菜豆荚斑驳病毒elisa-巢式rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种菜豆荚斑驳病毒ELISA?巢式RT?PCR检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：PBST缓冲液、包被缓冲液、BPMV抗体、酶标抗体缓冲液、BPMV酶标抗体、pNPP、外侧正向引物、反向引物、内侧正向引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、Taq PCR Mix、阳性对照、阴性对照和RNase?free ddH2O。本发明将ELISA和巢式RT?PCR相结合，首先对样品提取液进行ELISA检测，再在酶标板孔中直接反转录合成cDNA，利用cDNA为模板进行第一轮PCR，然后再以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小为296 bp的特异性目的片段，则判定检测的病毒为菜豆荚斑驳病毒。本发明特异性强、准确性好、灵敏度高、操作简便，适用于进出境及农业生产上菜豆荚斑驳病毒的快速检测鉴定。
【专利说明】
菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境及农业生产上菜豆荚斑驳病毒的快速检测鉴定。
【背景技术】
[0002]菜?荚斑驳病毒(5ea/3 pod mot t IeBPMV)属于虹?花叶病毒科(Como riri c/a e )、5工豆花叶病毒属(Como rirus)成员，是危害大豆的主要种传病毒之一，侵染大豆造成的产量损失严重，侵染时间越早，造成的损失越大，与大豆花叶病毒Mosaic Kirt/s，SMV)复合侵染时引起的大豆产量损失超过85%。此外，受BPMV侵染的大豆，容易受到拟莖点霉属(/%o?oAsis)真菌的危害，导致大豆种子品质进一步降低。目前，该病毒主要发生于美国，在加拿大、巴西、秘鲁等国家也有发生的报道，但在我国至今尚无分布的报道。大豆是我国重要的传统农作物，在我国农业经济中具有十分重要的战略地位。作为豆科植物，大豆在栽培过程中极易受到病毒的侵染，造成产量和品质不同程度的降低。考虑到BPMV的危害性，该病毒已被列入我国禁止进境植物检疫性病毒名录。为避免BPMV传入，保护我国大豆生产安全，迫切需要加强该病毒的检测，为及时采取有效的防控措施提供可靠的技术依据。
[0003]针对BPMV，已报道的检测方法主要有血清学DAS-ELISA和RT-PCR方法。尽管DAS-ELISA方法具有快速、准确、适合大批量样品检测的优点，但其灵敏度不高，当大豆样品中BPMV浓度较低时，往往难以检出，不利于该病毒的早期检测。RT-PCR检测病毒，不仅特异性强，而且灵敏度高，现已广泛应用于植物病毒的检测和诊断。为防止误检或漏检，对于大豆样品，特别是种子上BPMV的检测，在利用血清学检测后仍需进行分子生物学检测验证。到目前为止，尚未见将ELI SA、RT-PCR两种技术相结合的专门用于BPMV检测的ELI SA-巢式RT-PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境及农业生产上菜豆荚斑驳病毒进行快速、准确的检疫鉴定，满足口岸检疫和农业生产的需要。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种用于菜豆荚斑驳病毒检测的ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括: DPBST缓冲液:1X ;
2)包被缓冲液:1X;
3)BPMV 抗体；
4)酶标抗体缓冲液:1X ；
5)BPMV酶标抗体；
6)pNPP； 7)外侧正向引物:lOymol/L，
8)反向引物:1ymoI/L，引物序列为5’ -CCCATCCACCTATTTAACAC-3，；
9 )内侧正向引物:I Ομπιο I /L，引物序列为 5 ’ -GCCAGTTCTGATATTTACACC-3 ’ ；
10)RT Buffer:5X ；
11)RNA酶抑制因子:40U/yL ；
12)反转录酶:200UAiL;
13)dNTPs:10mmol/L;
14)TaqPCR Mix:2X ；
15)菜豆荚斑驳病毒的阳性对照样品；
16)不含菜豆荚斑驳病毒的阴性对照样品；
17)RNase-freeddifeO。
[0006]本发明还提供了利用上述菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
DELISA检测:将BPMV抗体用包被缓冲液稀释200倍后在酶标板中每孔加入100yL，37°C水浴2h ；倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次3min ；将BPMV酶标抗体用酶标抗体缓冲液稀释200倍后与样品提取液等体积混合，然后在酶标板中每孔加入200yL混合液，4° C下包被过夜，同时设置阳性对照组、阴性对照组;倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次3min;在酶标板中每孔加入10ylJ^鲜配制的浓度为lmg/mL的pNPP溶液，避光显色15-30min，用酶联仪测定405nm下的OD值；
2)反转录反应:倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液和RNase-freeddH20洗涤后，在酶标板孔中加入浓度为10ymol/L的反向引物2yL和RNase-free ddH20 20yL，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5 X RT Buffer 1yL、浓度为1mmoI/L dNTPs 4yL、浓度为200UAxL反转录酶2yL、浓度为40U/yL RNA酶抑制因子2yL，42 °C水浴60min，70 °C水浴1min后冷却至室温，合成cDNA;
3)第一轮PCR反应:取步骤2)合成的cDNA5yL，按每管加2XTaq PCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L外侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 5.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、52°C退火45s、72°C延伸I min，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸1min，反应结束；
