一种具有放射增敏作用的化合物及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种具有放射增敏作用的化合物及其应用，该化合物对p53野生型与p53突变型的肿瘤细胞均具有增殖抑制作用，并能够降低两种细胞的TG2基因表达，而p53基因表达无明显变化。将该化合物与IR联合处理，两细胞均显示明显的细胞凋亡升高和明显的周期阻滞，放射敏感性显著提高，TG2基因表达显著降低。故而，该化合物对p53野生型与p53突变型的肿瘤细胞均具有显著的放射增敏作用，将其作为放射增敏剂活性成分应用于肿瘤的放射治疗中，尤其是应用于p53信号通路过度激活且电离辐射诱导后p53信号通路激活增强的肿瘤的放射治疗中，有望大幅提高肿瘤的放疗效果。
【专利说明】
一种具有放射増敏作用的化合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学和制药领域，具体涉及一种具有放射增敏作用的化合物及其 应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是遍及全球的一个主要的健康问题。肺癌是最常见的恶性肿瘤，其发生率为 肿瘤发病率的12.4%，死亡率高达17.8%。在中国，由于容易导致肺癌发生的吸烟行为一直 未能得到有效控制，再加上近年来的环境恶化因素，肺癌发病和死亡更是呈现逐年上升趋 势。
[0003] 放射治疗是癌症的常规治疗手段之一，对于肺癌来说也是如此。虽然目前放疗技 术不断的发展，但是肿瘤放疗失败的几率仍然较高，其主要原因在于肿瘤细胞辐射耐受的 存在。因此，放射敏感性是放疗疗效的关键，寻找合适的放射增敏的基因靶点及相应药物是 研究热点。
[0004] 作为放射增敏的基因靶点，P53基因与放射敏感性研究一直以来都是研究的热点， 多项研究表明，放射敏感性与P53基因有着密切关系。p53信号通路对于在放射治疗中的放 射线诱导的肿瘤细胞DNA损伤和修复及凋亡发挥非常重要的作用。p53基因在机体组织细胞 的生长、发育与分化等过程中起重要作用，其主要生物学功能是DNA修复、阻滞细胞周期、抑 制血管生成、诱导细胞凋亡。多数研究认为野生型P53基因在控制细胞周期停滞、DNA修复或 细胞凋亡方面起了重要的作用，故只有野生型P53基因才具有放射增敏作用，能在放射线诱 导下引起细胞凋亡;P53基因突变后，则丧失了正常的功能，肿瘤放射治疗后凋亡过程受到 抑制，表现出对放射治疗的抗拒性，故突变型P53基因不会放射增敏（Nature，1993,362 (6423) :847-849)。而根据临床检测显示，超过60%的肺癌患者的p53基因具有不同程度的 突变。因此，寻找基于放射增敏的基因靶点P53基因的合适的放射增敏药物已经显得至关重 要，尤其是，寻找一种对于野生型P53基因和突变性p53基因均具有显著放射增敏作用的放 射增敏剂，对于肿瘤尤其是肺癌的放射治疗有着重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有放射增敏作用的化合物及其应用，该化合物对 P53野生型与p53突变型的肿瘤细胞均具有显著的放射增敏作用，将其作为放射增敏剂活性 成分应用于肿瘤的放射治疗中，有望大幅提高肿瘤的放疗效果。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种具有放射增敏作用的化合物，其结构式如下式（I) 所示：
[0008] 本发明的第二方面，提供了所述化合物在制备治疗肿瘤的放射增敏剂中的用途。
[0009] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，优选地，所述肿瘤为耐放射肿瘤。
[0010] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，优选地，所述肿瘤为肺癌。
[0011] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，优选地，所述化合物在对肺癌细胞无细 胞毒性的〈20% IC50药物浓度下具有放射增敏作用。
[0012] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，优选地，所述肿瘤为P53信号通路过度激 活且电离辐射诱导后P53信号通路激活增强的肺癌。
