用于检测碎片化dna目标区域的引物组合物及其应用

用于检测碎片化dna目标区域的引物组合物及其应用
【专利摘要】本发明公开了用于检测碎片化DNA目标区域的引物组合物及其应用，其中该引物组合物包括：第一引物组，所述第一引物组包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物和所述第二通用引物的靶点位于所述目标区域的两端，分别用于构成测序文库的5’端和3’端；以及第二引物组，所述第二引物组包括第一特异性引物组和第二特异性引物组。利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，能够显著提高引物扩增的适应范围和有效模板量，进而对富集产物进行测序检测，能够显著提高碎片化DNA的检测灵敏度。
【专利说明】
用于检测碎片化DNA目标区域的引物组合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及碎片化DNA检测技术领域，具体地，设及用于检测碎片化DNA目标区域 的引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 科研人员进行生物学研究时，需要从各种类型的样本中提取核酸(DNA，或RNA)。其 中，体液样本含有碎片化的DNA，对该样本中的DNA进行生物学检测是重要的检测步骤。例如 血浆DNA，是血液中细胞外的DNA，W核小体(DNA-蛋白质复合体)的形式存在。运类碎片化的 DNA长度在几十至几百碱基对(主峰为166bp)。运类碎片化DNA通常由少量调亡细胞释放至 血液循环系统中，含量极低，现有PCR方法很难检测到可靠信息。
[0003] 另外，化石在生物进化、遗传、形态、分类等许多学科的研究中都具有独特的价值。 由于DNA水平的进化在生物进化论中占有举足轻重的地位，而化石DNA是直接了解DNA进化 过程的一个重要的也可能是唯一的途径，因此该领域的研究将成为分子进化论的一个重要 方面。但是化石DNA在长时间的形成过程中，DNA已经降解至很小的片段，同时含量也极为稀 少，现有的检测方法往往达不到科研人员的检测要求。
[0004] 石蜡包埋(FFPE)样本解决了新鲜样本长期保存的问题，但是样本经过福尔马林固 定、石蜡包埋之后，DNA很容易形成交联并碎片化，通常为几十至几千碱基对。科研人员很难 从运类材料中获得高质量的DNA用于高灵敏检测。
[0005] 刑侦样本是公安机关用于破案的重要证据，在破案过程中扮演着重要的角色。但 是，刑侦样本因所处环境的不同，刑侦样本DNA通常会有不同程度的降解。同时刑侦样本DNA 往往不是纯的单个个体的DNA，而是混有其他个体DNA的混合物，而且真正有意义的DNA的混 合比例有可能极低(0.1%)，但是，现有的检测方法很难达到运么高的检测灵敏度。
[0006] 因而，目前的碎片化DNA检测方法仍有待改进。

【发明内容】

[0007] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种DNA利用率高、灵敏度高尤其适于微量样本的碎片化DNA检测方法。
[000引需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
[0009] 对于碎片化DNA，传统的检测方法是对检测区域设计一对面对面的引物(正向引物 和反向引物），通过PCR(聚合酶链式反应)对该区域进行指数放大，最后通过仪器对该扩增 产物进行检测。传统的PCR检测技术的引物区内不能出现断裂点的情况，否则，PCR实验将 失败。由于碎片化DNA的特点，势必造成传统PCR技术可利用模板的效率降低。
[0010] 具体地，发明人研究发现，传统检测碎片化DNA的方法主要通过对待检测区域进行 PCR扩增进行检测，因为PCR引物是设计在待检测区域的两侧，因此要求待检测区域保持完 整，但是碎片化DNA是随机断裂产生的，大多数碎片化DNA是不完整的，因此，能作为PCR模板 使用的碎片化DNA数量极少，PCR很难检测到。进而，发明人创造性地使用同向特异性引物组 对碎片化DM进行富集，从而增加了引物扩增的适应范围、有效模板量，并且使碎片化DM的 检测灵敏度得到极大的提高，有效解决了目前的技术难题。
[0011] 进而，在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于检测碎片化DNA目标区域的引 物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包括：
[0012] 第一引物组，所述第一引物组包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用 引物和所述第二通用引物的祀点位于所述目标区域的两端，分别用于构成测序文库的5'端 和3'端；W及
[0013] 第二引物组，所述第二引物组包括第一特异性引物组和第二特异性引物组，
[0014] 其中，
[0015] 所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组均包含η条目标区域特异性引 物，且所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组必须满足下列条件：
[0016] (1)所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组的各特异性引物均同向延 伸，祀点均位于所述碎片化DNA目标区域的5 '端或3 '端；
[0017] (2)η=1-5的任意整数，Wn = 5为例，设所述第一特异性引物组的各特异性引物分 别为:Nl、N2、N3、N4、N5，所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为:Ml、M2、M3、M4、M5，W特 异性引物的祀点与目标区域之间的距离为衡量标准，所述第一特异性引物组和所述第二特 异性引物组的各特异性引物之间的距离远近关系为：
[001引化〉化〉化〉N4〉化；
[0019] Mi>M2>M3>M4>M5 ；
[0020] 化〉Ml;
[0021] 化〉M2;
[0022] 化〉M3;
[0023] N4〉M4;且
[0024] 化〉Μ己，
[0025] 其中，所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组的各特异性引物的祀点， 与所述第一通用引物的祀点分别位于所述目标区域的两端，与所述第二通用引物的祀点位 于所述目标区域的同端。
[0026] 发明人惊奇地发现，本发明的引物组合物能够有效用于检测碎片化DNA目标区域。 具体地，利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，能够显著提高引 物扩增的适应范围和有效模板量，进而对富集产物进行测序检测，能够显著提高碎片化DNA 的检测灵敏度。从而，本发明的引物组合物尤其适于微量样本的碎片化DNA检测。