4)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物lyL，按每管加2XTaqPCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L内侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 9.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94 0C预变性3min，然后94 °C变性30s、54 °C退火30s、72°C延伸45s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；
5)PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物1yL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果;含有菜豆荚斑驳病毒样品的电泳检测结果为在296bp处出现明亮的DNA条带，反之则样品不含菜豆荚斑驳病毒。
[0007]本发明将血清学和分子生物学两种检测方法相结合，首先对样品提取液进行ELI SA检测，然后再在酶标板孔中直接进行巢式RT-PCR。较之现有技术而言，本发明所提供的菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于:I)特异性强、准确性好:本发明先后经过ELISA和巢式RT-PCR两轮检测，充分发挥了 2种技术的优点，在满足高通量检测需求的同时保证了检测结果的特异性和准确性，尤其是根据菜豆荚斑驳病毒基因序列设计的特异性巢式PCR引物，显著提高了检测的特异性和准确性。因内侧引物对的扩增片段位于外侧引物对的扩增片段内部，非特异性目的片段同时包含两套引物结合位点的可能性极小，故有效避免了非特异性扩增的发生。本发明能够从感染菜豆荚斑驳病毒的样品上扩增到大小为296bp的特异性目的片段，而从其他病毒样品及健康大豆样品上都未扩增到大小为296bp的特异性目的片段，证实本发明特异性强、准确性好。2)灵敏度高:本发明在ELISA检测后，又进行了巢式RT-PCR，检测经过2轮PCR反应后灵敏度呈数量级增长，实现了对微量模板样品的检测。与单一ELISA、常规IC-RT-PCR相比，本发明检测菜豆荚斑驳病毒的灵敏度分别提高了 14倍和10倍，因此特别适用于微量样品的检测。3)操作简便:本发明提供的检测方法操作简便，能够克服传统生物学测定、电镜观察效率低的不足，实现对菜豆荚斑驳病毒的快速、准确和高效检测；由于ELISA和巢式RT-PCR检测均在同一孔中进行，无需重复制样，既节约了样品，又保证了样品的同一性，同时简化了操作步骤。
【附图说明】
[0008]图1为实施例2的菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测结果:
其中M:DNA分子量标准(100 bp) ； 1、4:携带有菜_&荚斑驳病毒的样品；2、5:阴性对照；
3、6:空白对照。
[0009]图2为实施例3的特异性测定结果:
其中M:DNA分子量标准(100 bp) ; 1、9:菜?荚斑驳病毒(BPMV)样品；2、10:大?花叶病毒(SMV)样品；3、11:烟草环斑病毒(TRSV)样品；4、12:番前环斑病毒(ToRSV)样品；5、13:南芥菜花叶病毒(ArMV)样品;6、14:南方菜豆花叶病毒(SBMV)样品；7、15:阴性对照。
[0010]图3-图5为实施例4的灵敏度测定结果，图3为ELISA测定结果，图4为第一轮PCR测定结果，图5为第二轮PCR测定结果:
其中M: DNA分子量标准(100 bp)； I: BPMV提取液(原液)；2: 10—1稀释;3: 10—2稀释;4:10—3稀释;5:10-4稀释;6: 10-5稀释;7: 10-6稀释;8:阴性对照。
[0011 ]图6为实施例5的进口大豆上菜豆荚斑驳病毒检测结果:
其中M: DNA分子量标准(100 bp ); 1-11:进口大豆样品。
【具体实施方式】
[0012]以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
[0013]实施例1:菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的配置(10次检测量)
1)PBST缓冲液:1X，1管(300mL);
2)包被缓冲液:1X，1管(50mL);
3)BPMV抗体，I管(500yL);
4)酶标抗体缓冲液:IX，I管(50mL)；
5)BPMV酶标抗体，I管(500yL)；
6)ρΝΡΡ，1管(0.3g);
7)外侧正向引物:10ymol/L，l管(10yL);
8)反向引物:10ymol/L，l管(10yL); 9)内侧正向引物:10ymol/L，l管(10yL);
10)RTBuffer:5X，1管(10yL);
11)RNA酶抑制因子:40U/yL，I管(10yL)；
12)反转录酶:200U/yL，I 管(I OOyL);
13)dNTPs:10mmol/L，I管(10yL)；
14)TaqPCR Mix:2X，I管(200yL);
15)菜豆荚斑驳病毒的阳性对照样品，I管(ImL);
16)不含菜豆荚斑驳病毒的阴性对照样品，I管(ImL);
17)RNase-freeddifeO，I管(1mL)。
[0014]实施例2:菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法利用菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤: DELISA检测:将BPMV抗体用包被缓冲液稀释200倍后在酶标板中每孔加入100yL，37°C