[0013] 就本发明的上述用途，在肿瘤的放射治疗的过程中，在放射疗法的同时或之前，所 述放射增敏剂处理肿瘤区域。
[0014] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，优选地，所述处理为放射增敏剂的瘤内 注射。
[0015] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，优选地，所述放射使用来自线性加速器 的X射线束或电子束来进行。
[0016] 在本发明的上述用途的一些实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐与药 学上可接受的载体组成肿瘤放射增敏的药用组合物。
[0017]本发明中，以肺癌为例，对于稳定转染的P53野生型肺腺癌细胞H1299/WT与p53突 变型肺腺癌细胞H1299/175,以本发明的结构式如下式(I)所示的具有放射增敏作用的化合 物作为放射增敏剂，采用MTT比色法检测所述放射增敏剂对于两种细胞系的增殖抑制作用， 采用集落存活分析法检测不同放射剂量照射后两者细胞的存活分数，用单击多靶点模型和 线性二次函数模型(LQ模型)拟合细胞辐射剂量存活曲线分别求出放射生物参数D0、Dq、N、 SF2和α、β及放射增敏比SER;通过流式细胞术检测两种细胞系各组的细胞凋亡和细胞周期 的改变;荧光RT-PCR检测各处理组中ρ53基因、TG2表达，western blot检测周期及凋亡相关 蛋白表达的改变，采用ELISA技术检测细胞核、细胞浆、线粒体中的Cyt-C的含量。
[0018] 结果显示：所述放射增敏剂对于p53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺癌 H1299/175细胞均具有增殖抑制作用，能够降低两细胞的TG2基因表达，而p53基因表达无明 显变化。所述放射增敏剂与IR联合处理，两细胞均显示明显的细胞凋亡升高和明显的周期 阻滞，放射敏感性显著提高，TG2基因表达显著降低，细胞色素 C表达均明显上升;不同的是， P53野生型肺癌H1299/WT细胞阻滞在G0+G1期，p53基因表达上升，细胞核内细胞色素 C下降， P21，BAX，磷酸化CASPASE-3蛋白表达明显上升，CyclinB表达没有明显变化，CyclinD，bcl-2 表达降低；而P53突变型肺癌H1299/175细胞阻滞在G2+M期，p53基因表达无改变，线粒体内 细胞色素 C下降，P21，BAX，CyclinD表达无明显变化，CyclinB，bcl-2表达明显降低，磷酸化 CASPASE-3蛋白表达升高。
[0019] 从而，可以推测出野生型与突变型的增敏机制有所不同，野生型细胞TG2表达抑 制，激活了p53通路，增加 P21蛋白表达，从而影响细胞周期，通过ΒΑΧ蛋白的表达使Cyt-C从 细胞核释放之胞浆，引起细胞凋亡；突变型细胞TG2表达抑制，通过抑制bcl-2使得细胞阻滞 在G2+M期，并促使线粒体内Cyt-C释放至胞浆，启动凋亡通路，引起细胞凋亡。但是，无论是 对于P53野生型肺癌H1299/WT细胞还是p53突变型肺癌H1299/175细胞，本发明的结构式如 (I)所示的具有放射增敏作用的化合物均能有效抑制TG2蛋白的表达，显著提高放射敏感 性，具有非常明显的放射增敏效果。由此可见，本发明所述放射增敏剂不但可以应用于制备 联合放射治疗肺癌的放射增敏药物，而且，将本发明所述放射增敏剂应用于制备联合放射 治疗肿瘤的放射增敏药物也具有普遍适用性，尤其是当肿瘤为P53信号通路过度激活且电 离辐射诱导后P53信号通路激活增强的肿瘤时尤为适用。
【附图说明】
[0020]图1A是本发明所合成的具有放射增敏作用的化合物的HPLC谱图。
[0021 ]图1B是本发明所合成的具有放射增敏作用的化合物的HNMR谱图。
[0022]图2是根据MTT比色法测定数据绘制的放射增敏剂(RSA)作用下HI 299/WT细胞抑制 曲线和H1299/175细胞抑制曲线。纵坐标为抑制率，横坐标为放射增敏剂浓度的对数。
[0023]图3A是H1299/WT细胞和H1299/175细胞经放射处理（IR)的存活曲线(实线）以及相 应的单击多靶点拟合曲线(虚线）。
