一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，为确定与肉牛生长发育性状相关的SNPs位点，选留优势基因型个体组建核心群，加快肉牛新品种培育提供分子生物学依据。它包括如下步骤：血样的采集，基因组DNA提取及检测，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，GH基因不同基因型个体的测序，GH基因不同位点的遗传特性指标，GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析。本发明采用PCR?SSCP方法和DNA测序技术检测早胜牛GH基因第2外显子和第5外显子的单核苷酸多态性。本发明建立了适用于一般分子生物学研究需要，能够快速、低成本、准确检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，可为开展其它基因的多态性研究提供参考。
【专利说明】
-种检测早胜牛GH基因单核昔酸多态性的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种检测早胜牛GH基因单核巧酸多态性的 方法。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学技术的快速发展，从分子水平上探索物种的遗传结构、遗传多样 性及系统发育关系，已成为群体遗传学和进化生物学研究的一个重要领域。运不仅对保护 和开发具有优良特性的地方品种具有重要的现实意义，也使得应用分子标记辅助选择技术 选育新品种成为可能。
[0003] 与常规育种方法相比，分子育种技术克服了传统杂交选择法的各种缺陷和年龄、 性别、组织W及环境因素的影响，具有高效快速育种的特点，是当前动物遗传育种领域的研 究热点。应用分子育种技术，首先要研究确定与动物经济性状相关的重要功能基因及单核 巧酸多态性位点(简称为SNPs )。
[0004] 目前，检测SNPs的方法主要有DNA测序、PCR-R化P(限制性长度多态性XPCR-RAPD (随机扩增多态性XPCR-SSCP(单链构象多态性)等，在上述检测技术中， DNA测序法虽然检测灵敏度较高，但往往要进行全基因组测序，成本昂贵;并且需要购 置专业的测序仪，不适用于一般分子生物学研究的需要。PCR-RFLP技术操作繁琐，通常需要 根据不同DNA序列的突变选择较多的限制性内切酶，试验成本较高。PCR-RATO技术在应用中 由于引物是随机合成的，受外界环境条件影响较大，并且检测结果不能判断基因型个体是 纯合型还是杂合型。而PCR-SSCP技术因其操作简便、灵敏度高、成本低，是筛选基因突变和 检测基因单核巧酸多态性的有效手段之一;但常规的PCR-SSCP检测方法仍存在操作步骤较 多，试验过程较长，条件不稳定等不足之处，需要在实践中对反应条件进行优化和改进，才 能获得最佳的试验效果。
[0005] 生长激素化H)是由脑垂体分泌的一种具有广泛生理功能的多肤类激素，对脊椎动 物的骨骼生长及分化，糖类、蛋白质及脂肪代谢具有重要的调节作用，是研究畜禽生长发育 性状的重要候选基因。现阶段研究主要集中在GH基因遗传结构上，但在基因多态性和经济 性状的相关性方面报道不多，与分子标记辅助选择技术的应用还有一定差距。早胜牛作为 秦川牛的优秀类群之一，在分子水平上开展早胜牛GH基因遗传多态性研究，对其遗传改良 和种质资源创新是非常必要的，可为选育甘肃现代肉牛新品种提供理论基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种在实验条件下操作简便、反应条件稳定、成本较低的快 速检测早胜牛GH基因单核巧酸多态性的方法。
[0007] 本发明方法为确定与肉牛生长发育性状相关的SNPs位点，选留优势基因型个体组 建核屯、群，加快肉牛新品种培育提供分子生物学依据。
