油脂代谢相关蛋白GmNF307在植物油脂代谢调控中的应用

油脂代谢相关蛋白GmNF307在植物油脂代谢调控中的应用
【专利摘要】本发明公开了油脂代谢相关蛋白GmNF307在植物油脂代谢调控中的应用。本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与油脂代谢调控相关的蛋白质。实验表明，本发明提供的油脂代谢相关蛋白GmNF307，其编码基因GmNF307的过量表达，可提高植物组织和/或器官总油脂含量和/或提高植物组织和/或器官中部分脂肪酸含量。
【专利说明】
油脂代谢相关蛋白GmNF307在植物油脂代谢调控中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中油脂代谢相关蛋白GmNF307在植物油脂代谢调控中 的应用。
【背景技术】
[0002] 在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30%，居世界植物油产量的 第一位。
[0003] 脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细 胞中，是生长发育所必须的，对其合成的阻断会导致细胞死亡，因而至今为止还没有发现一 个阻断脂肪酸合成的植物突变体。植物同其它真核生物参与脂肪酸合成途径的酶有很大差 异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化 的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的 多酶复合体完成。在植物中参加脂肪酸合成的酶以可溶的形式独立存在于质体的胞质中。
[0004] 大多数植物中，油脂都以三酰甘油（Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含 量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成 膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。 PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3'-OH 位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催 化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。
[0005] 人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。 然而，在植物中，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何调控植物油脂代谢。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了油脂代谢相关蛋白在调控植物油脂代谢 中的应用。
[0008] 本发明所提供的油脂代谢相关蛋白在调控植物油脂代谢中的应用中，所述油脂代 谢相关蛋白的名称为GmNF307,为如下a)或b)或c)的蛋白质：
[0009] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
[0010] b)在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0011] c)将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的与油脂代谢调控相关的蛋白质。
[0012] 其中，SEQ ID No. 2由307个氨基酸残基组成。
[0013] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的氨基末端或羧 基末端连接上如表1所示的标签。
[0014] 表1、标签的序列
[0015]
[0016] 上述c)中的蛋白质GmNF307,所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0017] 上述c)中的蛋白质GmNF307可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。
[0018] 上述c)中的蛋白质GmNF307的编码基因可通过将SEQ ID No. 1所示的DNA序列 中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或 在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0019] 上述油脂代谢相关蛋白在调控植物油脂代谢的应用中，所述调控植物油脂代谢具 体可为调控植物组织和/或器官总油脂含量和/或调控植物组织和/或器官中脂肪酸含 量。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述GmNF307相关的生物材料。
[0021] 本发明所提供的与所述GmNF307相关的生物材料在调控植物油脂代谢的应用中， 与所述GmNF307相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
[0022] A1)编码所述GmNF307的核酸分子；
[0023] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0024] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0025] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0026] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0027] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0028] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0029] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0030] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0031] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0032] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0033] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0034] A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0035] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0036] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0037] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0038] A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0039] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0040] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0041] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0042] 上述与所述GmNF307相关的生物材料在调控植物油脂代谢中的应用中，A1)所述 核酸分子为如下al)或a2)或a3)所示的基因：