[0024]图3B是H1299/WT细胞分别经放射处理（IR)和联合处理（RSA+IR)的存活曲线（实 线)和以及相应的单击多靶点拟合曲线(虚线）。
[0025]图3C是H1299/175细胞分别经放射治疗（IR)和联合治疗(RSA+IR)的存活曲线（实 线)和以及相应的单击多靶点拟合曲线(虚线）。
[0026]图4-1A、图4-1B、图4-1C和图4-1D分别是流式细胞术检测经由对照组(C)、放射增 敏剂组(RSA)、放射处理组（IR)和联合处理组(RSA+IR)处理的H1299/WT细胞凋亡图。其中， 各图中横轴表示的是Annexin V的染色分布，纵轴显示的是细胞的PI染色分布。
[0027] 图4-2A、图4-2B、图4-2C和图4-2D分别是流式细胞术检测经由对照组(C)、放射增 敏剂组(RSA)、放射处理组（IR)和联合处理组(RSA+IR)处理的H1299/175细胞凋亡图。其中， 各图中横轴表示的是Annexin V的染色分布，纵轴显示的是细胞的PI染色分布。
[0028]图5-1A、图5-1B、图5-1C和图5-1D分别是流式细胞术检测经由对照组(C)、放射增 敏剂组(RSA)、放射处理组（IR)和联合处理组(RSA+IR)处理的H1299/WT细胞周期图。其中， 各图中横坐标代表DNA含量(DNA Content)，纵坐标代表细胞数(Cell Number)。
[0029] 图5-2A、图5-2B、图5-2C和图5-2D分别是流式细胞术检测经由对照组(C)、放射增 敏剂组(RSA)、放射处理组（IR)和联合处理组(RSA+IR)处理的H1299/175细胞周期图。其中， 各图中横坐标代表DNA含量(DNA Content)，纵坐标代表细胞数(Cell Number)。
[0030] 图6是荧光定量RT-PCR检测经放射处理（IR)和联合处理(RSA+IR)后H1299/WT细胞 和H1299/175细胞中TG2表达的结果图。
[0031] 图7是H1299/WT细胞和H1299/175细胞分别经放射处理（IR)和联合处理(RSA+IR) 后采用免疫印迹(western blot)检测蛋白Bax，bcl-2，P21，磷酸化CASPASE-3，CyclinB， CyclinD表达的结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实 施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0033] 下列实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条 件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得 的常规产品。
[0034] 一、材料说明
[0035] 二甲基亚砜(01^0)、1^]\〇-1640培养基及胎牛血清购自6180)公司。0.25%胰蛋白 酶和0.02%二乙烯四乙酸二钠(EDTA)购买自GIBC0公司。细胞周期ABC试剂盒为美国BD公司 (Becton,Dickinson and Company)产品（货号340242)，Annexin V FITC/PI细胞凋亡检测 试剂盒为BD公司产品。mRNA及蛋白提取试剂盒为QIAGEN公司AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit(货号：80004)。抗体均购自美国ABCAM公司。细胞核蛋白、胞浆蛋白及线粒体蛋白 分离试剂盒均购自碧云天生物科技有限公司。Cyt-C-ELISA为R&D systems Inc .Minneapolis产品。
[0036] 人肺腺癌细胞株H1299/WT和H1299/175由美国加州大学洛杉矶分校的陈旭峰教授 惠赠，其制备方法如下：
[0037] H1299细胞在6孔细胞培养板铺板后，第二天用Invitrogen公司的 Lipofectamine2000试剂转染相应质粒DNAJ2小时后用含有500ug/mL的G418的细胞培养液 进行筛选。两周后，筛选成活的细胞用Western blot验证p53蛋白的表达。
[0038] H1299细胞（人肺腺癌细胞株H1299)购自美国ATCC细胞库（American Type of Cell Culture)。