[0027] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建碎片化DNA的目标区域检测文库的 方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的引物组合物，通过PCR扩增富集所述碎 片化DNA目标区域的序列。
[0028] 根据本发明的实施例，利用该方法能够有效构建碎片化DNA的目标区域检测文库。 并且，该方法利用前述的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，从而能够显著 提高引物扩增的适应范围和有效模板量，获得的富集产物即测序文库用于高通量测序后， 目标区域测序结果准确可靠，碎片化DNA的检测灵敏度高，且可重复性好。并且，该方法尤其 适于微量样本的碎片化DNA的目标区域测序文库构建。
[0029] 在本发明的第Ξ方面，本发明提出了一种确定碎片化DM目标区域序列信息的方 法。根据本发明的实施例，该方法包括：
[0030] 根据前面所述的构建碎片化DNA的目标区域检测文库的方法，构建所述碎片化DNA 的目标区域检测文库；
[0031] 对所述碎片化DNA的目标区域检测文库进行测序，W便获得测序结果；W及
[0032] 基于所述测序结果，确定所述碎片化DNA目标区域的序列信息。
[0033] 发明人发现，利用该方法能够有效确定碎片化DNA目标区域序列信息。并且，基于 前述利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，从而显著了提高引 物扩增的适应范围和有效模板量，且有效提高了扩增效果扩增特异性，进而获得的富集产 物用于高通量测序后，目标区域测序结果准确可靠，碎片化DNA的检测灵敏度高，且可重复 性好。并且，该方法尤其适于微量样本的碎片化DNA检测，在科学研究及生产应用方面均意 义重大，适于推广。
[0034] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建碎片化DNA目标区域检测文库的装 置。根据本发明的实施例，该装置设置有前面所述的引物组合物，所述装置包括：
[0035] 第一 PCR扩增单元，所述第一 PCR扩增单元用于利用第一特异性引物组和第一通用 引物对所述碎片化DNA进行第一PCR扩增，W便获得第一PCR扩增产物；
[0036] 第二PCR扩增单元，所述第二PCR扩增单元与所述第一 PCR扩增单元相连，用于利用 第二特异性引物组和第一通用引物对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，W便获得第 二PCR扩增产物；W及
[0037] 第SPCR扩增单元，所述第SPCR扩增单元与所述第二PCR扩增单元相连，用于利用 第一通用引物和第二通用引物对所述第二PCR扩增产物进行第SPCR扩增，W便获得第Ξ PCR扩增产物，所述第SPCR扩增产物构成所述碎片化DNA的目标区域检测文库。
[0038] 根据本发明的实施例，该装置利用前述的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进 行扩增富集，从而能够显著提高引物扩增的适应范围和有效模板量，获得的富集产物即测 序文库针对目标区域的特异性好，进而用于高通量测序后，目标区域测序结果准确可靠，碎 片化DNA的检测灵敏度高，且可重复性好。并且，该装置尤其适于微量样本的碎片化DNA的目 标区域测序文库构建。
[0039] 在本发明的第五方面，本发明提出了一种确定碎片化DNA目标区域序列信息的系 统。根据本发明的实施例，该系统包括：
[0040] 前面所述的构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置，用于构建所述碎片化DNA的 目标区域检测文库；
[0041] 测序装置，所述测序装置与所述构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置相连，用 于对所述碎片化DNA的目标区域检测文库进行测序，W便获得测序结果；W及
[0042] 序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果， 确定所述碎片化DNA目标区域的序列信息。
[0043] 发明人惊奇地发现，该系统利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进 行扩增富集，从而显著了提高引物扩增的适应范围和有效模板量，且有效提高了扩增效果 扩增特异性，进而获得的富集产物用于高通量测序后，不仅能够有效确定碎片化DNA目标区 域的序列信息，且测序结果准确可靠，检测灵敏度高，可重复性好。并且，该系统尤其适于微 量样本的碎片化DM检测，在科学研究及生产应用方面均意义重大，适于推广。
[0044] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0045] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0046] 图1显示了本发明的同向延伸的特异性引物的设计原理示意图；
[0047] 图2显示了本发明的引物组合物进行突变位点检测的原理示意图；
[0048] 图3显示了本发明的引物组合物进行基因融合检测的原理示意图；
[0049] 图4显示了根据本发明实施例的构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置的结构 示意图；
[0050] 图5显示了根据本发明实施例的定碎片化DNA目标区域序列信息的系统的结构示 意图；
[0051] 图6显示了实施例1的纯化产物的电泳检测结果；W及
[0052] 图7显示了实施例2的纯化产物的电泳检测结果。
【具体实施方式】
[0053] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。
[0054] 引物组合物
[0055] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于检测碎片化DNA目标区域的引物组 合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包括：
[0056] 第一引物组，所述第一引物组包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用 引物和所述第二通用引物的祀点位于所述目标区域的两端，分别用于构成测序文库的5'端 和3'端；W及
[0057] 第二引物组，所述第二引物组包括第一特异性引物组和第二特异性引物组，
[0化引 其中，
[0059] 所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组均包含η条目标区域特异性引 物，且所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组必须满足下列条件：
[0060] (1)所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组的各特异性引物均同向延 伸，祀点均位于所述碎片化DNA目标区域的5 '端或3 '端；