[0043] al)其编码序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子；
[0044] a2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述GmNF307的 cDNA分子或基因组DNA分子；
[0045] a3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GmNF307的cDNA 分子或基因组DNA分子。
[0046] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0047] 其中，SEQ ID No. 1由924个核苷酸组成，编码SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0048] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码GmNF307的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 分离得到的GmNF307的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmNF307且具 有GmNF307功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0049] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0050] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每 次15min ;或，0? 1XSSPE (或0? 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0051] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0052] 上述生物材料中，A2)所述的含有编码GmNF307的核酸分子的表达盒（GmNF307基 因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达GmNF307的DNA，该DNA不但可包括启动SiNF-YB8 基因转录的启动子，还可包括终止GmNF307基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可 包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育 特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型 启动子35S :来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao等人（1999) Plant Physiol 120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由 水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动 子（PIN2)或LAP启动子（均可用茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利5,187， 267);四环素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性 启动子PF128 (CN101063139B (中国专利200710099169. 7))，种子贮存蛋白质特异的启动子 (例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人（1985) EMBO J. 4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的 所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (N0S终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂 氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：〇dell等人（I9S5)Nature313:810 ;Rosenberg等 人（1987) Gene, 56:125 ;Guerineau 等人（1991) Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot (1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0053] 可用现有的表达载体构建含有所述GmNF307基因表达盒的重组载体。所述植 物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如PAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译 区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如 胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类 似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录 增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码 序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基 因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光 素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋 予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲 喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如 抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全 性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0054] 上述与所述GmNF307的生物材料在调控植物油脂代谢中的应用中，所述载体可为 质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0055] 上述与所述GmNF307的生物材料在调控植物油脂代谢中的应用中，所述的微生物 可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
[0056] 上述与所述GmNF307的生物材料在调控植物油脂代谢中的应用中，所述转基因植 物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0057] 上文中，所述调控植物组织和/或器官总油脂含量为提高植物组织和/或器官总 油脂含量；所述调控植物组织和/或器官中脂肪酸含量为提高植物组织和/或器官中脂肪 酸含量；所述脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和贡多酸中的五种、四种、三种、两种或 一种。
