一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种无饲养层人多能干细胞培养基，含有如下组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、亚硒酸钠、重组人胰岛素、人脱铁转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子beta1、肝素锂和/或肝素钠、DMEM/F-12基础培养基及渗透压调节剂。本发明的培养基在低密度和普通密度进行hiPSC培养时，增殖速度高，细胞形态和多能性维持的好，不需要使用昂贵的硫酸乙酰肝素，极大的降低了成本，并且能够满足现阶段几乎所有的hiPSC维持培养，以及加入各小分子化合物进行诱导重编程培养（去除TGFB1和DM），因此该培养基将适合各基础科研、临床科研实验的广泛研究。
【专利说明】
一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基。
【背景技术】
[0002] 多能干细胞（Pluripotency stem cell，iPSC)具有自我更新能力和多能性，它能 够向胚胎三个胚层（外胚层、中胚层、内胚层）的任何组织和细胞进行分化，因此iPSC在再 生医学、发育生物学等领域起到重要的作用。iPSC包括胚胎干细胞（Embryonic stem cell， ESC)和诱导多能干细胞（induced pluripotency stem cell, iPSC)，无论是 ESC 还是 iPSC 他们都具有类似的基因表达谱、自我更新能力、多能性、表观遗传谱，前者来自于囊胚时期 的内细胞团，后者来自于成体细胞导入重编程因子诱导并纯化出来的多能干细胞。现阶段 研究最多的IPSC物种包括小鼠和人，其中小鼠的iPSC通常情况下处于naive状态，更加原 始，能够形成生殖嵌合，而人的iPSC通常被认为处于Primer状态（鼠的Primer iPSC生殖 嵌合能力很弱，由于伦理因素未能得知人iPSC是否容易形成生殖嵌合）。正是因为物种、发 育阶段等因素，小鼠iPSC增殖能力很强，能够适应低密度（小于5%汇合度）以及正常情况 下健康生长，甚至小鼠iPSC可以较容易单细胞存活和增殖，而人的iPSC在低密度条件培养 下（如小于约10 %汇合度）较难生长，甚至会逐步死亡，其增殖速度也远低于鼠的iPSC，由 于低密度或者单细胞iPSC培养在iPSC纯化早期以及基因打靶（基因组编辑）过程中至关 重要，因此人的iPSC相关研究十分困难且相较鼠的iPSC研究付出更大代价。
[0003] 人的iPSC经历了使用饲养层细胞培养、无饲养层细胞培养以及无动物源性无饲 养层细胞培养的阶段。1998年Thomson JA.首次分离并稳定持续传代培养得到人胚胎干细 胞（hESC)，当时将hESC培养在包含20% FBS以及其他因子的培养基中，其必须在gelatin 包被的饲养层细胞（feeder，丝裂霉素C处理后的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，失去增殖能 力））上进行维持生长，hESC在该条件下传代培养能够长期维持其多能性和自我更新能力 (Science. 1998Nov6 ;282 (5391) : 1145-7.)。然而由于血清的成分不确定、质量差异、批间 差影响hESC稳定传代以及自我更新和分化的机制研究，也影响涉及人体的无动物源性研 究，后续有人利用血清替代物（KnockOut Serum Replacement，KSR)替代FBS可以稳定持 续的在 feeder 上进行传代培养，（NEngl J Med. 2004Mar 25 ;350 (13) : 1353-6.)迄今为止 KSR加feeder培养hiPSCs的方法广泛使用。然而由于feeder通常来源于小鼠胚胎成纤 维细胞（MEF)，其批间差、动物源性、各类感染源性、成分不确定性等影响实验研究的判断和 进一步深入地应用研究，2001 年 Chunhui Xu 使用 MEF-conditioned medium 在 matrigel 或者其他基质蛋白包被条件下进行无feeder hESC培养（Nat Biotechnol.20010ct; 19(10) : 971-4.)，由此可见MEF分泌的许多因子参与iPSC的自我更新，后续发现TGFB1/ ActivinA/Nodal/bFGF等存在条件下可以维持iPSCs的自我更新能力，基于此Thomson 实验室于2006年公开无feeder无血清无KSR成分明确的iPSCs培养基mTeSRl (Nat Methods. 2006Aug ;3 (8) : 637-46)，该培养基是目前全球科研运用最广泛的iPSCs无feeder 培养基（包含2 %左右的动物源性蛋白，牛血清白蛋白BSA)。尽管mTeSRl的诞生使hiPSC领 域发展迅速，但mTeSRl仍包含大量的BSA，不适宜临床研究，且费用高昂，因此StemCell公 司使用人血清白蛋白（HSA)替代mTeSRl的BSA，以及使用人源的细胞因子，开发出TeSR?2， 该培养基不含任何动物源性物质，适合临床科研相关工作，后续许多各类其他公司也相应 开发出各自特色的的IPSCs培养基。