[0061] (2)η=1-5的任意整数，Wn = 5为例，设所述第一特异性引物组的各特异性引物分 别为:Nl、N2、N3、N4、N5，所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为:Ml、M2、M3、M4、M5，W特 异性引物的祀点与目标区域之间的距离为衡量标准，所述第一特异性引物组和所述第二特 异性引物组的各特异性引物之间的距离远近关系为：
[0062] 化〉化〉化〉N4〉化；
[0063] Mi>M2>M3>M4>M5 ；
[0064] 化〉Ml;
[00化]化〉M2;
[0066] 化〉M3;
[0067] N4〉M4;且 [006引化〉Ms，
[0069] 其中，所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组的各特异性引物的祀点， 与所述第一通用引物的祀点分别位于所述目标区域的两端，与所述第二通用引物的祀点位 于所述目标区域的同端。
[0070] 发明人惊奇地发现，本发明的引物组合物能够有效用于检测碎片化DNA目标区域。 具体地，利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，能够显著提高引 物扩增的适应范围和有效模板量，进而对富集产物进行测序检测，能够显著提高碎片化DNA 的检测灵敏度。从而，本发明的引物组合物尤其适于微量样本的碎片化DNA检测。
[0071 ]其中，利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集包括:利用 第一特异性引物组和第一通用引物对所述碎片化DNA进行第一PCR扩增，W便获得第一PCR 扩增产物;利用第二特异性引物组和第一通用引物对所述第一 PCR扩增产物进行第二PCR扩 增，W便获得第二PCR扩增产物；W及利用第一通用引物和第二通用引物对所述第二PCR扩 增产物进行第SPCR扩增，W便获得第SPCR扩增产物，则该第SPCR扩增产物即为富集产 物，后续构成所述碎片化DNA的目标区域检测文库。
[0072] 为方便理解，现对本发明设及的原理进行解释：
[0073] 针对本发明的特异性引物，简而言之，本发明的特异性引物组是两个同向延伸的 引物组。其中，图1示出了本发明的设计原理:假设基因组均匀断裂，※为待检的点突变、插 入、缺失位点;a为传统引物，可利用的模板为粗实线的碎片化DNA;b为本发明的引物，可利 用的模板为粗实线加细实线的碎片化DNA;由此可见，本发明设计的引物可利用的模板数远 高于传统方法。
[0074] 图2示出了突变位点检测原理。其中，bl为同向延伸的特异性引物，※为待检的点 突变、插入、缺失位点，实线方框为通用接头，b2为通用引物。由此可知，利用本发明的特异 性引物组进行PCR扩增，可W有效利用所有含有同向延伸引物的碎片化DNA作为模板，高于 传统PCR。
[0075] 图3示出了针对基因融合的检测原理。其中，左侧为A基因，右侧为B基因，A基因与B 基因交接处为融合位点，bl为同向延伸的特异性引物，实线方框为通用接头，b2为通用引 物。由此可知，利用本发明的特异性引物组进行PCR扩增，可W有效利用所有含有同向延伸 引物的碎片化DNA作为模板，高于传统PCR。
[0076] 也即，利用本发明的特异性引物组进行PCR扩增，因为能够显著提高可利用的DNA 模板量，从而能够提局检测的灵敏度。
[0077] 根据本发明的实施例，针对每一个特异性引物组，其包含的各特异性引物基于基 因组位置上的顺序依次间隔0-50对碱基对。由此，扩增效率高。
[0078] 根据本发明的实施例，化与化对应的基因组位置有重叠，化与M2对应的基因组位置 有重叠，N3与M3对应的基因组位置有重叠，N4与M4对应的基因组位置有重叠，化与Ms对应的基 因组位置有重叠，优选重叠0-20个碱基对。由此，扩增效果好。
[0079] 根据本发明的实施例，各特异性引物的GC含量均为30%-70%，时1值为55-68°C。由 此，扩增效果好。
[0080]需要说明的是，通用引物的具体序列不受特别限制，可基于后续使用的测序平台 选择，也即采用与测序平台配合使用的两条测序引物即可(分别构成测序文库的5'端和3' 端）。根据本发明的一些具体实施例，两条通用引物分别为：
[0081 ]第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:1);
[0082]第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID N0:2)。
[00削根据本发明的实施例，所述碎片化DM目标区域为EGFR基因19号外显子，且n = 2， 所述第一特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0084]化：TGCCAGTTAACGTCTTCCTTC(沈Q ID N0:3)，
[00 化]化：4了46664(：1'(：了6641^〇：46(沈9 10側：4);且
[0086] 所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0087] Mi:GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG(沈Q ID N0:5)
[008引 M2:TGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTA(SEQ ID N0:6)。由此，基于本发明的引物组合 物，能够有效对碎片化DNA的EGFR基因19号外显子区域进行扩增富集和测序检测，且可利用 模板量大、扩增效率高、特异性好好。
[0089] 根据本发明的实施例，所述碎片化DNA目标区域为EGFR基因20号外显子，且n = 2， 所述第一特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0090] 化：CCAGGAAGCCTACGTGATGGC(沈Q ID N0:7)，
[0091] 化：了666〔41'押6〇：1^4〇：了〇：(沈9 10側：8);且
[0092] 所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0093] Mi:GATGGCCAGCGTGGACAACCCCCA(沈Q ID N0:9)
[0094] ]?2:(：(：1'〔4(：(：1'此4此6了6〔46(：1'〔41'(569 10顯：10)。由此，基于本发明的引物组合 物，能够有效对碎片化DM的EGFR基因20号外显子区域进行扩增富集和测序检测，且可利用 模板量大、扩增效率高、特异性好。
[0095] 根据本发明的实施例，碎片化DNA的样本来源不受特别限制。根据本发明的一些具 体示例，所述碎片化DNA为选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹 水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA和刑侦样本DNA的至少之一。