[0058] 上文中，所述器官具体可为种子；所述植物可为种子植物，所述种子植物可为单子 叶植物和/或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/ 或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南 芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述单子叶植物可为玉米。所述大豆具体可为大豆 Williams 82 等品种。
[0059] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
[0060] 本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，包括将所述油脂代谢相关蛋白的编 码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物组织和/或器官中总油 脂含量和/或脂肪酸含量高于所述受体植物。
[0061] 上述培育转基因植物的方法中，所述油脂代谢相关蛋白的编码基因的编码序列是 SEQ ID No. 1 的 DNA 分子。
[0062] 上述培育转基因植物的方法中，所述脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和贡 多酸中的五种、四种、三种、两种或一种。
[0063] 上述培育转基因植物的方法中，所述器官具体可为种子；所述植物可为种子植物， 所述种子植物可为单子叶植物和/或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为豆科植物和/ 或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十 字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述单子叶植物可为玉米。所 述大豆具体可为大豆Williams 82等品种。
[0064] 在本发明的实施例中，所述GmNF307的编码基因（即SEQ ID No. 1所示的DNA分 子）通过含有GmNF307基因表达盒的GmNF307基因重组表达载体导入所述受体植物中。
[0065] 上述培育转基因植物的方法中，其中所述GmNF307基因可先进行如下修饰，再导 入受体植物中，以达到更好的表达效果：
[0066] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所 偏爱的密码子，在保持本发明所述GmNF307基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合 植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实 现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35 %、多于45 %、多于50 %或多于约 60% ；
[0067] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列进行修饰；
[0068] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0069] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发 明基因进行连接；
[0070] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序 列（例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
[0071] 所述GmNF307基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA 转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition). )〇
[0072] 上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GmNF307基因转化目的植物 得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因， 也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述 转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0073] 为解决上述技术问题，本发明还提供了扩增编码所述GmNF307蛋白的核酸分子全 长或其片段的引物对。
[0074] 本发明的实验证明，将GmNF307基因转入野生型拟南芥中得到的转基因拟南芥种 子中的总油脂含量和/或部分脂肪酸含量显著高于野生型拟南芥，表明GmNF307蛋白对种 子中总油脂的合成呈正调控作用，其编码基因GmNF307的过量表达，可提高转基因植株种 子中总油脂的含量，GmNF307蛋白还可提尚种子中部分脂肪酸的含量，如棕榈酸（16:0)、油 酸（18:1)、亚油酸（18:2)、亚麻酸（18:3)和贡多酸（20:1)。说明本发明提供的GmNF307蛋 白是一种与植物油脂代谢调控相关的蛋白，可用于改良作物油脂成份和/或培育高油脂和 高产量品种。
[0075] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0076] 图1为GmNF307基因在大豆种子的球状胚、心形胚、子叶、发育早期、发育中期、发 育晚期和干种子中的相对表达量。内参是大豆Tublin基因。
[0077] 图2为载体示意图。其中A为载体pCR?8八;W/T0P0示意图，B为pGWB41 l-GmNF307 部分示意图。
[0078] 图3为GmNF307基因在野生型拟南芥和三个1~3代纯合转GmNF307基因拟南芥株 系中的相对表达量。
[0079] WT :野生型拟南芥；0E-13 :T3R纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-13 ;0E-15 : 丁3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-15 ;0E-18 :T 3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系 0E-18〇
[0080] 图4为野生型拟南芥和三个1~3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系的种子中总油 脂含量测定结果。
[0081] WT :野生型拟南芥；0E-13义代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-13 ;0E-15 : 丁3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-15 ;0E-18 :T 3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系 0E-18 ;*表示与野生型拟南芥相比，具有显著差异。
[0082] 图5为野生型拟南芥和三个1~3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系的种子中脂肪 酸含量测定结果。