但是TeSR2以及其他同类的培养基仍然包含大量的细 胞因子、蛋白质，成分复杂，且使用效果差于mTeSRl，不能广泛满足基础科研和临床科研的 需求，亦使研究发育和分化的不确定性增加，2011年Thomson实验室确定了八种mTeSRl中 的主要成分的培养基即E8培养基，E8培养基可以长期稳定维持iPSCs多能性和自我更新能 力（Nat Methods. 2011May;8(5):424-9.)。随着全球相关领域广泛使用E8,大家逐步发现 E8有许多不足之处，影响其更深入的应用，其不足之处包括：1.由于不存在HSA或者BSA， 培养基中如果添加促进重编程的小分子化合物或者巯基乙醇等细胞会表现明显的细 胞毒性，不能在高效诱导重编程尤其是极限条件重编程过程中进行应用，影响加入不同的 各种小分子化合物的分化实验，也限制低密度条件下培养hiPSC(我们的实验发现96孔板 中每孔低于2000个hiPSC使用E8进行培养，细胞几乎不能生长，直到细胞达到4000个才 能稳定健康的生长）；2.E8所包含的细胞因子浓度很高，所需成本仍然很高。因此研发具有 大多数小分子或0 _巯基乙醇耐受性以及低密度hiPSC耐受性且成本低的高性能无feeder hiPSC培养基十分迫切。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基。
[0005] 本发明所采取的技术方案是：
[0006] -种无饲养层人多能干细胞培养基，含有如下组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、亚硒 酸钠、重组人胰岛素、人脱铁转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子betal、肝 素锂和/或肝素钠、DMEM/F-12基础培养基。
[0007] 作为优选的，所述无饲养层人多能干细胞培养基中各组分的含量为：L_抗坏血 酸-2磷酸镁60~70 y g/ml，亚硒酸钠10~20ng/ml，重组人胰岛素15~25 y g/ml， 人脱铁转铁蛋白5~15 y g/ml，碱性成纤维细胞生长因子1~100ng/ml，转化生长因 子-betalO. 1 ~2. 0ng/ml，肝素裡 1 ~600ng/ml 和 / 或肝素纳 1 ~400ng/ml，DMEM/F-12 基础培养基补足至1L。
[0008] 进一步地，所述碱性成纤维细胞生长因子的含量优选为10~30ng/ml，转化生长 因子-betal的含量优选为0. 1~1. 0ng/ml，肝素钠的含量优选为100~400ng/ml，肝素锂 的含量优选为100~500ng/ml。
[0009] 本申请的另一个方案，所述培养基中的转化生长因子betal可替换为作用于相同 受体和具备相同功能的细胞因子，例如Nodal。转化生长因子betal和Nodal在本培养基中 的作用是：维持人多能干细胞自我更新能力、多能性以及未分化状态，抑制其自发分化。
[0010] 作为优选的，上述培养基的渗透压至280~350m〇sm〇l/lit er，常用的渗透压调节 剂为氯化钠。
[0011] 作为优选的，所述人多能干细胞基础培养基中还含有碳酸氢钠和/或BMP信号 通路抑制剂，所述BMP信号通路抑制剂优选为Dorsomorphin dihydrochloride、DMH-1、 Noggin、LDN-193189 中的至少一种。
[0012] 作为优选的，所述人多能干细胞基础培养基中碳酸氢钠含量优选为500~ 600 μg/ml，进一步优选为520~570 μg/ml ;BMP信号通路抑制剂的含量优选为10~ 500nM，进一步优选为25~250nM。
[0013] 作为优选的，所述无饲养层人多能干细胞培养基中还含有牛血清白蛋白，含量优 选为0. 05 %~4. 0 %，进一步优选为0. 1 %~2. 0 %，按质量计。
[0014] 作为优选的，所述无饲养层人多能干细胞培养基中还含有Chemically Defined Lipid Concentrate，含量优选为0? 01 %~2. 0 %，进一步优选为0? 05 %~1. 5 %，按体积 计。
[0015] 作为优选的，所述无饲养层人多能干细胞培养基中还含有人血清白蛋白，所述人 血清白蛋白的含量优选为〇. 005 %~2. 0 %，进一步优选为0. 01 %~1. 0 %，按质量计。
[0016] 作为优选的，所述无饲养层人多能干细胞培养基中还含有海藻糖和/或DM0G ;所 述海藻糖的含量优选为0.01%~2%，进一步优选为0. 1%~1%，按质量计；所述DM0G的 含量为l〇nM~2000nM，优选为50~500nM。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 我们开发的培养基在E8基础上将bFGF浓度由100ng/ml降低至最低lng/ml， TGFB1浓度由2ng/ml降低至最低0. lng/ml，不使用ActivinA，加入肝素钠，外加极微量BMP 抑制剂，该培养基我们命名为BioCI (含肝素钠）系列，此培养基为无feeder无动物源性培 养基，在96孔板中每孔种2000个hiPSC，其增殖速度为E8的3倍（种4000个hiPSC时，E8 增殖速度略高于BioCI)，当去除BioCI中的肝素钠时，2000个起始细胞量的96孔板hiPSC 便不能增殖，由此可见BioCI可以有效的进行低密度或正常密度hiPSC维持培养。