一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法
【专利摘要】一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，涉及胞外多糖。从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养得已活化的发酵液；在MRS液体培养基中添加终浓度为10mM的CaCl2，取已活化的发酵液进行转接，得转接后的发酵液，取培养0，2，4，6，12，24h的1ml转接后的发酵液测定OD600、pH值；取中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，加入冰乙醇，冰箱里过夜，离心，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后即得粗胞外多糖，然后溶解于纯水中，取经过透析冻干后的粗胞外多糖样品溶于蒸馏水中，配制20mg/mL的溶液，离心，取上清液离子柱层析得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
【专利说明】
-种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法
技术领域
[0001] 本发明设及胞外多糖，尤其是设及一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法。
【背景技术】
[0002] 益生菌应用有着悠久的历史。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌 群的平衡，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌和腐败产物的产生，制造营养 物质，从而对机体的营养状态、生理功能、免疫反应等产生作用W。乳酸，是乳酸菌的主要的 发酵产物，乳酸不但风味待殊，并有极强的杀菌力，在有机酸中一枝独秀。它杀菌能力大于 巧樣酸，酒石酸，班巧酸几倍W。乳酸还是一个极具吸引力的化学工业前体物，它可W作为 生产可生物降解的聚丙交醋前体，和替代从石化衍生的聚合物的潜力。乳酸菌还可W将废 生物质转换成工业具有工业价值的产物。
[0003] 活性乳酸菌饮料是一种含有活乳酸菌的发酵乳饮料。与凝固型酸奶相比，活性乳 酸菌饮料不仅具有酸奶的保健功能，而且浓度更低，流动性更好，口感更爽，成本更低，所W 一经问世，便迅速占领市场^-73。2006年全球的发酵乳饮料市场增长了 9.3%，大大超过了其 他乳制品的增长率。活性乳酸菌饮料的口感风味和乳酸菌的数量是构成产品质量的主要因 素。研究表明?，益生菌在人体中的存活和增殖能力对益生菌的益生作用有着重要影响，要 获得所期望的益生菌的保健功效，益生菌必须达到足够数量。我国国家标准对乳酸菌乳饮 料中的活菌数规定:乳酸菌数> 1〇6个/ml。日本发酵乳与乳酸菌饮料协会规定:乳中益生菌 数至少为1〇7个/ml，W确保进入人体后足够的活菌发挥保健功能。然而，目前许多研究发 现，进入货架上的产品中益生菌的数量，会由于自身的生长特性及周围环境因素的影响，呈 一定的下降趋势。因此，要获得所期望的保健效果，必须提高食品中乳酸菌的数量，W确保 乳酸菌通过消化道后仍大量存活，进入肠道后发挥益生作用。但目前主要的手段都是通过 活性乳酸菌乳饮料发酵工艺的优化，步骤繁琐。
[0004] 乳酸菌胞外多糖化PS)是乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或芙 膜多糖，具有重要的物理化学特性，如良好的流变学特性，能改善发酵乳的粘度、质构和口 感，防止缩水和乳清析出，使产品增稠、稳定，质地细腻均匀，口感润滑;而且EPS还具有良好 的生理活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗溃瘍、抗氧化、降胆固醇、降血压等，还可作为 益生元促进肠道内其他益生菌的生长，调节肠道菌群近年来关于乳酸菌和乳酸菌胞 外多糖的研究成为热点。
[0005] 参考文献：
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【发明内容】