[0039] 制备人肺腺癌细胞株H1299/WT的质粒为含野生性p53gene的质粒pcDNA3.1-wt-p53(其制备方法具体请见：Xufeng Chen,Jeffrey YC Wong,Patty Wong,Eric Radany.Low Dose Valproic Acid Enhances Radiosensitivity of Prostate Cancer through Acetylated p53-Dependent Modulation of Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis .Mol Cancer Res · 201 lApr; 9(4): 448-461)，是通过将野生型p53的片段PCR扩增 后，在BamHI和EcoR V位点插入pcDNA3.1-C(invitrogen)获得的，其中，编码野生型p53的质 粒为pCMV-Ne〇-Bam_p53wt质粒（可购得，addgene公司编号为#16434质粒，见https : // www.addgene.org/16434/)〇
[0040] 制备人肺腺癌细胞株H1 299/175的质粒为编码突变型175位点p53的质粒 pcDNA3 · l_p53_R175H，其是米用了 Invitrogen公司的Mutagenesis Kit在质粒pcDNA3 · 1-wt-p53的基础上通过点突变PCR构建完成，其制备方法具体请见:Zhen Li，Yin Sun，Xufeng Chen, Jill Squires,Behdokhd Nowroozizadeh,Chaozhao Liang,Jiaoti Huang.p53Mutation Directs AURKA Overexpression via miR_25and FBXW7in Prostatic Small Cell Neuroendocrine Carcinoma.Mol Cancer Res.2015March；13(3): 584-591〇
[00411质粒中野生性p53及突变型175位点p53的基因序列均经过基因测序验证。空载体 质粒pcDNA3 · 1源自 Invitrogen公司。
[0042] 二、具有放射增敏作用的化合物的合成与鉴定
[0043] 具有放射增敏作用的化合物（以下记为RSA)，其结构式如下式(I)所示：
[0045]该化合物由本申请发明人进行结构设计，并委托上海宜方生物科技有限公司合 成，将本发明所公开的式（I)所示的结构式提供给该公司，可以购得该化合物。以下给出了 如式(I)所示的化合物的其中一条合成路线：
[0047] 根据上述合成路线的一种制备方法，包括以下步骤：
[0048] (1)将6.16g(40mmol)的3,4-二羟基苯甲酸(化合物2)溶于200mL的DMF溶剂中，在 冰浴下向其中加入8.05g(42mmol)EDCI(l-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）、 5.67g(42mmol)HoBt(l-羟基苯并三唑）和4.25g(42mmol)的三乙胺，在室温下搅拌30分钟。 在室温下向其中加入9.48g(40mmol)的L-酪氨酸叔丁酯(化合物1)并且搅拌过夜。向反应混 合物中加水并用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层后，用水和饱和氯化钠溶液洗涤，并用硫酸 镁干燥。过滤掉干燥剂，并将滤液减压浓缩后，使用硅胶层析柱(洗脱溶剂：乙酸乙酯/正己 烷= 1/4-1/1)提纯，得到(3,4_二羟基苯甲酰)-L-酪氨酸叔丁酯(化合物3)。
[0049 ] (2)将15.11 g (40.8mmo 1)的（3，4-二羟基苯甲酰)-L-酪氨酸叔丁酯(化合物3)溶于 80mL的DCM溶剂中，再向其中加入80mL的TFA溶剂，室温搅拌12小时后，减压除去溶剂，将粗 产物经乙酸乙酯/正己烷柱层析后重结晶纯化，得到9.01g(3,4-二羟基苯甲酰)-L-酪氨酸 叔丁酯(化合物3)。