[000引本发明采取如下技术方案:一种检测早胜牛GH基因单核巧酸多态性的方法，包括 如下步骤：（1)血样的采集:采集早胜牛血样；（2)基因组DM提取及检测:采用细胞裂解-核 裂解两步法提取的早胜牛血液基因组DNA，将冷冻血样室溫解冻后，吸取500UL至 1.5mLEppendorf管，加入800uL细胞裂解液充分混匀，在eOOOrpm转速下离屯、2min;倒掉上清 液，加入800uL细胞裂解液充分混匀，600化pm转速下离屯、2min，出现白色沉淀;加入200uL核 裂解液充分混匀，静置2min后再加入lOOuL饱和氯化钢和300uL氯仿充分混匀，600化pm转速 下离屯、8min;吸取上清液200uL，加入600uL无水乙醇充分混匀后，12000巧m转速下离屯、 2min;倒掉上清液，室溫下使乙醇挥发干净;待乙醇挥发完全后，加入50uL超纯水溶解，用质 量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度;和紫外分光光度计检测其浓度；（3)PCR扩增:分 别在GH基因第2外显子和第5外显子设计1对引物，PCR反应体系按照梯度试验进行优化;PCR 反应程序为:根据引物序列中G+C含量初步确定退火溫度的大致范围，然后从低溫向高溫设 置梯度试验;首先，保持其他条件不变，将某个条件作为参数设置不同梯度，检测PCR扩增效 果;然后再对其他条件依次设置梯度，反复试验，最终确定最佳反应体系；为了确保试验结 果的可靠性，可同时对几个样品进行重复试验。（4)、聚丙締酷胺凝胶电泳，巧）、GH基因不同 基因型个体的测序，（6)、GH基因不同位点的遗传特性指标:利用化pGen32软件计算GH基因 第2外显子和第5外显子的基因型频率、等位基因频率和多台信息含量；（7)XH基因不同基 因型与生长发育性状的关联性分析。
[0009] 作为本发明的进一步改进，一种检测早胜牛GH基因单核巧酸多态性的方法，细胞 裂解液组成为薦糖llOg、浓度为lOmmol/L的Tris-肥1缓冲325血、MgCl2-6出0为Ig和体积浓 度为1%的聚乙二醇辛基苯基酸1 OmL。
[0010] 作为本发明的进一步改进，核裂解液组成为浓度为lOmmol/L的Tris-HCl缓冲液 1.57g、乙二胺四乙酸3.75g、十二烷基硫酸钢1 Og和巧樣酸钢2.94g。
[0011] 作为本发明的进一步改进，步骤3中PCR反应程序为:根据引物序列中G+C含量初步 确定退火溫度的大致范围，然后从低溫向高溫设置梯度试验，每个梯度范围为〇.5°C-rC， 变性溫度、延伸溫度一般分别设置为94°C和72°C即可，变性、退火和延伸时间为 30sec-Imin。
[0012] 作为本发明的进一步改进，步骤3中PCR扩增结束后，取扩增后的DM产物化L与化L 的Loadin浊uff er缓冲液充分混合后，点样于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上，100V 电压电泳20min后用紫外凝胶成像仪观察。
[0013] 常见的聚丙締酷胺凝胶染色方法为银染法，共4步（固定、染色、显色、终止），染色 时间较长，耗时30min左右。作为本发明的进一步改进，采用银染法:上述步骤4中聚丙締酷 胺凝胶电泳具体步骤为:先用超纯水冲洗凝胶2次，随后加入染色液轻摇lOmin，然后倒掉染 色液，双蒸水清洗凝胶2次，再加入显色液轻摇8min，待条带清晰后，停止显影反应并照相保 存。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述步骤(7)具体是根据不同基因型与生长发育性状， 建立最小二乘线性模型： ;yi'jkinn= M· +FariTii+Bre'edj+A：臣 ek+'Sexnrl"Maxkern+e'i jkran 其中：yijkm为伞体表型记黑Farmi.为场别效应；Breedj为.品种魏应；.Agek 为年龄效应；Sexnt为牲别.效应.；M'arkern.为标记基困型效应;..ei化m为随机误差.； 运用SPSS19.0软件的GLM(GeneralLinearModel)对生产数据进行统计分析，并运用最 小二乘法拟合线性模型对不同基因型群体间进行差异显著性检验。