当向 BioCI 分别加入 BSA 或 Chemically Defined Lipid Concentrate/HSA/海藻糖时（前者成 为BioCISO系列，后者称为BioCISH系列），培养基在低密度和普通密度进行hiPSC培养时， 增殖速度更高，细胞形态和多能性维持的更好，而BioCISO和BioCISH的成本仅相当于E8 的三分之一，也不需要使用昂贵的硫酸乙酰肝素，极大的降低了成本，并且能够满足现阶段 几乎所有的hiPSC维持培养，以及加入各种小分子化合物进行诱导重编程培养（去除TGFB1 和BMP信号通路抑制剂）或者诱导分化培养，同时BioCI系列培养基已经能够很好地满足 hiPSC的单细胞存活和生长，其单细胞存活率较mTeSRl高出3. 5倍，而E8的单细胞存活率 为0,因此该培养基将适合各基础科研、临床科研实验的广泛研究。
[0019] 本发明首次在使用肝素锂，将其替代肝素钠或与肝素钠混合使用，该培养基我们 命名为BioCII (含肝素锂）系列，使用BioCII系列培养基（包含不添加以及添加BSA或 Chemically Defined Lipid Concentrate/HSA/海藻糖的 BioCII、BioCIIS0、BioCIISH)培 养hiPSC，hiPSC在低密度和普通密度进行培养的速度更快（较mTeSRl高出1. 1倍），多能 性和自我更新能力更强，单细胞的存活率更高（较mTeSRl高出4. 5倍）。
[0020] 此外，为了获得更高的hiPSC单细胞存活率，本发明的部分培养基配方添加了 DM0G，使hiPSC在单细胞条件下的存活效率极大地提高（较mTeSRl高出200倍以上），为基 因打靶改造hiPSC以及其他应用提供了重要的工具。
【附图说明】
[0021] 图1 :表1第4组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行核型鉴定的图；
[0022] 图2 :表1第4组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行流式检测多能性标 记物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鉴定结果；
[0023] 图3 :表2第4组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行核型鉴定的图；
[0024] 图4 :表2第4组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行流式检测多能性标 记物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鉴定结果；
[0025] 图5 :表6第5组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行核型鉴定的图；
[0026] 图6 :表6第5组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行流式检测多能性标 记物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鉴定结果；
[0027] 图7 :表8第6组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行核型鉴定的图；
[0028] 图8 :表8第6组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行流式检测多能性标 记物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鉴定结果；
[0029] 图9 :表9第16组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行核型鉴定的图；
[0030] 图10 :表9第16组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行流式检测多能性 标记物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鉴定结果；
[0031] 图11 :表13第7组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行核型鉴定的图；
[0032] 图12 :表13第7组培养基培养人胚胎干细胞HN4 50代后，进行流式检测多能性 标记物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鉴定结果。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0034] -、以下实施例中所用的到的试剂如下所示：