[0050] 将9.01g(28.4mmol)的（3,4-二羟基苯甲酰）-1^-酪氨酸叔丁酯（化合物3)溶于 200mL的DMF(二氯甲烷）溶剂中，在冰浴下向其中加入5.73g(29.8mmol)EDCI、4.03g (29.8mmol)HoBt和3.01g(29.8mmol)的三乙胺，在室温下搅拌30分钟。在室温下向其中加入 5.09g (28.4mmo 1)的（3-溴-4，5-二氢-5-异噁唑）-甲胺(化合物5)并且搅拌过夜。向反应混 合物中加水并用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水和饱和氯化钠溶液洗涤，并用硫酸镁 干燥。过滤掉干燥剂，并将滤液减压浓缩后，使用硅胶层析柱(洗脱溶剂：乙酸乙酯/正己烷 =1 /8-1 /4)提纯，得到如式（I)所示的目的产物(化合物4) (10.42g，77% )。
[0051 ]对所合成的目的产物进行高效液相色谱(HPLC)和核磁共振氢谱(HNMR)检测，以确 定其结构式和纯度。高效液相色谱谱图如图1A所示，核磁共振氢谱谱图如图1B所示。
[0052]通过对图1A的数据进行分析，所合成的化合物的HPLC谱（实线z)中的四个峰的数 据如下表1所示：
[0053]表1:HPLC谱图分析数据
[0055]根据谱图以及分析数据，可以确定所合成的化合物的纯度为95.05%，符合使用要 求。
[0056] 通过对图1B的数据进行分析，可以确定所合成的化合物的分子式为:C2〇H2〇BrN3〇6， 精确分子量(Exact Mass):477 ·0535，分子量(Molecular Weight):478· 2933，化学名称为： N-((2S)-1-((3-brom〇-4,5-dihudroisoxazol-5-yl)methy)amino)-3-(4-hydroxyphenyl)-l_oxopropan-2-yl)-3，4_dihydroxybenzamide，结构式如上式⑴所不。 [0057] 三、人肺腺癌细胞H1299/WT和H1299/175细胞培养
[0058] 将细胞置于含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37°C、5 %C02饱和湿度孵育 箱中培养，用〇. 25 %胰蛋白酶和0.02 %二乙烯四乙酸二钠(EDTA)消化传代，取对数生长期 细胞作为后续实验用细胞。
[0059]四、放射增敏药物配制
[0060]将上述具有放射增敏作用的化合物(RSA)溶解于DMS0配制成浓度为lmol/L的母 液，保存备用。实验时用DMS0稀释至所需浓度。
[0061 ] 五、MTT比色法测定抑制率
[0062] 分别取对数生长期的H1299/WT细胞和H1299/175细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并 吹打为细胞悬液，计数细胞后调整悬液的细胞浓度为2.5 X 104/ml。分别接种H1299/WT细胞 和H1299/175细胞于96孔细胞培养板，每孔终体积为200μ1(细胞数为5000/孔）。
[0063] 将96孔板移入37°(：、5^^02饱和湿度孵育箱中培养24小时贴壁后，弃去培养液，换 成含有梯度浓度的上述具有放射增敏作用的化合物(RSA)的培养液。对照组为含有细胞的 等体积培养液(RSA浓度为0)，每一浓度设8个复孔，置于37 °C、5 % C02饱和湿度孵育箱中继 续培养48h，采用MTT法检测其各自的吸光度，计算各组抑制率，绘制曲线。细胞抑制曲线图 如图2所示。
[0064]细胞抑制曲线图2显示:该具有放射增敏作用的化合物(RSA)对肺癌细胞具有抑制 作用，对H1277/WT、H1299/175细胞均具有一定的抑制，在各浓度组下两者抑制率均无统计 学差异（P>〇.〇5)。通过曲线计算在RSA浓度为3.91ymol/L下H1277/WT细胞的抑制率为 (15.33±1.46)%，!11299/175细胞的抑制率为（14.31±1.90)%。
[0065]四、放射敏感性实验
[0066]药物作用后，对细胞生长抑制率在20 %以内时，药物对细胞的毒性作用可相对忽 略，因此选择上述化合物作用48小时抑制细胞增殖20%以内的浓度如3.91ymol/L进行克隆 形成试验：