[0083] WT :野生型拟南芥；0E-13义代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-13 ;0E-15 : 丁3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-15 ;0E-18 :T 3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系 0E-18 ;*表示与野生型拟南芥相比，具有显著差异。
【具体实施方式】
[0084] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0085] 下述实施例中的载体 pGWB411 (Tsuyoshi Nakagawa，et al.，Development of Series of Gateway Binary Vectors pGWBs, for Realizing Efficient Construction of Fusion Genes for Plant Transformation, JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOEN GINEERING, 2007, Vol. 104, No. 1，34 - 41.)由日本岛根大学 Tsuyoshi Nakagawa 博士 (E. mail: tnakagawilife. shimane~u. ac. jp)提供，公众经 Tsuyoshi Nakagawa 博士同意后 可从中科院遗传与发育生物学研究所（即
【申请人】）获得，该生物材料只为重复本发明的相 关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0086] 下述实施例中的大豆Williams 82 (Scott A Jackson, et al. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean，Nature，2010，Vol.463，178_183)由美国普渡大学 Scott Jackson教授馈赠，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所（即
【申请人】）获得，该生 物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。在下文中大豆Williams 82简称大豆。
[0087] 下述实施例中的农杆菌GV3101 (Lee CW, et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana，Plant Cell, 2009, 21 (9) ,2948-62)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究 所（即
【申请人】）获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使 用。
[0088] 下述实施例中拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0 亚型）（Kim H, Hyun Y, Park J, Park M, Kim M, Kim H, Lee M, Moon J, Lee I, Kim J. A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana. Nature Genetics. 2004, 36:167-171)。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所（即
【申请人】） 获得，以重复本申请实验。
[0089] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量实 验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。
[0090] 实施例1、利用油脂代谢相关蛋白基因培育转基因拟南芥植物
[0091] 本实施例提供了一个来源于大豆的油脂代谢相关蛋白基因，将其命名为油脂代谢 相关蛋白GmNF307基因。
[0092] 制备序列表中SEQ ID No. 1所示的DNA分子（即油脂代谢相关蛋白GmNF307基因， 简称GmNF307基因），SEQ ID No. 1所示的DNA分子编码SEQ ID No. 2所示的蛋白质（即油 脂代谢相关蛋白GmNF307,简称GmNF307蛋白）。
[0093] 1、GmNF307基因在大豆不同器官的表达分析
[0094] 1. 1、提取大豆球形胚的总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA，得到大豆球形胚 cDNA〇
[0095] 1. 2、按照1. 1的方法，将1. 1中的大豆球形胚替换分别为大豆心形胚、大豆子叶、 大豆种子的发育早期（即种子发育过程中占饱满种子（但尚没脱水）的重量百分比为 8%)、大豆种子的发育中期（即种子发育过程中占饱满种子（但尚未脱水）的重量百分比 为24%)、大豆种子的发育晚期（即种子发育过程中占饱满种子（但尚没脱水）的重量百 分比为96 % )和大豆干种子，分别得到大豆心形胚cDNA、大豆子叶cDNA、大豆种子的发育早 期cDNA、大_&种子的发育中期cDNA、大_&种子的发育晚期cDNA和大干种子cDNA。
[0096] 1. 3、分别以1. 1和1. 2得到的cDNA为模板，以GmNF307基因引物F : 5' -CTTGAACGCCCTAATGGTGATT-3' 和 GmNF307 基因引物 R :5' -ATCGCTTGGTGGTCCTGTC-3' 为引物，进行实时定量PCR分析，得到GmNF307基因的相对表达量。内参是大豆 Tublin 基因，内参引物分别为 Tublin F :5' -AACCTCCTCCTCATCGTACT 和 Tublin R : 5' -GACAGCATCAGCCATGITCA-3'。结果如图1所示，在大豆球形胚、大豆心形胚、大豆子叶和 大豆干种子中GmNF307基因的表达量较低；种子发育早期，GmNF307基因的表达量明显上 升；种子发育中期GmNF307基因的表达量达到峰值；种子发育晚期GmNF307基因的表达量 又下降。上述结果表明GmNF307基因是种子发育阶段特异表达的基因。
[0097] 2、转GmNF307基因植株的获得
[0098] 2. 1、利用Gateway技术构建过表达载体，具体步骤如下：
[0099] 2. 1. 1、目标基因的获得：根据GmNF307基因的开放阅读框序列设计引物如下（下 划线标注attBl和attB2重组位点）：
[0100] 上游引 物 1 :5, -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAATCTAAATCTGAAAC TG-3,
[0101] 下游引物 2 :5 ' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTGAATAGCAAGACGCCTCT-3，
[0102] 提取大豆幼苗的总RNA，并反转录为cDNA作为模板，用上游引物1和下游引物2进 行PCR扩增，得到GmNF307基因PCR产物。
[0103] 212、按TQPO? TA Clpning?试剂盒（Invitogen公司产品，产品目录号为 12536-017,）说明书自带操作步骤将2. 1. 1得到的GmNF307基因PCR产物和入门载体 pCR?8/GW/T0P0 (T0P0? TA Cloning?试剂盒中自带）进行BP重组反应，得到BP反应产 物。