[0017] 本发明的目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法。
[001引本发明包括W下步骤：
[0019] 1)从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养，得已活化的 发酵液；
[0020] 在步骤1)中，所述菌种为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，该菌株购自中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、;所述MRS固体培养基的组成为:葡萄糖20g/ L，牛肉膏lOg/L，脉蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，巧樣酸锭Ig/L，乙酸钢5g/L，K此P〇4 2g/L， 1邑504.7出0 0.05邑/1，111504.出0 0.05邑/1，琼脂粉15邑/1，抑6~6.5;所述11?5液体培养基 的组成为:葡萄糖20g/L，牛肉膏lOg/L，脉蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，巧樣酸锭Ig/L，乙酸钢 5g/L，KH2P04 2g/L，MgS04·7出0 0.05g/L，MnS04·此0 0.05g/L，pH6~6.5，灭菌条件为118 °C，15min;所述培养的条件可在37°C下恒溫静置培养12h;
[0021] 2)在MRS液体培养基中添加终浓度为lOmM的化Cl2,取步骤1)中已活化的发酵液进 行转接，得转接后的发酵液，取培养0,2,4,6，12,24h的lml转接后的发酵液测定0D600、pH 值；
[0022] 在步骤2)中，所述转接按体积百分比4%进行转接。
[0023] 3)取步骤2)中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，按体积比1:巧日入冰乙醇， 冰箱里过夜，然后离屯、，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后，即 得粗胞外多糖(C-EPS);
[0024] 在步骤3)中，所述冰乙醇可采用质量百分浓度为95%的冰乙醇;所述冰箱的溫度 可为4°C;所述离屯、的条件可在4°C，8000g离屯、lOmin;所述冷冻干燥的时间可为化;所述透 析的条件可在4°C下透析3d。
[0025] 4)将步骤3)所得的粗胞外多糖溶解于纯水中，取经过透析冻干后的粗胞外多糖样 品，溶于蒸馈水中，配制20mg/mL的溶液，离屯、，取上清液离子柱层析，得鼠李糖乳杆菌胞外 多糖，记为胞外多糖组分2化PS-2)。
[00%]在步骤4)中，所述离屯、的条件可为8000g离屯、lOmin;所述离子柱层析可采用DEAE- Sepharose化31 Flow(GE公司）离子柱层析。
[0027] 所得的鼠李糖乳杆菌胞外多糖可用GPC法进行纯度分析;将25mg鼠李糖乳杆菌胞 外多糖溶解于〇2〇中，用化址er 600MZ核磁共振仪进行结构的分析。
[0028] 乳酸的用途不断扩展，活性乳酸菌饮料市场逐渐成熟，而胞外多糖的实用价值得 到广泛关注，但受限于产量与成本。本发明在液体MRS培养基中添加终浓度为lOmM化Cl2， 简便易得，低成本，极具乳酸菌工业化价值。在含有CaCl2的MRS液体培养基中，鼠李糖乳杆 菌的生长得到促进，发酵1化活菌数可提升140%，同时产酸能力、胞外多糖的产量也大幅提 升，对该方法下提纯的胞外多糖进行分析，发现为一种新型乳酸菌胞外多糖-鼠李糖乳杆菌 胞外多糖。本发明利用发酵液对大肠杆菌化21、蜡状芽抱杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑制实 验，结果表明高活菌数的发酵液可W加强乳酸菌发酵液对有害菌的抑制，将全细胞菌液直 接用于有害菌的抑制。
【附图说明】
[0029] 图1为巧离子对鼠李糖乳杆菌生长的影响。
[0030] 图2为巧离子对鼠李糖乳杆菌活菌数的影响。
[0031] 图3为DEAE-Sepharose阴离子交换柱NaCl溶液洗脱曲线。