[0096] 根据本发明的实施例，所述碎片化DNA的目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基 因融合突变的至少之一。由此，利用本发明的引物组合物扩增富集目标区域的序列后，富集 产物能够有效用于检测碎片化DNA目标区域的点突变、插入、缺失、基因融合突变。
[0097] 引物组合物的应用
[0098] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建碎片化DNA的目标区域检测文库的 方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的引物组合物，通过PCR扩增富集所述碎 片化DNA目标区域的序列。
[0099] 根据本发明的实施例，利用该方法能够有效构建碎片化DNA的目标区域检测文库。 并且，该方法利用前述的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，从而能够显著 提高引物扩增的适应范围和有效模板量，获得的富集产物即测序文库用于高通量测序后， 目标区域测序结果准确可靠，碎片化DNA的检测灵敏度高，且可重复性好。并且，该方法尤其 适于微量样本的碎片化DNA的目标区域测序文库构建。
[0100] 根据本发明的具体示例，所述方法包括W下步骤：
[0101] 利用第一特异性引物组和第一通用引物对所述碎片化DNA进行第一PCR扩增，W便 获得第一 PCR扩增产物；
[0102] 利用第二特异性引物组和第一通用引物对所述第一 PCR扩增产物进行第二PCR扩 增，W便获得第二PCR扩增产物；W及
[0103] 利用第一通用引物和第二通用引物对所述第二PCR扩增产物进行第SPCR扩增，W 便获得第SPCR扩增产物，所述第SPCR扩增产物构成所述碎片化DNA的目标区域检测文库。 由此，能够有效构建碎片化DNA的目标区域检测文库，且文库质量好，用于测序检测时灵敏 度高，获得的测序结果准确可靠。
[0104] 根据本发明的实施例，在进行所述第一PCR扩增之前，进一步包括:对所述碎片化 DNA依次进行末端修复、3'端加多聚腺嚷岭尾和接头连接。
[0105] 根据本发明的实施例，进一步包括将每个步骤的产物进行纯化。由此，获得的文库 质量好，有利于后续测序检测的进行。
[0106] 根据本发明的实施例，利用AmpmaqGokl:"60PCR Master Mix进行所述第一PCR 扩增和所述第二PCR扩增。由此，扩增效果好。
[0107] 根据本发明的实施例，所述第一 PCR扩增的反应程序为:95°C10分钟;20个循环:95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟;72 °C 7分钟;4 °C保存。由此，扩增效果好。
[0108] 根据本发明的实施例，所述第二PCR扩增的反应程序为:95°C 10分钟；15个循环:95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟;72 °C 7分钟;4 °C保存。由此，扩增效果好。
[0109] 其中，碎片化DNA的样本来源不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所述碎片 化DNA为选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化 石DNA、石蜡包埋DNA和刑侦样本DNA的至少之一。
[0110] 根据本发明的实施例，所述碎片化DNA的目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基 因融合突变的至少之一。由此，构建获得的碎片化DNA目标区域测序文库，能够有效用于检 测目标区域的点突变、插入、缺失、基因融合突变。
[0111] 在本发明的第Ξ方面，本发明提出了一种确定碎片化DNA目标区域序列信息的方 法。根据本发明的实施例，该方法包括：
[0112] 根据前面所述的构建碎片化DNA的目标区域检测文库的方法，构建所述碎片化DNA 的目标区域检测文库；
[0113] 对所述碎片化DNA的目标区域检测文库进行测序，W便获得测序结果；W及
[0114] 基于所述测序结果，确定所述碎片化DNA目标区域的序列信息。
[0115] 发明人发现，利用该方法能够有效确定碎片化DNA目标区域序列信息。并且，基于 前述利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增富集，从而显著了提高引 物扩增的适应范围和有效模板量，且有效提高了扩增效果扩增特异性，进而获得的富集产 物用于高通量测序后，目标区域测序结果准确可靠，碎片化DNA的检测灵敏度高，且可重复 性好。并且，该方法尤其适于微量样本的碎片化DNA检测，在科学研究及生产应用方面均意 义重大，适于推广。
[0116] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建碎片化DNA目标区域检测文库的装 置。根据本发明的实施例，该装置利用前述的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进行扩增 富集，从而能够显著提高引物扩增的适应范围和有效模板量，获得的富集产物即测序文库 针对目标区域的特异性好，进而用于高通量测序后，目标区域测序结果准确可靠，碎片化 DNA的检测灵敏度高，且可重复性好。并且，该装置尤其适于微量样本的碎片化DNA的目标区 域测序文库构建。
[0117] 下面参照图4,对本发明的构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置100进行详细 解释。
[0118] 根据本发明的实施例，该装置设置有前面所述的引物组合物，参照图4,所述装置 100包括:第一 PCR扩增单元10、第二PCR扩增单元20和第SPCR扩增单元30。
[0119] 根据本发明的实施例，第一PCR扩增单元10用于利用第一特异性引物组和第一通 用引物对所述碎片化DNA进行第一PCR扩增，W便获得第一PCR扩增产物;第二PCR扩增单元 20与第一 PCR扩增单元10相连，用于利用第二特异性引物组和第一通用引物对所述第一 PCR 扩增产物进行第二PCR扩增，W便获得第二PCR扩增产物;第SPCR扩增单元30与第二PCR扩 增单元20相连，用于利用第一通用引物和第二通用引物对所述第二PCR扩增产物进行第Ξ PCR扩增，W便获得第SPCR扩增产物，所述第SPCR扩增产物构成所述碎片化DNA的目标区 域检测文库。
[0120] 根据本发明的实施例，进一步包括预处理单元，所述预处理单元与所述第一 PCR扩 增单元相连，用于在进行所述第一 PCR扩增之前，对所述碎片化DNA依次进行末端修复、3 '端 加多聚腺嚷岭尾和接头连接。
[0121] 根据本发明的实施例，进一步包括多个纯化单元，用于分别将前述每个单元得到 的产物进行纯化。由此，获得的文库质量好，有利于用于测序检测。