水浴2h ；倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次3min ；将BPMV酶标抗体用酶标抗体缓冲液稀释200倍后与样品提取液等体积混合，然后在酶标板中每孔加入200yL混合液，4° C下包被过夜，同时设置阳性对照组、阴性对照组;倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次3min;在酶标板中每孔加入10ylJ^鲜配制的浓度为lmg/mL的pNPP溶液，避光显色15-30min，用酶联仪测定405nm下的OD值；
2)反转录反应:倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液和RNase-freeddH20洗涤后，在酶标板孔中加入浓度为10ymol/L的反向引物2yL和RNase-free ddH20 20yL，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5 X RT Buffer 1yL、浓度为1mmoI/L dNTPs 4yL、浓度为200UAxL反转录酶2yL、浓度为40U/yL RNA酶抑制因子2yL，42 °C水浴60min，70 °C水浴1min后冷却至室温，合成cDNA;
3)第一轮PCR反应:取步骤2)合成的cDNA5yL，按每管加2XTaq PCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L外侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 5.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、52°C退火45s、72°C延伸I min，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸1min，反应结束；
4)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物lyL，按每管加2XTaqPCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L内侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 9.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94 0C预变性3min，然后94 °C变性30s、54 °C退火30s、72°C延伸45s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；
5)PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物1yL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果;含有菜豆荚斑驳病毒样品的电泳检测结果为在296bp处出现明亮的DNA条带(图1)，否则无。
[0015]实施例3:菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的特异性测定
I)病毒样品提取液的制备:分别以菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、大豆花叶病毒(SMV)、烟草环斑病毒(FoAacco ringsport ri_ras，TRSV)、番前环斑病毒(7b?a1 ringspot virus,ToRSV)、南芥菜花叶病毒mosaic rirt/s，ArMV)和南方菜豆花叶病毒(SrOtziAer/?bean mosaic d?s，SBMV)等6种病毒样品为材料，按1:20(W/V)比例加入PBST缓冲液，充分研磨，4°C下10 000 rpm离心10 min，取上清作为病毒样品提取液； 2)ELISA检测:将BPMV抗体用包被缓冲液稀释200倍后在酶标板中每孔加入100yL，37°C水浴2h ；倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次3min ；将BPMV酶标抗体用酶标抗体缓冲液稀释200倍后与样品提取液等体积混合，然后在酶标板中每孔加入200yL混合液，4° C下包被过夜，同时设置阳性对照组、阴性对照组;倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次3min;在酶标板中每孔加入10ylJ^鲜配制的浓度为lmg/mL的pNPP溶液，避光显色15-30min，用酶联仪测定405nm下的OD值；
3)反转录反应:倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液和RNase-freeddH20洗涤后，在酶标板孔中加入浓度为10ymol/L的反向引物2yL和RNase-free ddH20 20yL，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5 X RT Buffer 1yL、浓度为1mmoI/L dNTPs 4yL、浓度为200UAxL反转录酶2yL、浓度为40U/yL RNA酶抑制因子2yL，42 °C水浴60min，70 °C水浴1min后冷却至室温，合成cDNA;
4)第一轮PCR反应:取步骤2)合成的cDNA5yL，按每管加2XTaq PCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L外侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 5.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、52°C退火45s、72°C延伸I min，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸1min，反应结束；
5)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物lyL，按每管加2XTaqPCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L内侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 9.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94 0C预变性3min，然后94 °C变性30s、54 °C退火30s、72°C延伸45s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；