[0032] 图4为GPC测定EI^的纯度。
[0033] 图5为EPS-2的600MHz 1h NMR谱图。
[0034] 图6为EPS-2的600MHz 13〇 NMR谱图。
[0035] 图 7为EPS-2的 600MHz Edit-HSQC NMR谱图。
[0036] 图8为EPS-2的600MHz COSY NMR谱图。
[0037] 图9为EPS-2的600MHz 服QC-TOCSY NMR谱图。
[003引 图 10为EPS-2的600MHz gHMBC NMR谱图。
[0039] 图 11为EPS-2的 600MHz N0ESY NMR谱图。
[0040] 图 12为EPS-2的600MHz 肥BC NMR谱图。
【具体实施方式】
[0041] 为阐述本发明的目的及其技术效果，下面将结合附图对本发明做进一步详细说 明。
[0042] 本发明实施例步骤如下：
[0043] 实施例1:化C12促进鼠李糖乳杆菌生长
[0044] 在发酵过程中W脱脂乳为培养基的发酵液中乳酸菌的活菌数与吸光度之间呈线 性相关关系。因此，通过测定发酵液的吸光度可W评定发酵乳制品中乳酸菌的活菌数。同时 检测发酵液的抑值。
[0045] 1)培养基：
[0046] 1、MRS液体培养基(g/L):葡萄糖20，牛肉膏10，腺蛋白腺10，酵母粉5，巧樣酸锭1， 乙酸钢5，K出P04 2，MgS04·7出0 0.05，MnS04·出0 0.05，pH6~6.5。
[0047] 2、MRS固体培养基(g/L):葡萄糖20，牛肉膏10，|示蛋白腺10，酵母粉5，巧樣酸锭1， 乙酸钢5，Κ出P〇4 2，MgS〇4*7出0 0.05，MnS〇4·出0 0.05,琼脂粉 15，pH 6-6.5。
[004引2)无菌化C12溶液的配制
[0049] CaCb溶液的配制：准确称取1.500g已80°C烘干化无水氯化巧粉末于4ml离屯、管 内，加入3ml无菌去离子水，配制为浓度0.5g/ml的溶液。超声lOmin后，放入超净台内备用。
[0050] 无菌化Cl2溶液制备：用2ml的无菌注射器吸取2ml上述配制好的化Cl2溶液，0.22皿 尼龙过滤膜过滤后，装入4ml无菌离屯、管内备用。
[0051 ] 3)将活化12h的鼠李糖乳杆菌发酵液按4 % (v/V)接种于含1 OmM CaCl 2的MRS液体 培养基及MRS液体培养基中。
[0052] 所述活化的方法为:将接种环用酒精灯烧红并冷却后，用其从Ξ区划线的保种MRS 平板上挑取单菌落，接入装有20mL MRS液体培养基的lOOmL摇瓶中，并置于37Γ静置培养箱 培养12h。
[0053] 4)培养方法
[0化4] 培养基准备:在250ml的摇瓶中，装入50ml的MRS液体培养基。118Γ灭菌15min。在 50ml的MRS液体培养基中加入11化1步骤2)所配制的无菌化Cl2溶液，此时化Cl2的终浓度即 为lOmM。
[0055] 所述培养方法:按4%的接种量将前培养的菌液加入装有50ml MRS或已添加1 OmM 化Cl2的MRS液体培养基，操作均设有2~3平行，将其置于37 °C的静置培养箱中培养。
[0056] 添加化C12对鼠李糖乳杆菌生长及产乳酸能力的影响表征，通过如下方法：
[0化7] 5)生长曲线的检测
[005引1.取样：于接种后0，2，4，6，12，24h分别取样ImL用于检测发酵液的0D600值及pH 值。MRS液体发酵液作为对照组。
[0059] 2.菌液浓度的测定:将菌液稀释一定梯度倍数(1~30倍)后，在600nm波
[0060] 长下检测其吸光值，其中空白对照为菌液离屯、（14000巧m，5min)后的上清。
[0061] 3. pH值的检测:用抑计检测发酵液上清液的抑。
[0062] 4.数据处理：
[0063] OD600,LaG= (OD600-〇D600,blank) X 稀释倍数
[0064] W实际测量数据计算各平行样的平均值和标准差，绘制生长曲线。
[0065] 从图1可见，与正常MRS培养基相比较，加入lOmM CaCb的MRS培养基的吸光值更 高，在1化时，吸光值0D600达到4.24，而正常MRS培养基0D600为3.40。到达发酵终点2地时， lOmM CaCb的MRS培养基的0D600达到5.10，而正常MRS培养基0D600为4.60。此时，二者的产 酸能力也有较大差异。lOmM CaCl2的MRS培养基的抑达到3.64，而正常MRS培养基抑为3.51。 说明巧离子不仅促进鼠李糖乳杆菌的生长，更加强其产酸能力。