[0122] 根据本发明的实施例，第一PCR扩增单元10与第二PCR扩增单元20中均设置有 AmpliTaqGold?360PCR Master Mix,用于利用AmpliTaqGold@360PCR Master Mix分别进 行所述第一 PCR扩增和所述第二PCR扩增。
[0123] 根据本发明的实施例，第一PCR扩增单元10适于按照W下反应程序进行所述第一 PCR扩增:95 °C 10分钟；20个循环:95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟；72 °C 7分钟;4 °C保存。由 此，扩增效果好。
[0124] 根据本发明的实施例，第二PCR扩增单元20适于按照W下反应程序进行所述第二 PCR扩增:95 °C 10分钟；15个循环:95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟；72 °C 7分钟;4 °C保存。由 此，扩增效果好。
[0125] 根据本发明的实施例，碎片化DNA的样本来源不受特别限制。根据本发明的一些实 施例，所述碎片化DNA为选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水 DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA和刑侦样本DNA的至少之一。
[0126] 根据本发明的实施例，所述碎片化DNA的目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基 因融合突变的至少之一。由此，构建获得的碎片化DNA目标区域测序文库，能够有效用于检 测目标区域的点突变、插入、缺失、基因融合突变。
[0127] 在本发明的第五方面，本发明提出了一种确定碎片化DNA目标区域序列信息的系 统1000。根据本发明的实施例，参照图5,该系统1000包括:构建碎片化DNA目标区域检测文 库的装置100、测序装置200和序列确定装置300。
[0128] 发明人惊奇地发现，该系统利用本发明的引物组合物对碎片化DNA的目标区域进 行扩增富集，从而显著了提高引物扩增的适应范围和有效模板量，且有效提高了扩增效果 扩增特异性，进而获得的富集产物用于高通量测序后，不仅能够有效确定碎片化DNA目标区 域的序列信息，且测序结果准确可靠，检测灵敏度高，可重复性好。并且，该系统尤其适于微 量样本的碎片化DNA检测，在科学研究及生产应用方面均意义重大，适于推广。
[0129] 下面参照图5,对本发明的确定碎片化DNA目标区域序列信息的系统1000进行详细 解释。
[0130] 根据本发明的实施例，构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置100，用于构建所 述碎片化DNA的目标区域检测文库;测序装置200与构建碎片化DNA目标区域检测文库的装 置100相连，用于对所述碎片化DNA的目标区域检测文库进行测序，W便获得测序结果;序列 确定装置300与测序装置200相连，用于基于所述测序结果，确定所述碎片化DNA目标区域的 序列信息。
[0131] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译 的《分子克隆实验指南》，第Ξ版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器 未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品，例如可W采购自Illumina公司。
[0132] 实施例1
[0133] 1.接头设计
[0134] Pre1ib-ADT-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCTQ 为 index区），
[0135] Pre1ib-ADT-AS:pGATCGGAAGAGC，
[0136] W上序列需要退火成双链。
[0137] 连接后产物结构：
[0138] Top:5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0139] Bottom:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0140] 针对EGFR的19号外显子设计同向延伸特异性引物。
[0141 ] EGFR19号外显子序列如下：
[0142] GGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA AGCCAACAAGGAAATCCTCGAT(沈Q ID N0:11)，
[0143] EGFR19号外显子及其上下游内含子区序列如下：
[0144] CAGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAA CATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT AGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG AAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCAC CTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTT TCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTAT(沈Q ID N0:12)，
[0145] 同向延伸特异性引物序列如下，其中，
[0146] 第一特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0147] 化：TGCCAGTTAACGTCTTCCTTC(沈Q ID N0:3)，
[014引 化：ATAGGGACTCTGGATCCCAG(沈Q ID N0:4)，
[0149]第二特异性引物组的各特异性引物分别为：
[01 加 ]Mi:GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG(沈Q ID N0:5)
[0151] M2:TGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTA(沈Q ID N0:6)，
[0152] 通用引物序列如下：
[0153] 第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:1);
[0154] 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID N0:2)。
[0巧日]2.取2ml正常人血浆，提取游离DM。
[0156] 3.游离DM末端修复
[0157] 配制如下反应：
[015引 表1
[0159]
[0160] PCR仪上20°C溫浴30分钟。