6)PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物1yL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果;含有菜豆荚斑驳病毒样品的电泳检测结果为在296bp处出现明亮的DNA条带(图2);从图2可见，仅含有菜豆荚斑驳病毒的样品在296bp处出现明亮的DNA条带，其他病毒样品和健康大豆样品均无，说明本发明试剂盒特异性强。
[0016]实施例4:菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的灵敏度测定
利用健康大豆种子提取液，将感染BPMV大豆种子提取液按10倍梯度稀释，依次稀释为原液的10—1，10—2，10—3，10—4，10—5和10—6倍，并以健康大豆种子提取液作为阴性对照，按实施例2方法进行检测，结果见图3-图5。从图中可见，本发明试剂盒具有很高的灵敏度，可以达10—4倍病毒提取液，比ELISA高14倍。
[0017]实施例5:进口大豆上菜豆荚斑驳病毒的检测
以我国口岸进口的美国大豆种子为样品，共11份。结果表明，经ELISA检测，结果呈阳性的样品有3个，检出率为27.3%;通过2轮PCR，除3份ELISA检测呈阳性的样品外，又有4份样品检出为阳性，即共有7个样品扩增出特异性目的片段(图6)，检出率显著提高，达63.6%。
【主权项】
1.菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括:I)I3BST缓冲液:I X ; 2)包被缓冲液:I X ; 3)BPMV抗体;4)酶标抗体缓冲液:I X ; 5)BPMV酶标抗体;6 )pNPP; 7 )外侧正向引物:I Ομπιο I/L，引物序列为5 ’ -GGCCTGTGCTATGAATAGT-3 ’ ； 8 )反向引物:I Oymo I /L，引物序列为 5 ’ -CCCATCCACCTATTTAACAC-3 9 )内侧正向引物:I Oymo I /L，引物序列为5’-60^61'1'0^^了41'7^040:-3’；10)町 Buffer:5X ; 11)RNA酶抑制因子:40UAxL;12)反转录酶:200U/yL; 13)dNTPs: 10mmol/L； 14)Taq PCR Mix: 2 X ; 15)菜豆荚斑驳病毒的阳性对照样品；16)不含菜显荚斑驳病毒的阴性对照样品；17)RNase-free ddifcO。2.利用权利要求1所述的菜豆荚斑驳病毒ELISA-巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于:包括以下步骤: DELISA检测:将BPMV抗体用包被缓冲液稀释200倍后在酶标板中每孔加入100yL，37°C水浴2h ；倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗酶标板3次，每次3min ；将BPMV酶标抗体用酶标抗体缓冲液稀释200倍后与样品提取液等体积混合得到混合液，然后在酶标板中每孔加入200yL混合液，4° C下包被过夜，同时设置阳性对照组、阴性对照组;倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液洗酶标板3次，每次3min;在酶标板中每孔加入10yL新鲜配制的浓度为Img/mL的pNPP溶液，避光显色15_30min，用酶联仪测定405nm下的OD值； . 2)反转录反应:倒尽酶标板中的液体，用PBST缓冲液和RNase-freeddH20洗涤后，在酶标板孔中加入浓度为10ymol/L的反向引物2yL和RNase-free ddH20 20yL，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5 X RT Buffer 1yL、浓度为1mmoI/L dNTPs 4yL、浓度为200UAxL反转录酶2yL、浓度为40U/yL RNA酶抑制因子2yL，42 °C水浴60min，70 °C水浴1min后冷却至室温，合成cDNA; .3)第一轮PCR反应:取步骤2)合成的cDNA5yL，按每管加2 XTaq PCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L外侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 5.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94°C预变性3min，然后94°C变性30s、52°C退火45s、72°C延伸I min，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸1min，反应结束； .4)第二轮PCR反应:取第一轮PCR反应产物IyL，按每管加2XTaqPCR Mix 12.5yL、浓度为lOymol/L内侧正向引物lyL、浓度为lOymol/L反向引物lyL、RNase-free ddH20 9.5yL，使反应总体积为25yL;混合后的反应液，94 0C预变性3min，然后94 °C变性30s、54 °C退火30s、72°C延伸45s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束； . 5 )PCR扩增产物电泳检测:第二轮PCR反应结束后，取产物1yL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果;含有菜豆荚斑驳病毒样品的电泳检测结果为在296bp处出现明亮的DNA条带。
【文档编号】C12Q1/70GK106011312SQ201610550115
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】沈建国, 廖富荣, 蔡伟, 高芳銮
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心