[0067] 分别取对数生长期的H1299/WT细胞和H1299/175细胞，消化成单细胞悬液，按梯度 倍数稀释成1〇2~1〇4细胞/孔，根据不同的照射剂量将不同数量的细胞分别接种于6孔细胞 培养板中，X线照射剂量点分别为〇、1、2、4、6、8、10Gy，每个剂量点设3个复孔。在37°C、5 % C02饱和湿度的孵箱中培养24h贴壁后进行分组处理，分组为：单纯放疗组(记为IR)和药物 联合放疗组(记为RSA+IR)。药物联合放疗组加入浓度为3.91ymol/L的RSA药物，单纯放疗组 加入不含药物的等量培养液，培养24h后照射，照射后继续培养24h，然后更换无药培养基， 静置于培养箱中继续培养8天，甲醇固定后Gi emsa染色，计数各孔细胞数多50个细胞的集落 数。计算集落形成率(PE)和细胞存活率(surviving fraction，SF)。
[0068] 集落形成率(PE)=集落数/接种细胞数X 100% ;
[0069] 细胞生存分数(SF)=各照射剂量PE/未照射PEX 100%。
[0070]根据计算的细胞存活率绘制各组细胞的存活曲线，分别如图3A、图3B、图3C中的实 线所示。采用单击多靶点模型和线性二次函数模型（LQ模型）拟合细胞辐射剂量存活曲线 (拟合的存活曲线如图3A、图3B、图3C中的虚线所示），计算各组放射生物参数:终斜率Do值、 准阈剂量Dq值、外推值N、SF2值和α、β，以及使用药物后的放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER)。放射增敏比（SER)=单纯照射的SF2值/照射加药的SF2值。
[0071] 对H1299/WT和H1299/175细胞同时进行实验，结果见表2:
[0072]表2:各组的放射生物参数
[0074]由表2可以观察其放射敏感性的差异及具有放射增敏作用的化合物(RSA)对不同 细胞的增敏效果差异。对于H1299/WT和H1299/175细胞，相对于单纯照射组，加药照射组中 放射生物参数Dq、D0、N、SF2、β值均减小，α值均增大，显示均能提高放射敏感性;SF2减小均 具有统计学差异(P〈〇 . 05);加药处理H1299/175细胞的放射增敏比SER为1.55，加药处理 H1299/WT细胞的放射增敏比SER为1.65,但加药H1299/WT和H1299/175两细胞的增敏比SER 无统计学差异(P>〇.〇5)。
[0075]五、细胞周期改变及凋亡实验
[0076] 分别取对数生长期的H1299/WT细胞和H1299/175细胞，消化成单细胞悬液，按2X 1〇5细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，在37°C、5%C02饱和湿度的孵箱中培养24h贴壁后进行 分组处理，分组为：对照组（C)、单纯加药组(RSA)、单纯放疗组（IR)、以及药物联合放疗组 (RSA+IR)，每组每种细胞检测指标3复孔。RSA的药物干预浓度为3.91ymol/L，对照组及单纯 放疗组均加入1640培养液，给予照射的实验组的照射剂量是4Gy。处理结束后各组更换不含 药物培养液(药物加入组需要经RSA孵育24h后再更换），在37°C、5%⑶ 2饱和湿度的孵箱中 继续培养48h，收集细胞。采用BD公司ABC试剂盒，行流式细胞术检测细胞周期；按BD公司 Annexin V FITC/PI试剂盒，行流式细胞术检测细胞凋亡。
[0077] 细胞周期及凋亡显示，实验24h后，各组细胞均出现了不同程度的细胞凋亡现象。 显微镜观察联合组两细胞H0ST33258染色后，核染色强度明显，显示凋亡现象明显。
[0078] 流式细胞术检测H1299/WT细胞凋亡结果：与对照组(Control)、放疗组（IR)及药物 组(RSA)相比，药物联合放疗组(RSA+IR)凋亡(Apoptosis)显著上升，该区别具有统计学差 异(P〈0.05)。
[0079] 流式细胞术检测H1299/175细胞凋亡结果：与对照组(Control)、放疗组（IR)及药 物组(RSA)相比，药物联合放疗组(RSA+IR)凋亡(Apoptosis)显著上升，该区别具有统计学 差异(P〈0.05)。
[0080] 以上具体数据请见表3、图4-1A、图4-1B、图4-1C、图4-1D和图4-2A、图4-2B、图4-2C、图4-2D。
[00811 流式细胞术检测H1299/WT细胞周期结果：与对照组(Control)、放疗组（IR)及药物 组(RSA)相比，药物联合放疗组(RSA+IR)在G0+G1期阻滞明显，该区别具有统计学差异(p〈 0.05).