[0035] DMEM/F-12 培养基（1:1 基础培养基），碳酸氢钠（NaHC03, CAS 号 144-55-8)，L-抗 坏血酸-2 磷酸儀（L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium，CAS 号：113170-55-1)， 亚硒酸钠（Sodium selenite，CAS 号：10102-18-8)，重组人胰岛素（insulin，CAS 号： 11061-68-0)，人脱铁转铁蛋白（transferrin，CAS号：11096-37-0)，碱性成纤维细胞 生长因子（bFGF)，转化生长因子 betal (TGFB1)，Dorsomorphin dihydrochloride (CAS 号：1219168-18-9)，Chemically Defined Lipid Concentrate (Gibco,货号 11905-031)，牛 血清白蛋白（BSA)，重组人血清白蛋白（HSA)，海藻糖（CAS号：6138-23-4)，肝素钠Ofeparin sodium salt，CAS 号：9041-〇8_1)，肝素裡（Heparin lithium salt, CAS 号：9045-22_1) 〇
[0036] 二、检测以下各实施例的培养基对单细胞人多能干细胞的存活效果的影响可采用 如下方法：
[0037] 1、MTT 法：
[0038] 消化、计数好细胞后，用培养基母液吹匀细胞，铺到96孔板中，每个孔中种2000个 细胞，种5个复孔，然后分别补入对应的培养基至终体积150ul，每天都要换相应的培养基， 细胞放置37°C，5% 0)2培养箱中培养。dayl，day5测MTT值：
[0039] 2、AP 染色法
[0040] 消化、计数好细胞后，用培养基母液吹匀细胞，铺到96孔板中，每个孔中种1个细 胞，每组种2000个单细胞孔，然后分别补入对应的培养基至终体积150ul，培养基中加入 0. 5uM thiazovivin(后续的培养基中都不添加thiazovivin)。细胞放置37°C，5% (302培 养箱中培养。前2~3天，不换液，day4~daylO是隔一天换液，dayll~dayl4,每天换液， day 15AP染色检测单克隆数量。
[0041] 三、通过核型鉴定及流式检测多能性标记物（Marker)检测利用本发明培养基长 期培养人IPSC超过50代的情况下，是否能良好地维持人IPSC的染色体稳定、多能性以及 自我更新能力。
[0042] ( -）核型鉴定方法：
[0043] 1 ?实验试剂：
[0044] 20 y g/ml 秋水仙素；PBS ;生理盐水；0? 25% trypsin ;0? 075M氯化钾溶液；MEF ;卡 诺固定液；Giemsa染色液；3% Tris。
[0045] 2.实验用品：
[0046] 37°C恒温培养箱；移液枪（100 y 1，1ml);低速离心机；恒温水浴锅；载玻片；胶头 滴管；烘箱；酸缸；染色缸；显微镜。
[0047] 3?实验步骤
[0048] 3. 1细胞准备
[0049] 生长状态良好，去feed，无分化，生长密度在80~90%之间。
[0050] 3. 2秋水仙素处理
[0051] 培养终止前在培养基的量加入浓度为20 y g/ml的秋水仙素，使其终浓度为 0. 2 y g/ml，37°C培养箱中处理100~130min(时间根据不同细胞有所不同，本实验室一般 小鼠ips细胞处理时间为60min，人ips细胞处理130min)。
[0052] 3. 3低渗处理
[0053] 秋水仙素处理完后，先吸弃培养液，用PBS洗两次，加入0. 5ml0. 25%胰酶消化，轻 轻敲打培养皿，使未脱落的细胞脱落，加入lmlMEF终止消化，用吸管吸取转移入15ml离心 管，离心（1200rpm，5min)，收集细胞。然后加入37°C预热的0.075mol/LKCL溶液7ml，用吸 管吹打成细胞悬液，置37°C水浴处理18-28min(根据不同细胞有所不同，本实验室一般小 鼠ips细胞低渗28-30分钟，人ips细胞低渗18-20分钟）。
[0054] 3. 4预固定
[0055] 新鲜配制卡诺固定液（甲醇冰醋酸3:1配制），用胶头滴管加入约1ml固定液进行 预固定3min 〇
[0056] 3. 5 固定
[0057] 预固定后，1200r/min离心5min，弃上清，加入约7ml新鲜的固定液，用胶头滴管轻 轻打勾，于37°C水浴固定40min。
[0058] 3. 6 滴片
[0059] 固定完成后，1200r/min离心5min，然后用胶头滴管吸弃大部分固定液，留部分固 定液（根据细胞的量确定留液多少）重悬细胞，距离载玻片30cm左右距离滴片。注意使用 冰冻干净的载玻片进行滴片。
[0060] 3. 7 烤片
[0061] 滴片后马上把载玻片移进75°C烘箱烘3h。
[0062] 3. 8染色（G显带）
[0063] 往551111生理盐水加入0.038胰酶粉，轻轻摇匀，用3%1^18调节其？11约为7.2。 将制片放入胰酶消化液处理8秒后，迅速放入生理盐水终止其消化，再放入Giemsa染液染 色5~lOmin,然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两面，室温干燥或电吹风吹干。
[0064] 3. 9 镜检
[0065] 待玻片干后，在显微镜下检查，先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观 察。
[0066] 3. 10分析（对染色体数目，带型进行分析）
[0067] (二）流式检测多能性多能性标记物（Marker):
[0068] 1.用0. 25%胰酶消化细胞，离心，之后用PBS重悬细胞，转移到1. 5ml的EP管中。
[0069] 2?加入 200ull%多聚甲醛，37°C，5-10min。