[001引本发明采用PCR-SSCP方法和DNA测序技术检测早胜牛細基因第2外显子和第5外显 子的单核巧酸多态性。W早胜牛血液全基因组DNA为模板，W引物对P1、P2为引物，PCR扩增 GH基因特定序列;对检测合格的PCR扩增产物进行中性聚丙締酷胺凝胶电泳;根据中性聚丙 締酷胺凝胶电泳结果进行基因型判型和测序，确定GH基因第2外显子和第5外显子的SNPs位 点；对不同基因型个体与生长发育性状(体重、体高、体长、胸围、肉用指数等）进行关联分 析。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有W下技术效果： 1、对PCR-SSCP检测流程中DNA提取方法和凝胶染色方法进行了优化，采用本发明建立 的"细胞裂解-核裂解两步法"提取血液基因组DNA，与传统的酪一氯仿抽提法、试剂盒提取 法等相比，提高了 DNA浓度和纯度，0D260/0D280值为1.90，且操作简便，耗时仅需20min，成 本较低；改进后的凝胶染色法，由4步简化为染色和显色2步，减少了试验耗材，染色时间也 缩短至lOmin。
[0017] 2、建立了适用于一般分子生物学研究需要，能够快速、低成本、准确检测早胜牛GH 基因单核巧酸多态性的方法，可为开展其它基因的多态性研究提供参考； 3、 与NCBI公布的黄牛核巧酸序列化enebank:M57764)进行比较，发现GH基因第2外显子 存在2处SNPs，第5外显子存在3处SNPs，多态性较为丰富； 4、 应用本发明提供的检测方法对GH基因不同基因型与生长发育性状进行关联分析，结 果表明GH基因第2外显子和第5外显子可W作为早胜牛早期生长发育性状选育的标记位点。
【附图说明】
[0018] 图1为采用细胞裂解-核裂解两步法提取的血液基因组DNA电泳检测图； 图2为P1引物扩增的PCR产物电泳检测图； 图3为P2引物扩增的PCR产物电泳检测图； 图4为P1引物扩增片段的聚丙締酷胺凝胶电泳检测图； 图5为P2引物扩增片段的聚丙締酷胺凝胶电泳检测图； 图6为P1引物扩增片段的基因型个体测序图； 图7为P2引物扩增片段的基因型个体测序图。
【具体实施方式】
[0019] 下面的实施例可从进一步说明本发明，但不从任何方式限制本发明。
[0020] 术语解释:PCR-SSCP:单链构象多态性，即在中性聚丙締酷胺凝胶中，相同长度的 单链DNA因其序列不同或单个碱基差异，所形成的构象不同，从而出现泳动变位，通过显色 在凝胶上显示出带型的差别，表现出多态性。
[0021] GH基因：由191个氨基酸组成，含5个外显子和4个内含子，分子量为22kDa，链内含 有4个Cys组成两个二硫键。
[0022] 下述实验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法;所用器材、试剂均为从 试剂公司购买的常规试剂及器材。
[0023] 实施例1 1、血样的采集 采用静脉采血法从庆阳市宁县兴旺牧业有限责任公司采集早胜牛血样186份，装入一 次性使用真空采血管(购自江苏宇力医疗器械有限公司），并保存于超低溫冰箱(产品型号： BCD-796WBCN，保存溫度:-20°C)，样品编号依次为1-186。
[0024] 2、基因组DNA提取及检测 图1为采用细胞裂解-核裂解两步法提取的早胜牛血液基因组DNA，可W看出DNA条带清 晰，无任何杂带。具体提取方法为:将冷冻血样室溫解冻后用移液器吸取500UL至1.5mL微量 离屯、管化ppendo计管），加入800uL细胞裂解液(配方参见表1)充分混匀，600化pm离屯、2min; 倒掉上清液，加入800uL细胞裂解液充分混匀，600化pm离屯、2min，出现白色沉淀;加入200uL 核裂解液(配方参见表1)充分混匀，静置2min后再加入lOOuL饱和氯化钢和300uL氯仿充分 混匀，6000巧m离屯、8min;吸取上清液200uL，加入600uL无水乙醇充分混匀后，12000rpm离屯、 2min;倒掉上清液，室溫下使乙醇挥发干净;待乙醇挥发完全后，加入50uL超纯水溶解，用质 量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度;和紫外分光光度计检测其浓度。
[0025] 结果表明，细胞裂解-核裂解两步法提取的DNA浓度较高，0D260/0D280值为1.90， 且用时仅需20min，操作步骤简便，不需要使用蛋白酶K进行消化过夜，成本较低，能够满足 一般实验室的要求。