[0066] 实施例2:化Cl2提升鼠李糖乳杆菌活菌数
[0067] 菌落计数法用W来计算细菌的总数，其中不包含了死菌的数目，因而能准确反映 发酵液中的活菌数。
[0068] 1)按照例1的培养方式培养细菌，培养1化或24h后，取1ml发酵液样品，用无菌水逐 级稀释到10-7倍。分别取2个条件下的发酵培养液样品的10-6和10-7倍两个稀释度，吸取稀释 后的菌液50μ1均匀涂布于MRS固体培养基平皿，37 °C培养4她。取出培养皿平板，计数的过程 中在平皿上要注意区别微小的菌落、不溶性的小颗粒或沉淀物，仔细查处可疑物，用放大镜 观察，W便从其他物质中区别出菌落来。注意要用菌落数在10~300个之间的平皿计数。
[0069] 2)鼠李糖乳杆菌菌落总数的计算如下：
[0070] CFU/ml)=总计数的菌落数X 20 X 1〇6
[0071] 从图2中可知，在正常的MRS培养基中添加 lOmM CaCb可提升鼠李糖乳杆菌的活菌 数，在1化时，活菌数提升率为140%。而到2地，细胞进入衰亡期，与正常MRS液体培养条件相 比较，1〇11^化(：1河提升活菌数167%。
[0072] 实施例3:应用实例
[0073] 选用大肠杆菌化2UE.coli化21)、金黄色葡萄球菌(B.cereus)、蜡状芽抱杆菌 (S. aureus)进行抑菌实验。具体操作如下：
[0074] 1)将大肠杆菌BL21、蜡状芽抱杆菌接种到LB液体培养基中培养12h，转速为 20化pm，备用。将金黄色葡萄球菌接种到TSB液体培养基培养12h，转速为15化pm，备用。
[0075] 2)用内径5mm的打孔器打孔滤纸，获得若干内径均一的圆形滤纸片，灭菌。
[0076] 3)配制一定量的LB及TSB液体和琼脂培养基，灭菌。
[0077] 4)将鼠李糖乳杆菌在MRS液体培养基及加入lOmM CaCb的MRS培养（37°C，静置） 1化，备用。
[007引 5化B及TSB琼脂培养基加热溶化后，待其冷却到50°C左右，在超净台迅速加入 4.1.1中已培养1化的病原菌液(2%，v/v)，混匀后倒入已灭菌的平板。
[0079] 6)待上述平板凝固后，用綴子将灭菌的滤纸片置于加入病原菌的琼脂培养基上， 吸取20μ1培养1化的正常及胁迫条件下的MRS液体鼠李糖乳杆菌液滴于滤纸片上。将平板正 置于4°C冰箱固定化，后倒置于37°C培养箱中培养12h，取出平板观察并用Image J软件 (化pan)测量抑菌圈的平均直径化ZD，cm)。
[0080] 表1鼠李糖乳杆菌在2个培养条件下37Γ发酵12h的抑菌圈
[0081]
[0082] 注:打孔圈的直径为8.00mm。
[0083] 根据实验结果，在正常MRS培养基中添加 lOmM CaCb可W增强鼠李糖乳杆菌的抑 菌效应。
[0084] 实施例4:化Cl2促鼠李糖乳杆菌分泌EPS的纯化与纯度测定
[0085] 1)去除蛋白
[0086] 1、培养细胞:按照例1的方式培养鼠李糖乳杆菌，静置于37Γ恒溫培养箱中静置培 养1化。
[0087] 2、去除细胞:将菌液超声处理20min，振幅为20%。4°C，3000g离屯、lOmin后去除细 胞沉淀留上清。
[008引 3、去除蛋白：加入终浓度4%^氯乙酸^/^)，4°(：冰箱里过夜，4°(：，3000邑离屯、 lOmin后去除蛋白沉淀取上清。
[0089] 2)沉淀多糖
[0090] 按体积比1:3加入95%冰乙醇，4°C冰箱里过夜，4°C，8000g离屯、lOmin后去除上清 留沉淀。将沉淀冷冻干燥化后取出，4°C透析3d，冷冻干燥后得到粗胞外多糖(C-EPS)。
[0091] 3)DEAE-Sepharose 阴离子交换柱提纯 EPS
[0092] 取经过透析冻干后的粗多糖样品，分别溶于蒸馈水中，配制20mg/血的溶液，8000g 离屯、lOmin，取上清液进行DEAE-Sepharose Fast Flow(GE公司）离子柱层析，层析系统采用 Amersham Bioscience的AKTAprime。先W超纯水洗脱，再W〇~Imol/L的化〔1梯度洗脱， 流速l.OmL/min，每隔5min取一管，洗脱液每隔1管用苯酪硫酸法检测。分别收集各洗脱峰部 分，透析3d，冷冻干燥。绘制洗脱曲线。