[0161] 使用120μ1 Ampure XP beads进行纯化，3化 1 Elution Buffer洗脱。
[0162] 4.3'端加多聚腺嚷岭尾
[0163] 配制如下反应：
[0164] 表2 [01 化]
[0166] PCR仪上37°C溫浴30分钟。
[0167] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，10μ1 Elution Buffer洗脱。
[016引 5.连接接头
[0169] 配制如下反应：
[0170] 表3
[0171]
[0172]
[0173] PCR仪上20°C溫浴15分钟。
[0174] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，2化 1 Elution Buffer洗脱。
[0175] 6.目标区域预富集(即第一PCR扩增）
[0176] 配制如下反应：
[0177] 表4
[0178] __
[0179] PCR程序如下：
[0180] a)95°C 10 分钟；
[0181] b) 20循环程序如下：
[0182] 95°C 30秒
[0183] 62°C 30秒
[0184] 72°C 1 分钟
[01 化]c)72°C 7分钟
[0186] d)4°C 保存。
[0187] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，2化 1 Elution Buffer洗脱。
[01则 7.目标区域特异性富集(即第二PCR扩增）
[0189] 配制如下反应：
[0190] 表5 「01011 L0192J PCR括巧如 h:
[0193] a)95°C 10 分钟；
[0194] b) 15循环程序如下：
[0195] 95°C 30秒
[0196] 62°C 30秒
[0197] 72°C 1 分钟
[019引 c)72°C 7分钟
[0199] d)4°C 保存。
[0200] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，20μ1 Elution Buffer洗脱。
[020。 8.通用引物扩增（即第SPCR扩增）
[0202] 配制如下反应：
[020；3]表 6 Γ02041
[0205] PCR程序如下：
[0206] e)98°C 45秒；
[0207] f) 10循环程序如下：
[020引 98°C 15秒
[0209] 60°C 30秒
[0210] 72°C 30秒 g)72°C 1 分钟
[0212] h)4°C 保存。
[0213] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，30μ1 Elution Buffer洗脱。
[0214] 取其中化1纯化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图6。
[021日]最终文库经过巧光定量PCR质控后，进行Illumina公司化xtSeqSOO进行75bp双端 测序。
[0216]将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，用于评估文库的特异性， 分析结果见表7。
[0^7]表 7 [021 引
[0219] 结果表明，本发明的技术方案能够成功地对碎片化DNA的目标区域进行特异性检 测。
[0220] 实施例2
[0221] 1.接头设计
[0222] Pre1ib-ADT-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCTQ 为 index区），
[0223] Prelib-ADT-AS:pGATCGGAAGAGC，
[0224] W上序列需要退火成双链。
[02巧]连接后产物结构：
[0226] Top:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0227] Bottom:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[022引针对EGFR的20号外显子T790M点突变设计同向延伸特异性引物。
[0229] EGFR20号外显子序列如下：
[0230]
[0233] 同向延伸特异性引物序列如下，其中，
[0234] 第一特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0235] 化：CCAGGAAGCCTACGTGATGGC(沈Q ID N0:7)，
[0236] 化：TGGGCATCTGCCTCACCTCC(沈Q ID N0:8)，
[0237] 第二特异性引物组的各特异性引物分别为：
[0238] Mi:GATGGCCAGCGTGGACAACCCCCA(沈Q ID N0:9)
[0239] M2:CCTCACCTCCACCGTGCAGCTCAT(沈Q ID N0:10)，
[0240] 通用引物序列如下：
[0241] 第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:1);
[0242] 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(沈Q ID N0:2)。
[0243] 2.样本采集
[0244] 本实施例采用3个样本，其中2个样本(E20-l，E20-2)已经数字微滴PCR检测在目标 区域含有不同比例的点突变T790M突变ΓΤ790Μ突变'表示:EGFR的20号外显子第790氨基酸 位点由苏氨酸Thr突变为甲硫氨酸Met)，突变频率分别为6.91 %和0.087 % ; 1个样本化20- 3)在目标区域为野生型，即突变频率为0。
[0245] 针对每个样本，各取4ml血浆，且分别提取游离DNA2份，其中一份备用，用于对照组 实验。
[0246] 3.游离DNA末端修复
[0247] 配制如下反应：
[024引 表8
[0249]
[02加 ]PCR仪上20°C溫浴30分钟。
[0巧 1]使用120μ1 Ampure XP beads进行纯化，3化 1 Elution Buffer洗脱。
[0252] 4.3'端加多聚腺嚷岭尾
[0巧3] 配制如下反应：
[0巧4] 表9
[0 巧5]
[0256]~PCR 仪上 37 °C 溫浴 30 分钟。
' '
[0巧7]使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，10μ1 Elution Buffer洗脱。
[0258] 5.连接接头
[0259] 配制如下反应：
[0260] 表10
[0261] 惦62] PCR仪上20°C溫浴15分钟。
[0%3]使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，2化 1 Elution Buffer洗脱。
[0264] 6.目标区域预富集(即第一PCR扩增）
[02化]配制如下反应：
[0%6]表11 Γη9Α7?