[0104] 2. 1. 3、将步骤2. 1. 2得到的2. 5 y 1 BP反应产物加入50 y 1 T0P10感受态细胞进 行转化，得到的克隆即为入门克隆（entry clone)，该入门克隆中的质粒为入门质粒，将该 入门质粒命名为pCR?8/GW/T0P0- GmNF307(图2中A)，将入门质粒送测序，测序结果表明 该入门质粒含有SEQ ID No. 1所示的cDNA分子。
[0105] 2. 1. 4、将步骤 2. 1. 3 得到的pCR?8/GW/T0P:Q- GmNF307 和 pGWB411 进行 LR 重组 反应，得到LR反应产物。
[0106] 2. 1.5、将步骤2. 1.4得到的2. 5yl LR反应产物加入50yl T0P10感受态细胞进 行转化，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为 pGWB411-GmNF307, pGWB411-GmNF307 的测序结果表明 pGWB411-GmNF307 含有 SEQ ID No. 1 所示的 cDNA 分子。pGWB411-GmNF307 为 GmNF307 基因表达载体，pGWB411-GmNF307 含有 GmNF307基因表达盒，GmNF307基因表达盒中，启动GmNF307基因转录的启动子是花椰菜花 叶病毒35S启动子（见图2中B)。
[0107] 2. 2、转GmNF307基因拟南芥植株的获得
[0108] 2. 2. 1、将重组质粒pGWB411-GmNF307用电击法转化根癌农杆菌GV3101，挑取重组 农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/pGWB411-GmNF307。
[0109] 按上述方法，将重组质粒pGWB411-GmNF307替换为质粒pGWB411，其他步骤均相 同，将得到重组农杆菌命名为GV3101 /pGWB411。
[0110] 2. 2. 2、将拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-〇亚型）种子均勾播种在MS 培养基上，于4°C春化3天，然后置于22°C光照培养箱培养一周。待小苗长出四片真叶后移 栽至营养钵中培养，保湿2-3天，20-22°C。当拟南芥植株生长至大部分花蕾处于即将开花 状态时，用培养至对数期的重组农杆菌GV3101/pGWB41 l-GmNF307侵染液转化拟南芥获得 代转pGWB411-GmNF307拟南芥种子。
[0111] 将代转pGWB411-GmNF307拟南芥种子，于37°C烘箱中烘干（6-8天），然后4°C 春化3天。将代转pGWB411-GmNF307种子在含卡那霉素的MS培养基（卡那霉素在MS培 养基中的浓度为50mg/L)上进行筛选，得到初筛阳性1\代GmNF307基因拟南芥幼苗。
[0112] 提取上述初筛阳性代转GmNF307拟南芥植株叶片总RNA，以反转录得到cDNA 作为模板，以 GmNF307 基因引物 F :5' -CTTGAACGCCCTAATGGTGAIT-3' 和 GmNF307 基因 引物R :5' -ATCGCTTGGTGGTCCTGTC-3'为引物进行实时定量PCR分析，得到GmNF307基 因的相对表达量。内参是野生型拟南芥AtActin2基因，内参引物分别为AtActin2F : 5' -ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3' 和 AtActin2R:5' -TGCTCATACGGTCAGCGATA-3'。检测到有 GmNF307基因表达的拟南芥即为阳性转GmNF307基因拟南芥。用上述方法继续鉴定T :阳 性转GmNF307基因拟南芥的后代，获得16个1~3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系。
[0113] 按上述方法，将重组农杆菌pGWB411-GmNF307替换为重组农杆菌pGWB411，其他步 骤均相同，得到T 3代纯合转空载体拟南芥。
[0114] 2. 2. 3、以野生型拟南芥植株为对照，分别鉴定上述步骤的三个1~3代纯合转 GmNF307基因拟南芥植株株系0E-13、0E-15和0E-18和T 3代纯合转空载体拟南芥中目的基 因的表达，鉴定引物和内参引物同步骤2. 2. 2。
[0115] 实验结果见图3,野生型拟南芥和1~3代纯合转空载体拟南芥均未能检测出 GmNF307基因的表达，1~ 3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-15的GmNF307基因的表达 量为1. 〇, 了3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-18的GmNF307基因的表达量为2. 9, T 3 代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-13的GmNF307基因的表达量为3. 9。
[0116] 实施例2、转GmNF307基因拟南芥的表型分析
[0117] 1、种子总油脂含量测定
[0118] 实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
[0119] 将干燥的种子研磨成粉，称取100mg到离心管中，平行称取四份。加入500 y 1的 正己烷，充分混匀，37°C过夜。慢速离心3分钟，将正己烷吸入称量过新管中。剩下的粉末 继续加正己烷重复浸泡、然后离心、然后收集正己烷到同一的离心管中。将离心管放入真空 栗中，抽真空，使正己烷完全挥发。然后再次称取离心管的重量。离心管前后重量的变化即 是提取的总油脂重量；总油脂量（％ )的计算公式为：
[0120] 总油脂量（％ )=(提取的脂类重量/种子总重量）X 100%。
[0121] 每个株系取30株的种子，实验重复三次，结果取平均值土标准差。
[0122] 结果如图4所示，野生型拟南芥种子总油脂量为36.0 % ±3 %义代纯合转 GmNF307基因拟南芥株系0E-18种子总油脂量为40. 1% ±3%;T3R纯合转GmNF307基因拟 南芥株系OE-15种子总油脂量为44. 6% ±9%;T3R纯合转GmNF307基因拟南芥株系OE-13 种子总油脂量为41. 1% ±3%。三个转GmNF307基因拟南芥株系种子总油脂量明显高于野 生型拟南芥种子总油脂量，且差异显著。野生型拟南芥和1代纯合转空载体拟南芥的种子 总油脂量无显著差异。
[0123] 结果表明，GmNF307蛋白对种子中总油脂的合成呈正调控作用，其编码基因 GmNF307的过量表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量。
[0124] 2、种子脂肪酸含量测定
[0125] 实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
[0126] 彻底干燥待测种子，研磨成粉，取10mg加入螺口的2ml离心管中，每份样品平行 称取四份。加入l〇yl的17:0脂肪酸（Sigma公司产品，产品目录号为51610)10mg/ml 做内标。加含2. 5 %浓硫酸的甲醇溶液lml，85 °C水浴中保温1小时，期间晃动数次。自然 冷却后，取上清500 yl到新管中，加入600 yl的0. 9% NaCl溶液、300正己烷，震荡混匀 几分钟，4000转离心10分钟，取上清至新管中。通风橱中过夜使正己烷挥发完全，然后加 入50 yl乙酸乙酯溶解甲酯化的脂肪酸。将甲酯化的脂肪酸样品用气相色谱质谱联用仪测 (Perkin-Elmer Turbomass)各个组分的相对含量，然后各个成分的脂肪酸与加入的17:0 内标比较得出相对含量。（Shen，B.，et al.，The homeobox gene GLABRA2affects seed oil content in Arabidopsis, Plant Mol. Biol. , 60, 377-387, 2006.)