[0070] 3?离心，用PBS洗1次，之后加入200ul90%甲醇，冰上30min.(甲醇要先预冷）。
[0071] 4?离心，用 PBS 洗 2 次。加一抗（抗体 1 :50 稀释），加 50ul，37°C，30min。
[0072] 5?离心，用 PBS 洗 1-2 次，加二抗（抗体 1 :500 稀释），加 100ul，37°C，30min，加 二抗要避光。
[0073] 6?用PBS洗1次，之后用300ulPBS重悬，过滤，上机，收488 (绿色）或568 (红色） 阳性细胞。
[0074] 下面开始检测本发明不同的无饲养层人多能干细胞培养基对单细胞人多能干细 胞的培养效果，以E8和mTeSRl培养基作为对照。
[0075] 四、以下实施例中各组培养基的制备方法：
[0076] 称取基础培养基DMEM/F12粉末，用超纯水将其完全溶解；称取其他各成分，分别 溶解，调节好pH值，逐一加入基础培养基中；冰上搅拌，充分混匀后定容，调节渗透压，过滤 灭菌，分装，一 l〇°C以下保存。
[0077] 实施例 1 (BioC I )
[0078] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表1所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0079] 利用以下各组培养基培养人iPSC 50代后，对人iPSC进行核型鉴定及流式检测多 能性Marker，第4组培养基的检测结果如图1和图2所示。
[0080] 表1无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0081]
[0083] 以上实验数据表明：在培养基中添加肝素钠可以促进人iPSC (包括ESC和iPSC) 的增殖速度及单细胞存活率。
[0084] 实施例 2 (BioC II )
[0085] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表2所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0086] 利用以下各组培养基培养人iPSC50代后，对人iPSC进行核型鉴定及流式检测多 能性Marker，第4组培养基的检测结果如图3和图4所示。
[0087] 表2无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0088]
[0090] 以上实验数据表明：在培养基中添加肝素锂可以促进人iPSC (包括ESC和iPSC) 的增殖速度及单细胞存活率。
[0091] 实施例 3(BI0C I /BIOC II )
[0092] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表3所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0093] 表3无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0094]
[0096] 以上实验数据表明：肝素钠和肝素锂配合使用同样可以促进人iPSC (包括ESC和 iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0097] 实施例 4(BI0C I -2)
[0098] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表4所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0099] 表4无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0100]
[0102] 以上实验数据表明：培养基中添加碳酸氢钠和Dorsomorphin dihydrochloride 可以促进人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0103] 实施例 5(BioC I -3)
[0104] 本实施例检测培养基中各组分的浓度改变对培养基性能的影响。根据MTT法和AP 法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0105] 表5无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0106]
[0108] 以上实验数据表明：本发明的培养基在L-抗坏血酸-2磷酸镁60~70 y g/ml，亚 硒酸钠10~20ng/ml，重组人胰岛素15~25 y g/ml，人脱铁转铁蛋白5~15 y g/ml，碱性 成纤维细胞生长因子1~100ng/ml，转化生长因子-betal 0? 1~2. Ong/ml，肝素钠1~ 400ng/ml，碳酸氢钠500~600 y g/ml ;BMP信号通路抑制剂10~500nM的浓度范围内，均 可以促进人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0109] 实施例 6(BioC I SO)