[0%引 PCR程序如下：
[0269] e)95°C 10 分钟；
[0270] f) 20循环程序如下：
[0271] 95°C 30秒
[0272] 62°C 30秒
[0273] 72°C 1 分钟
[0274] g)72°C 7分钟
[0275] h)4°C 保存。
[0276] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，2化 1 Elution Buffer洗脱。
[0277] 7.目标区域特异性富集(即第二PCR扩增）
[027引配制如下反应：
[0279] 表12
[0280]
[0281]
[0282] PCR程序如下：
[0283] i)95°C 10 分钟；
[0284] j) 15循环程序如下：
[0285] 95°C 30秒
[0286] 62°C 30秒
[0287] 72°C 1 分钟
[028引 k)72°C 7分钟
[0289] 1)4°C 保存。
[0巧0]使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，20μ1 Elution Buffer洗脱。 [02川 8.通用引物扩增（即第SPCR扩增）
[0292] 配制如下反应：
[0巧3] 表13
[0294]
[0295] ~PCR程序如下:
' '
[0巧6] m)98°C 45秒；
[0巧7] η) 10循环程序如下：
[029引 98°C 15秒
[0299] 60°C 30秒
[0300] 72°C 30秒
[030U o)72°C 1 分钟
[0302] p)4°C 保存。
[0303] 使用60μ1 Ampure XP beads进行纯化，30μ1 Elution Buffer洗脱。
[0304] 取其中化1纯化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图7。
[03化]最终文库经过巧光定量PCR质控后，进行Illumina公司化xtSeqSOO进行75bp双端 测序。
[0306] 将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，用于评估文库的特异性， 分析结果见表14。
[0307] 表14
[030引
[0309]
[0310] 对目标区域数据进行进一步分析，评估T790M突变检测的灵敏性，分析结果见表 15。
[0：311]表 15 [0312]
[0313] 9.对照组实验--ARMS法检测
[0314] 其中对照组使用北京蠢诺美迪基因检测技术有限公司的EGFR基因突变检测试剂 盒(PCR-巧光探针法），货号：SMD-02-041，对3个样本的另一份血浆DNA溶液的T790M的突变 情况进行检测。检测结果见表16。
[0315] 表16
[0316]
[0317] 表16的结果中，ACt《8定义为突变型，突变含量为l%-100%;ACt〉8定义为野生 型，或突变低于1 %。
[0318] 结果表明，本发明的技术方案相较于目前常用的DNA突变检测方法及技术（例如 ARMS法)具有灵敏度更高的优势，在ARMS法仅仅能够检测高于1 %的突变的情况下，本发明 的技术方案能够检测突变频率低至甚至低于0.1 %的碎片化DNA。
[0319] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可W在任何 的一个或多个实施例或示例中W合适的方式结合。
[0320] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可W理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可W对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种用于检测碎片化DNA目标区域的引物组合物，其特征在于，包括： 第一引物组，所述第一引物组包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物 和所述第二通用引物的靶点位于所述目标区域的两端，分别用于构成测序文库的5'端和3' 端；以及 第二引物组，所述第二引物组包括第一特异性引物组和第二特异性引物组， 其中， 所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组均包含η条目标区域特异性引物，且 所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组必须满足下列条件： (1) 所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组的各特异性引物均同向延伸，靶 点均位于所述碎片化DNA目标区域的5 '端或3 '端； (2) η = 1-5的任意整数，以η = 5为例，设所述第一特异性引物组的各特异性引物分别 为:N1、N2、N3、Ν4、N 5，所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为:M1、M2、M3、Μ4、M 5，以特异 性引物的靶点与目标区域之间的距离为衡量标准，所述第一特异性引物组和所述第二特异 性引物组的各特异性引物之间的距离远近关系为： Νι>Ν2>Ν3>Ν4>Ν5 ； Μι>Μ2>Μ3>Μ4>Μ5 ； Νι>Μι ； Ν2>Μ2 ； Ν3>Μ3 ； Ν4>Μ4;且 Ν5>Μ5， 其中，所述第一特异性引物组和所述第二特异性引物组的各特异性引物的靶点，与所 述第一通用引物的靶点分别位于所述目标区域的两端，与所述第二通用引物的靶点位于所 述目标区域的同端。2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，针对每一个特异性引物组，其包含的各 特异性引物基于基因组位置上的顺序依次间隔0-50对碱基对， 任选地，见与％对应的基因组位置有重叠，N2与M2对应的基因组位置有重叠，Ν3与M3对应 的基因组位置有重叠，Ν4与Μ4对应的基因组位置有重叠，他与此对应的基因组位置有重叠， 优选重叠0-20个碱基对， 任选地，各特异性引物的GC含量均为30 % -70 %，Tm值为55-68 °C。3. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，两条通用引物分别为： 第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO: 1); 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID N0:2)， 任选地，所述碎片化DNA目标区域为EGFR基因19号外显子，且η = 2，所述第一特异性引 物组的各特异性引物分别为： Ni：TGCCAGTTAACGTCTTCCTTC(SEQ ID N0：3), N2:ATAGGGACTCTGGATCCCAG(SEQIDN0:4);且 所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为： Mi：GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG(SEQ ID NO：5) M2：TGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTA(SEQ ID NO:6), 任选地，所述碎片化DNA目标区域为EGFR基因20号外显子，且n = 2，所述第一特异性引 物组的各特异性引物分别为： Ni：CCAGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQ ID NO：7), N2:TGGGCATCTGCCTCACCTCC(SEQ ID N0:8);且 所述第二特异性引物组的各特异性引物分别为： Mi：GATGGCCAGCGTGGACAACCCCCA(SEQ ID NO：9) M2：CCTCACCTCCACCGTGCAGCTCAT(SEQ ID NO：10), 任选地，所述碎片化DNA为选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水 DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA和刑侦样本DNA的至少之一， 任选地，所述碎片化DNA的目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少 之一。4. 一种构建碎片化DNA的目标区域检测文库的方法，其特征在于， 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物，通过PCR扩增富集所述碎片化DNA目标区 域的序列。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括： 利用第一特异性引物组和第一通用引物对所述碎片化DNA进行第一 PCR扩增，以便获得 第一 PCR扩增产物； 利用第二特异性引物组和第一通用引物对所述第一 PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以 便获得第二PCR扩增产物；以及 利用第一通用引物和第二通用引物对所述第二PCR扩增产物进行第三PCR扩增，以便获 得第三PCR扩增产物，所述第三PCR扩增产物构成所述碎片化DNA的目标区域检测文库， 任选地，在进行所述第一 PCR扩增之前，进一步包括： 对所述碎片化DNA依次进行末端修复、3 '端加多聚腺嘌呤尾和接头连接， 任选地，进一步包括将每个步骤的产物进行纯化， 任选地，利用AmpliTaqGold?360PCR Master Mix进行所述第一PCR扩增和所述第二PCR 扩增， 任选地，所述第一 PCR扩增的反应程序为： 95 °C 10 分钟； 20 个循环：95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分钟； 72 °C 7分钟； 4°C保存， 任选地，所述第二PCR扩增的反应程序为： 95 °C 10 分钟； 15 个循环:95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分钟； 72 °C 7分钟； 4°C保存。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碎片化DNA为选自血浆DNA、尿液DNA、 汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA和刑侦样本 DNA的至少之一， 任选地，所述碎片化DNA的目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少 之一。7. -种确定碎片化DNA目标区域序列信息的方法，其特征在于，包括： 根据权利要求4-6任一项所述的方法，构建所述碎片化DNA的目标区域检测文库； 对所述碎片化DNA的目标区域检测文库进行测序，以便获得测序结果；以及 基于所述测序结果，确定所述碎片化DNA目标区域的序列信息。8. -种构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置，其特征在于，设置有权利要求1-3任 一项所述的引物组合物，所述装置包括： 第一 PCR扩增单元，所述第一 PCR扩增单元用于利用第一特异性引物组和第一通用引物 对所述碎片化DNA进行第一PCR扩增，以便获得第一PCR扩增产物； 第二PCR扩增单元，所述第二PCR扩增单元与所述第一 PCR扩增单元相连，用于利用第二 特异性引物组和第一通用引物对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二 PCR扩增产物；以及 第三PCR扩增单元，所述第三PCR扩增单元与所述第二PCR扩增单元相连，用于利用第一 通用引物和第二通用引物对所述第二PCR扩增产物进行第三PCR扩增，以便获得第三PCR扩 增产物，所述第三PCR扩增产物构成所述碎片化DNA的目标区域检测文库。9. 根据权利要求8所述的装置，其特征在于，进一步包括预处理单元，所述预处理单元 与所述第一 PCR扩增单元相连，用于在进行所述第一 PCR扩增之前，对所述碎片化DNA依次进 行末端修复、3 '端加多聚腺嘌呤尾和接头连接， 任选地，进一步包括多个纯化单元，用于分别将每个单元得到的产物进行纯化， 任选地，所述第一 PCR扩增单元与所述第二PCR扩增单元中均设置有Ampl iTaqGold? 360PCR Master Mix，用于利用AmpliTaqGo丨d?360PCR Master Mix分别进行所述第一PCR 扩增和所述第二PCR扩增， 任选地，所述第一 PCR扩增单元适于按照以下反应程序进行所述第一 PCR扩增： 95 °C 10 分钟； 20 个循环：95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分钟； 72 °C 7分钟； 4°C保存， 任选地，所述第二PCR扩增单元适于按照以下反应程序进行所述第二PCR扩增： 95 °C 10 分钟； 15 个循环:95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分钟； 72 °C 7分钟； 4°C保存， 任选地，所述碎片化DNA为选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水 DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA和刑侦样本DNA的至少之一， 任选地，所述碎片化DNA的目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少 之一。10. -种确定碎片化DNA目标区域序列信息的系统，其特征在于，包括： 权利要求8或9所述的构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置，用于构建所述碎片化 DNA的目标区域检测文库； 测序装置，所述测序装置与所述构建碎片化DNA目标区域检测文库的装置相连，用于对 所述碎片化DNA的目标区域检测文库进行测序，以便获得测序结果；以及 序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定 所述碎片化DNA目标区域的序列信息。
【文档编号】C12N15/11GK106011230SQ201610307184
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王永利, 宋卓, 袁梦兮
【申请人】人和未来生物科技（长沙）有限公司