[0026] 注：（1) Sugarcan为薦糖，邸TA为乙二胺四乙酸，sodium citrate为巧樣 酸钢，SDS为十二烷基硫酸钢，Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基酸； (2) 10mmol/ L Tris-HCl缓冲液:将 1.21 g Tris溶解于800 mL超纯水 中，加入肥1调节pH值至8.0,定容至1000血； (3) 配置方法为按照上表用量加入各成分定容至1 L，调节PH值至8.0。
[0027] (4)其它试剂均为常规试剂，购自甘肃瑞德生物科技有限公司。
[0028] 3、PCR 扩增 参考NCBI上公布的黄牛GH基因核巧酸序列（Genebank:M57764)，采用化imeS.O软件分 另化GH基因第2外显子和第5外显子设计1对引物，引物序列见表2。
[0029] PCR反应体系按照梯度试验进行优化。首先，保持其他条件不变，将某个条件（如 DNA模版体积)作为参数设置不同梯度，检测PCR扩增效果；然后再对其他条件依次设置梯 度，反复试验，最终确定最佳反应体系，为了确保试验结果的可靠性，可同时对几个样品进 行重复试验。PCR反应体系见表3。
[0030] 注:2Xloadingbuffer、化qDNA聚合酶购自甘肃瑞德生物科技有限公司，引物由北 京Ξ博远志生物技术有限公司合成。
[0031] PCR反应程序为:根据引物序列中G+C含量初步确定退火溫度的大致范围，然后从 低溫向高溫设置梯度试验，每个梯度范围为〇.5°C-rC，变性溫度、延伸溫度一般分别设置 为94°C和72°C即可，变性、退火和延伸时间一般为30sec-Imin即可。优化后的PCR反应程序 见表4。
[0032] PCR扩增结束后，取扩增后的DNA产物化L与化化oadingBuffer缓冲液充分混合后， 点样于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上，100V电压电泳20min后用紫外凝胶成像仪观察结果。 图2为PI引物扩增的PCR产物电泳检测图，其中，泳道1-6为PCR扩增产物，泳道7为 MarkerD2000(自下向上片段大小依次为 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp);图3 为P2引物扩增的PCR产物电泳检测图，其中，泳道1-5为PCR扩增产物，泳道6为MarkerD2000 (自下向上片段大小依次为10化P、25化p、50化p、75化p、1000bp、200化P)。从上述图例中可 W看出，对PCR反应条件进行优化后，扩增后的PCR产物条带清晰，且扩增条带与目的条带大 小一致，表明达到了预期效果。
[0033] 4、聚丙締酷胺凝胶电泳 将清洗干燥后的玻璃板和胶条用水粘合后，放在桌子上备用;在50πι1Ξ角瓶内依次加 入丙締酷胺、5 X ΤΒΕ、10%ΑΡ、ΤΕΜ邸和超纯水，混匀后缓慢倒入已放置好的玻璃板之间；倒好 凝胶后插入梳子，观察凝胶聚合情况，随时补加不足的丙締酷胺;凝胶聚合后缓慢拔掉梳 子，用注射器针冲洗点样孔，然后将玻璃板转到电泳槽上用铁夹固定，在上、下槽中分别倒 入1 ΧΤΒΕ缓冲液（取10ΧΤΒΕ溶液lOOmL，定容至1000mL)，250V电压下预电泳20min;取 化1PCR产物和4ul变性缓冲液(98%甲酯胺、lOmmol/L邸TA、0.025%漠酪兰、0.025%二甲苯青） 瞬时离屯、，98°C变性lOmin后置于冰水浴上5min，上样于中性聚丙締酷胺凝胶中（浓度为 12%、交联度为29:1)，然后在4°C、180V条件下电泳12h。
[0034] 常见的聚丙締酷胺凝胶染色方法为银染法，共4步（固定^染色^显色^终止），染 色时间较长，耗时30min左右;本发明用染色方法进行了改进，即先用超纯水冲洗凝胶2次， 随后加入染色液轻摇lOmin，然后倒掉染色液，双蒸水清洗凝胶2次，再加入显色液轻摇 8min，待条带清晰后，停止显影反应并照相保存。根据判型结果，GH基因第2外显子(P1引物） 存在巧巾基因型(AA、BB、AB)，第5外显子(P巧I物)存在巧巾基因型(CC、CD)。图4为P1引物扩增 片段的聚丙締酷胺凝胶电泳检测图，图5为P2引物扩增片段的聚丙締酷胺凝胶电泳检测图。 从图中可W清晰地看出不同单链DNA呈现出不同构象，表现为不同带型和位置，从而便于准 确进行不同基因型的判定。