[0110] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表6所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0111] 利用以下各组培养基培养人iPSC 50代后，对人iPSC进行核型鉴定及流式检测多 能性Marker，第5组培养基的检测结果如图5和图6所示。
[0112] 表6无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0115] 以上实验数据表明：培养基中添加牛血清白蛋白可以显著提高人iPSC(包括ESC 和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0116] 实施例 7(BI0C I SH3S，BioC II SH3S)
[0117] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表7所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0118] 表7无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0121] 以上实验数据表明：培养基中添加Chemically Defined Lipid Concentrate可以 显著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0122] 实施例 8(BioC II SH)
[0123] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表8所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0124] 利用以下各组培养基培养人iPSC 50代后，对人iPSC进行核型鉴定及流式检测多 能性Marker，第5组培养基的检测结果如图7和图8所示。
[0125] 表8无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0128] 以上实验数据表明：Chemically Defined Lipid Concentrate和重组人血清白蛋 白组合使用可以促进人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0129] 实施例9
[0130] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表9所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0131] 利用以下各组培养基培养人iPSC 50代后，对人iPSC进行核型鉴定及流式检测多 能性Marker，第15组培养基的检测结果如图9和图10所示。
[0132] 表9无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0135] 以上实验数据表明：培养基中添加海藻糖和DMOG(nM)可以显著提高人iPSC(包括 ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0136] 实施例10
[0137] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表10所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0138] 表10无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0142] 以上实验数据表明：培养基中添加海藻糖和DM0G，配合碳酸氢钠、Dorsomorphin dihydrochloride使用可以显著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活 率。
[0143] 实施例11
[0144] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表11所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0145] 表11无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0147]
[0148] 以上实验数据表明：培养基中添加海藻糖和DM0G配合牛血清白蛋白使用可以显 著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0149] 实施例12
[0150] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表12所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0151] 表12无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0154] 以上实验数据表明：培养基中添加海藻糖和DM0G配合Chemically Defined Lipid Concentrate使用可以显著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及单细胞存活率。