[0093] 4化PS的纯度测定
[0094] 用高效液相色谱仪(Agilent公司）进行纯度的检测，取上述提纯后样品3mg溶于 ImL蒸馈水aOOOOg离屯、lOmin，自动上样20化，记录洗脱曲线用于判定该多糖组分的纯度。 实验所用的HPLC的具体测试条件如下：
[00巧]仪器:Agilent 1200高效液相色谱仪(配示差折光检测器和化emical工作站）；
[0096] 色谱条件:色谱柱为TOSOH? G4000PW XL 300mmX7.8mm;
[0097] 流动相:超纯水；
[009引流速:0.6ml/min;
[0099] 柱溫:50°C;
[0100] 样品制备:样品溶解于流动相中，用微孔过滤膜过滤后进样。
[0101] 如图3所示，添加 lOmM CaCb后，鼠李糖乳杆菌产生的粗多糖经分离后含有2个EPS 组分。提取主要的EPS-2组分，进行纯度的分析。如图4所示，经过GPC分析，出峰时间为 9.231min，色谱图为单一对称的峰，可知EPS-2组分为纯组分。
[0102] 实施例5:NMR手段分析EPS-2结构
[0103] NMR分析步骤：25mg多糖EPS-2溶解在0.7mL 〇2〇中，用600MHz化uker核磁共振仪 进行分析。W四気代Ξ甲硅烷丙酸钢(T.S.P)作内标，测试溫度25°Cd1D醒R测定:1化NMR 和 1h NMRe2D NMR测定:H-H 〇35￥、1'0〔5￥、册9(：、歷齡和側65￥。
[0104] 如图5~12,综合W上谱图分析，EPS-2糖残基的iH和1?醒R的化学位移归属结果 见表2。根据EPS-2的1C分析单糖组成，确定其中含有甘露糖和葡萄糖。又根据EPS-2水解成 单糖后的NMR谱图中确定(NMR谱图没有在论文中提供化，F和F '指认为甘露糖，B，B '和D指认 为葡萄糖。根据端基异构信号的化学位移，上述(A，F，F'）和(B，B'，D)残基被分别指认为β- Glcp和e-Manp。因 3Jhi,h2(6 .細Ζ)和异头质子的化学位移小于5. Oppm的，运表明Ε残存是α异 头。
[01化]该N0ESY和HMBC图谱提供了有关糖巧键的信息。根据N0ESY谱5.16/4.24^-刖/8- 肥），5.07/4.13(8'-化/0-肥），4.91/3.79化-化/^寸4)和5.31/4.03化-化/尸寸4)，^及歷齡 谱图的相关信号5.31/81.58(0-化/。-0 4)，5.06/81.32(8-化/8'-〔2)，4.91/75.77化-化/ A-4)，和由于严重的光谱重叠而无法确切指认的F-Hl/F '-H4和F'-H1/E-H4的相关峰值，并 根据多糖水解的单糖结果可得到表2,归属碳氨原子，得到一种新型的纯多糖的结构为：
[0106] [-4)-a-Manp-(1一4)-β-Manp-(1一2)-β-Manp-(1一 2)-β-G1cp-(1一4)β-Manp-(1 一4)0-Manp_(l一]
[0107] 表2 EPS-2糖残基的1h和"C NMR的化学位移(〇2〇,化。C)
[010 引
[0109]本发明采用W鼠李糖乳杆菌作为实验菌种，通过在正常葡萄糖为碳源的MRS培养 基中添加 lOmM CaCl2，W增加发酵液中鼠李糖乳杆菌的活菌数，检测对照组与正常组的产 酸能力比较，同时用发酵液对有害菌进行抑制实验。通过验证，在MRS培养基中添加 lOmM 化Ch，发酵12h即可提升鼠李糖乳杆菌的活菌数140%，对于大肠杆菌、蜡状芽抱杆菌、金黄 色葡萄糖球菌的抑菌圈分别从0.85±0.02、1.11 ±0.06、1.29±0.03cm增大至1.00 ±0.02、 1.29±0.03、1.41±0.08畑1。在1011110曰(：12胁迫下，从培养基中提取一种新型多糖，经过醒尺 分析，结构为：
[0110] [-4)-a-Manp-(1^4)-0-Manp-(1^2)-0-Manp-(1^2)-0-Glcp-(1^4)0-]\feuip-(l 一4)0-Manp_(l一]