[0127] 每个株系取30株的种子，实验重复三次，结果取平均值土标准差。
[0128] 结果如图5所示，共检测11种脂肪酸含量，其中三个转GmNF307基因拟南芥株 系的拟南芥种子中棕榈酸（16:0)、油酸（18:1)、亚油酸（18:2)、亚麻酸（18:3)和贡多酸 (20:1)的含量均高于野生型拟南芥，且达到显著水平。野生型拟南芥、1~ 3代纯合转GmNF307 基因拟南芥株系〇E_15、T3R纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-18和T 3代纯合转GmNF307 基因拟南芥株系0E-13的种子中棕榈酸（16:0)占种子总重量的百分比的平均值分别为 3. 5%、4.0%、3. 8%和3.8% ;油酸（18:1)占种子总重量的百分比的平均值分别为4.0%、 5. 0%、4. 4%和4.4% ;亚油酸（18:2)占种子总重量的百分比的平均值分别为7.6%、 10. 0%、9. 2%和9.2% ;亚麻酸（18:3)占种子总重量的百分比的平均值分别为5.8%、 7. 8%、7. 0%和6.6% ;贡多酸（20:1)占种子总重量的百分比的平均值分别为7.8%、 9. 4%、8. 8%和8. 6%。野生型拟南芥、1~3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-15、1~3代 纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-18和1~ 3代纯合转GmNF307基因拟南芥株系0E-13的种 子中芥子酸（22:1)占种子总重量的百分比的平均值分别为5. 3%、5. 9%、5. 9%和5. 8%， 三个转GmNF307基因拟南芥株系的拟南芥种子中芥子酸（22:1)的含量虽高于野生型拟南 芥，但未达到显著水平。其它5种脂肪酸的含量与对照相比无明显差异，这5种脂肪酸包括 硬脂酸（18:0)、花生酸（20:0)、花生二烯酸（20:2)、花生三烯酸（20:3)、山嵛酸（22:0)。野 生型拟南芥和转空载体拟南芥的种子中上述脂肪酸含量无显著差异。
[0129] 结果表明，GmNF307基因的过量表达可以提高种子中部分脂肪酸的含量，如棕榈酸 (16:0)、油酸（18:1)、亚油酸（18:2)、亚麻酸（18:3)和贡多酸（20:1)。
【主权项】
1. GmNF307在调控植物组织和/或器官总油脂含量和/或调控植物组织和/或器官中 脂肪酸含量中的应用；所述GmNF307为a)或b)或c): a) 氣基酸序列是SEQ ID No. 2所不的蛋白质； b) 在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； c) 将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加得到的与油脂代谢调控相关的蛋白质。2. 与权利要求1所述GmNF307相关的生物材料在调控植物组织和/或器官总油脂含量 和/或调控植物组织和/或器官中脂肪酸含量中的应用； 所述与权利要求1所述GmNF307相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种： A1)编码权利要求1所述GmNF307的核酸分子； A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒； A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3) 所示的基因： 1) 其编码序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述油脂 代谢相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述油脂代谢 相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物组织和/或器官总 油脂含量为提高植物组织和/或器官总油脂含量；所述调控植物组织和/或器官中脂肪酸 含量为提高植物组织和/或器官中脂肪酸含量；所述脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻 酸和贡多酸中的五种、四种、三种、两种或一种。5. 根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述器官为种子；所述植物为种子 植物。6. -种培育转基因植物的方法，包括将权利要求1所述油脂代谢相关蛋白的编码基因 导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物组织和/或器官中总油脂含量 和/或脂肪酸含量高于所述受体植物。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述油脂代谢相关蛋白的编码基因的编 码序列是SEQ ID No. 1的DNA分子。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、 亚麻酸和贡多酸中的五种、四种、三种、两种或一种。9. 根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述器官为种子；所述植物为种子 植物。10. 扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。
【文档编号】C12N15/62GK106032390SQ201510115633
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月17日
【发明人】张劲松, 陈受宜, 陆翔, 满为群, 来永才, 李炜, 栾晓燕, 杜维广, 毕影东, 张万科, 马彪, 林晴, 何锶洁
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所