[0155] 实施例13
[0156] 本发明提供的无饲养层人多能干细胞培养基的其中一个方案，各培养基的配方如 表13所示。根据MTT法和AP法检测单细胞人iPSC在各培养基中的存活率。
[0157] 利用以下各组培养基培养人iPSC 50代后，对人iPSC进行核型鉴定及流式检测多 能性Marker，第7组培养基的检测结果如图11和图12所示。
[0158] 表13无饲养层人多能干细胞培养基配方
[0161] 以上实验数据表明：培养基中添加海藻糖、DMOG、Chemically Defined Lipid Concentrate配合重组人血清白蛋白使用可以显著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖 速度及单细胞存活率。
[0162] 以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本 发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【主权项】
1. 一种无饲养层人多能干细胞培养基，其含有如下组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、亚硒 酸钠、重组人胰岛素、人脱铁转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子betal、肝 素锂和/或肝素钠、及DMEM/F-12基础培养基。2. 根据权利要求1所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述无饲养层 人多能干细胞培养基中各组分的含量为：L-抗坏血酸-2磷酸镁60~70 μ g/ml，亚硒酸钠 10~20ng/ml，重组人胰岛素15~25 μ g/ml，人脱铁转铁蛋白5~15 μ g/ml，碱性成纤维 细胞生长因子1~l〇〇ng/ml，转化生长因子-betal 0.1~2.0 ng/ml，肝素锂1~600 ng/ ml和/或肝素钠1~400 ng/ml，DMEM/F-12基础培养基补足至1L。3. 根据权利要求1所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述转化生长 因子betal可替换为作用于相同受体和同样具备维持人多能干细胞自我更新能力、多能性 以及未分化状态，抑制其自发分化功能的细胞因子，例如Nodal。4. 根据权利要求1-3任一项所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述 培养基的渗透压调节至280~350 mosmol/liter。5. 根据权利要求1-4任一项所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述 人多能干细胞基础培养基中还含有碳酸氢钠和/或BMP信号通路抑制剂，所述BMP信号通 路抑制剂优选为 Dorsomorphin dihydrochloride、DMH-1、Noggin、LDN-193189 中的至少一 种。6. 根据权利要求5所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述人多能干 细胞基础培养基中碳酸氢钠含量优选为500~600 μ g/ml ;BMP信号通路抑制剂的含量优 选为10~500 nM。7. 根据权利5所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述无饲养层人多 能干细胞培养基中还含有牛血清白蛋白，含量优选为〇. 05%~4%，按质量计。8. 根据权利要求5所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述无饲养 层人多能干细胞培养基中还含有Chemically Defined Lipid Concentrate，含量优选为 0. 01%~2. 0%，按体积计。9. 根据权利要求8所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述无饲养层 人多能干细胞培养基中还含有人血清白蛋白，所述人血清白蛋白的含量优选为〇. 05%~ 4%，按质量计。10. 根据权利要求1-4、6-9任一项所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在 于，所述无饲养层人多能干细胞培养基中还含有海藻糖和/或DM0G ;所述海藻糖的含量为 0. 01%~2%，按质量计；所述DM0G的含量为10nM~2000nM。11. 根据权利要求5所述的无饲养层人多能干细胞培养基，其特征在于，所述无饲养层 人多能干细胞培养基中还含有海藻糖和/或DM0G ;所述海藻糖的含量优选为0. 01%~2%， 按质量计；所述DM0G的含量优选为10nM~2000 nM。
【文档编号】C12N5/074GK106032527SQ201510117121
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月17日
【发明人】王淋立, 陈月花, 宋立兵
【申请人】广州市搏克肿瘤研究所, 王淋立