[0111] 本发明公开了一种简单低成本的方法增加乳酸菌活菌数及乳酸的产量，乳酸的用 途不断扩展，但应用仍受限于产量与成本。培养基的碳源、氮源、培养pH、菌株、微量元素的 含量均会影响到乳酸的产量。本发明采用一种简单、低成本的方法，与传统发酵相比较，发 酵12h即可最大可W提升乳酸菌活菌数140%，对致病菌的抑制圈也有明显的增大，同时产 酸能力提升，并从添加 lOmM CaCb的培养基中，分离纯化出一种新型鼠李糖乳杆菌胞外多 糖。
【主权项】
1. 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养，得已活化的发酵 液； 2) 在MRS液体培养基中添加终浓度为IOmM的CaCl2，取步骤1)中已活化的发酵液进行转 接，得转接后的发酵液，取培养〇，2，4，6，12，24h的Iml转接后的发酵液测定0D600、pH值； 3) 取步骤2)中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，按体积比1:3加入冰乙醇，冰箱 里过夜，然后离心，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后，即得粗 胞外多糖； 4) 将步骤3)所得的粗胞外多糖溶解于纯水中，取经过透析冻干后的粗胞外多糖样品， 溶于蒸馏水中，配制20mg/mL的溶液，离心，取上清液离子柱层析，得鼠李糖乳杆菌胞外多 糖。2. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤1)中， 所述MRS固体培养基的组成为:葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，际蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，柠 檬酸铵lg/L，乙酸钠5g/L，KH 2P〇4 2g/L，MgS〇4.7H20 0.05g/L，MnS〇4.H20 0.05g/L，琼脂粉 15g/L，pH 6~6·5〇3. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤I)中， 所述MRS液体培养基的组成为:葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，际蛋白胨I Og/L，酵母粉5g/L，柠 檬酸铵lg/L，乙酸钠5g/L，KH2P〇4 2g/L，MgS〇4,7H20 0.05g/L，MnS〇4.H20 0.05g/L，pH 6~ 6.5，灭菌条件为118°〇，15111；[11。4. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤1)中， 所述培养的条件是在37°C下恒温静置培养12h。5. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤2)中， 所述转接按体积百分比4%进行转接。6. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤3)中， 所述冰乙醇采用质量百分浓度为95%的冰乙醇。7. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤3)中， 所述冰箱的温度为4°C。8. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤3)中， 所述离心的条件是在4 °C，8000g离心10min;所述冷冻干燥的时间可为8h;所述透析的条件 可在4 °C下透析3d。9. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤4)中， 所述离心的条件为8000g离心10min。10. 如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤4) 中，所述离子柱层析采用GE公司的DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析。
【文档编号】C12R1/225GK106011196SQ201610339049
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】卢英华, 薛成凤, 吴意珣, 凌雪萍, 敬科举, 姚传义
【申请人】厦门大学