作为工 作电极，销丝电极作为对电极，饱和甘隶电极作为参比电极，电极池液为〇.2mmol/L、pH = 7.4的憐酸盐缓冲液，构建催化体系;连接电化学工作站，选择循环伏安法，设置参数:初始 电位为-1.0V，高电位为1.0V，低电位为-1.0V，起始扫描极性positive,扫描速度为O.lV/s， 扫描段数为2W，采样间隔为0.001V，静置时为2s，灵敏度为l.e^?6A/V;电极池液加入体积量 20%、浓度为2mol/L的延胡索酸液，点击开始采样，2min后，采样结束即酶反应达到饱和状 态，得到的电极池液含班巧酸;得到循环伏安图即为循环伏安法对催化体系催化延胡索酸 产班巧酸电化学行为的检测，通过谱图可W得到短杆菌发酵液中延胡索酸还原酶催化延胡 索酸生成班巧酸的能力稍有提高。
[0052] (4)产量检测：取步骤(3)的电极池液ImL，稀释50倍，用高效液相色谱技术检测班 巧酸含量。采用C18柱，流动相为0.2mol/L的K2HP化和5 %的甲醇，流速为0.8mL/min，柱溫28 °C，波长为220nm，得到色谱图，得到班巧酸的色谱峰及对应的峰面积值为158.4mAU*S，是传 统催化途径得到的最大值的3.6倍。
[0053] (5)班巧酸回收:将上述含班巧酸的电解池液浓缩、萃取、结晶，即可得到班巧酸， 回收率为88 %。
【主权项】
1. 一种短杆菌发酵生产琥珀酸的方法，其具体步骤为： (1) 活化培养:将短杆菌NJWGY2133单菌落接入活化培养基中，控制培养液体积装液量 为15~25%，在转速为160~200r/min，活化培养温度为30~34°C下活化培养2~3天后，获 得种子液； (2) 发酵培养：以2~10%的体积接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，在转速 为160~200r/min，发酵培养温度为30~34 °C下发酵培养2~3天后，离心获菌丝体，超声破 碎，冷冻离心，获得含有延胡索酸还原酶的混合液； (3) 构建电化学催化体系:将步骤(2)获得的混合液固定在玻碳电极表面后的玻碳电极 作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，电极池液是磷酸盐缓冲 液，构建催化体系;连接电化学工作站，设置参数为:初始电位为-〇. 2~-IV，高电位为0.8~ IV，低电位为-0.2~-IV，起始扫描极性posi tive，扫描速度为0.1~0.2V/s，扫描段数为2~ 3W，采样间隔为0.001~0.002V，静置时间为2~3s，灵敏度为l.e__~l.e+^A/V;在电极池 液中加入体积量为电极池液的10~20%的延胡索酸液，点击开始采样，待采样结束即酶反 应达到饱和状态，得到含琥珀酸的电极池液;其中延胡索酸液的浓度为1~2mol/L; (4) 回收:将步骤(3)得到的含琥珀酸的电解池液浓缩、萃取、结晶，即得到琥珀酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中活化培养基成分为(g/L):葡萄 糖1.0~3.0、蛋白胨0.5~2.0、酵母膏0.5~2.0、NaC10.1~0.3、MgS〇4 · 7H20 0.1~0·3;ρΗ 为6.5~7.0。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中发酵培养基成分为(g/L):葡萄 糖 1.0~3.0、蛋白胨0.5~1.5、酵母膏0.5~1.5、NaCl 0.10~0.50、MgS〇4 · 7H20 0.1 ~0.4; pH为6.5~7.0。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中离心获菌丝体的离心转速为 6000~8000r/min，离心时间为15~20min;超声破碎的超声功率为150~200W，破碎时间为 25~30s，间歇时间为10~15s;冷冻离心的离心转速为8000~12000r/min，离心时间为25~ 30min〇5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的工作电极由以下方法制备 得到，其具体步骤为:玻碳电极表面铺满一层厚度为2~3mm的石墨烯聚乙烯亚胺混合液，4 ~5°C晾干后，取步骤(2)获得的发酵混合液，从玻碳电极表面中心点开始，滴加发酵混合 液，直到铺满玻碳电极表面积的50~60%，控制发酵混合液厚度为2~3_，4~5°C干燥至表 面无液体，制得工作电极。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于石墨烯聚乙烯亚胺混合液的浓度为2~3mg/ ml;石墨烯和聚乙烯亚胺体积比为为5~6:1。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于电极池液是浓度为0.1~0.2mmol/L且pH为 7.2~7.4的磷酸盐缓冲液。
【文档编号】C12R1/13GK106011186SQ201610596670
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月25日
【发明人】胡永红, 于烨敏, 杨文革, 周俊, 曹洋, 马小平
【申请人】南京工业大学