[0035] 5、GH基因不同基因型个体的测序 将不同基因型个体送至北京Ξ博远志生物技术有限责任公司进行纯化和测序。由于2 对引物扩增片段均在5(K)bpW内，所W选择单向测序， 采用BioEdit软件对测序序列与原序列进行对比分析，发现基因第2外显子存在2处 SNPs(C1059T 和C1150A)，第5 外显子存在3处SNPs(C2258T、C2277T和A2291C)。图 6为 P1 引物 扩增片段的基因型个体测序图，箭头表示碱基突变，数字表示突变位置；图7为P2引物扩增 片段的基因型个体测序图，箭头表示碱基突变，数字表示突变位置。
[0036] 6、GH基因不同位点的遗传特性指标 利用化pGen32软件计算細基因第巧F显子和第5外显子的基因型频率、等位基因频率和 多台信息含量，结果见表5、表6。
[0037] 7、GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析 基因型:根据步骤4确定基因型。
[0038] 生长发育性状:按照《家畜育种学》中确定的方法，测定早胜牛初生、1月龄、6月龄、 周岁体重及周岁体高、体长、胸围、肉用指数。
[0039] 根据影响肉牛经济性状的不同因素，建立最小二乘线性模型： yi jkinn= +Faririi+Br 己 Ε<1^+Α§6??+5εχι??·Ι·Μ3Γ??6ΓΓ?+ε? jkiFtn 其中：y.ijkiir为个体表型巧录;.Farmi.为场别效应；Bree-dj为.品种識应；：Agek 为年龄熱空；Sexm为牲别.效应:；larkeiTL为标记基因型顯玄；.ei^.km为随机误差.； 运用SPSS19.0软件的GLM(GeneralLinearModel)对生产数据进行统计分析，并运用最 小二乘法拟合线性模型对不同基因型群体间进行差异显著性检验。
[0040] 相关性分析结果表明：細基因第2外显子，周岁重和周岁胸围，BB型显著高于AA型 和AB型(P<0.05);初生重、6月龄重，BB型和AB型都显著高于AA型(P<0.05);而1月龄重、周岁 体高、周岁体长、肉用指数，3个基因型间差异不显著（P〉0.05)。第5外显子，初生重、6月龄 重、周岁重，肉用指数，CD型显著高于CC型(P<0.05);其他指标，3个基因型间差异不显著(P〉 0.05)。W上结果表明BB型和CD型可能是影响早胜牛生长发育性能的优势基因型，可W作为 早胜牛早期选种的分子标记位点。
[0041] 本发明通过对早胜牛GH基因第2外显子和第5外显子单核巧酸多态性进行检测与 分析，W便筛选出可用于生长发育性状选育的标记位点和优势基因型，建立核屯、群用于纯 种繁育，加快地方肉牛新品种选育进程。
【主权项】
1. 一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于它包括如下步骤： (1) 血样的采集:采集早胜牛血样； (2) 基因组DNA提取及检测： 采用细胞裂解-核裂解两步法提取的早胜牛血液基因组DNA，将冷冻血样室温解冻后， 吸取500uL至1 · 5mLEppendorf管，加入800uL细胞裂解液充分混勾，在6000rpm转速下离心 2min;倒掉上清液，加入800uL细胞裂解液充分混匀，6000rpm转速下离心2min，出现白色沉 淀;加入200uL核裂解液充分混匀，静置2min后再加入IOOuL饱和氯化钠和300uL氯仿充分混 匀，6000rpm转速下离心8min;吸取上清液200uL，加入600uL无水乙醇充分混匀后，12000rpm 转速下离心2min;倒掉上清液，室温下使乙醇挥发干净;待乙醇挥发完全后，加入50uL超纯 水溶解，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度;和紫外分光光度计检测其浓度； (3 ) PCR扩增：分别在GH基因第2外显子和第5外显子设计1对引物，PCR反应体系按照梯 度试验进行优化;PCR反应程序为:根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度的大致范围， 然后从低温向高温设置梯度试验； 首先，保持其他条件不变，将某个条件作为参数设置不同梯度，检测PCR扩增效果;然后 再对其他条件依次设置梯度，反复试验，最终确定最佳反应体系； (4) 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (5) 、GH基因不同基因型个体的测序 (6) 、GH基因不同位点的遗传特性指标 利用P〇pGen32软件计算GH基因第2外显子和第5外显子的基因型频率、等位基因频率和 多台信息含量； (7) 、GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析。2. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特 征在于:细胞裂解液组成为蔗糖110g、浓度为lOmmol/L的Tris-HCl缓冲325mL、 MgCl 2-6H20为I g和体积浓度为1 %的聚乙二醇辛基苯基醚I OmL。3. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特 征在于:核裂解液组成为浓度为lOmmol/L的Tris-HCl缓冲液1.57g、乙二胺四 乙酸3.75g、十二烷基硫酸钠 IOg和柠檬酸钠2.94g。4. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特 征在于:步骤3中PCR反应程序为:根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度 的大致范围，然后从低温向高温设置梯度试验，每个梯度范围为0.5°C-1°C， 变性温度、延伸温度一般分别设置为94 °C和72 °C即可，变性、退火和延伸时间 为30sec-Imin05. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特 征在于:步骤3中PCR扩增结束后，取扩增后的DNA产物IyL与IyL的 LoadingBuff er缓冲液充分混合后，点样于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上，100V 电压电泳20min后用紫外凝胶成像仪观察。6. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特 征在于:步骤4中聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤为:先用超纯水冲洗凝胶2次，随后加入 染色液轻摇IOmin，然后倒掉染色液，双蒸水清洗凝胶2次，再加入显色液轻摇8min，待条带 清晰后，停止显影反应并照相保存。7.根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特 征在于：所述步骤（7)具体是根据不同基因型与生长发育性状，建立最小二乘线性模 型： yi jkirtn= +Farini+Bree：dj+Agek+Sexrrri-Markern+ei jkmn 其中：yi jkin为个体表型记录；Farmi为场别效应；Breedj为品种效应;Agek 为年龄效应；Sexm为性别效应；Markern为标记基因型效应；eijkm为随机误差； 运用SPSS19.0软件的GLM对生产数据进行统计分析，并运用最小二乘法拟合线性模型 对不同基因型群体间进行差异显著性检验。
【文档编号】C12Q1/68GK106011273SQ201610548970
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】徐建峰, 容维中, 王珂, 郭海龙, 桑国俊, 杨明, 保国俊, 陈万辉
【申请人】甘肃省畜牧兽医研究所