[0082] 流式细胞术检测H1299/175细胞周期结果：与对照组(Control)、放疗组（IR)及药 物组(RSA)相比，药物联合放疗组(RSA+IR)在G2+M期阻滞明显，该区别具有统计学差异(p〈 0.05)〇
[0083] 以上具体数据请见表3、图5-1A、图5-1B、图5-1C、图5-1D和图5-2A、图5-2B、图5-2C、图5-2D。
[0084] 表3:不同处理组H1299/WT，H1299/175细胞凋亡及周期检测结果
[0086] *表示与对照组(Control)、放疗组（IR)及药物组(RSA)比较均具有统计学差异。
[0087] 六、基因表达改变蛋白
[0088] 分别取对数生长期的H1299/WT细胞和H1299/175细胞，消化成单细胞悬液，按2X 107细胞/皿接种于15cm培养皿中，在37°C、5 %⑶:^饱和湿度的孵箱中培养24h贴壁后进行分 组处理，分组为:单纯放疗组(记为IR)和药物联合放疗组(记为RSA+IR)。每组每种细胞检测 指标3皿重复。药物联合放疗组加入浓度为3.91ymol/L的RSA药物，单纯放疗组加入不含药 物的等量培养液，给予照射的实验组的照射剂量是4Gy。处理结束后各组更换不含药物培养 液(药物加入组需要经RSA孵育24h后再更换），在37°C、5 %⑶2饱和湿度的孵箱中继续培养 48h，收集细胞。
[0089] 米用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit提取细胞的mRNA及总蛋白备用，mRNA通 过TAKALA逆转录试剂盒转录成cDNA，定量500ng/ul，通过实时荧光SYBR Green PCR法检测 TG2表达，计算基因相对拷贝数=2-ACt，基因表达改变通过Fold change = 2_Δ ( ACt)， (Δ Ct = Ct(target)-Ct(gapdh), A ( Δ Ct) = Δ C t(treated)- Δ Ct)计算。
[0090] 以β-Actin为内参，采用western blot检测周期及凋亡相关蛋白Bax，bcl_2，P21， 磷酸化 CASPASE-3，Cycl inB，Cycl inD 表达。
[0091] 荧光定量RT-PCR结果显示：
[0092]具有放射增敏作用的化合物(RSA)处理两细胞后48h，TG2均降低，p53基因表达均 无明显变化；
[0093] 两细胞IR组，48h后均显示TG2表达上升，但上升不显著，无统计学差异(p>0.05)， 两细胞的P53基因均表达有所上升；
[0094]联合组中，两细胞的TG2基因表达均显示显著下降，联合组与自身单放疗及单药物 组比下降明显，具有统计学差异(P〈〇.05);野生型细胞的P53基因表达上升，突变型细胞的 P53基因表达无改变。
[0095] 其中，TG2表达结果如图6所示：对于H1299/WT细胞和H1299/175细胞，相对于IR组 (标记为C)，药物联合IR组(标记为T)采用本发明的具有放射增敏作用的化合物(RSA)处理 细胞后48h，均检测到TG2基因表达显著降低，两组的FC(fold change)值(标记为FC)均大于 2。可见，本发明的具有放射增敏作用的化合物(RSA)联合IR处理H1299/WT细胞和H1299/175 细胞均能有效下调TG2表达。
[0096] Western blot检测功能蛋白结果见图7,具体说明如下：
[0097] 对于野生型p53基因的H1299/WT细胞，与单IR组相比，经RSA联合IR(RSA+IR)处理 后，P21蛋白表达明显增加、促凋亡ΒΑΧ蛋白表达、磷酸化CASPASE-3蛋白表达均明显上升， CyclinB表达没有明显变化，CyclinD、抑制凋亡bcl-2蛋白表达降低。
[0098] 对于突变型p53基因的H1299/175细胞，与单IR组相比，经RSA联合IR后，P21、BAX、 Cycl inD均显示微量表达，表达无明显变化，CyclinB、bcl-2表达明显降低，磷酸化CASPASE-3蛋白表达升尚。
[0099]七、ELISA法检测细胞核、线粒体及细胞浆中细胞色素 C实验 [0100] 分别取对数生长期的H1299/W细胞和H1299/175细胞，消化成单细胞悬液，按IX 107细胞/皿接种于15cm培养皿中，在37°C、5 %⑶:^饱和湿度的孵箱中培养24h贴壁后进行分 组处理，分组为:单纯放疗组(记为IR)和药物联合放疗组(记为RSA+IR)。每组每种细胞检测 指标3皿重复。药物联合放疗组加入浓度为3.91ymol/L的RSA药物，单纯放疗组加入不含药 物的等量培养液，给予照射的实验组的照射剂量是4Gy。处理结束后各组更换不含药物培养 液(药物加入组需要经RSA孵育24h后再更换），在37°C、5 %⑶2饱和湿度的孵箱中继续培养 48h，按试剂盒说明书收集其细胞的细胞核、线粒体、细胞浆的蛋白，采用R&Dsystems Inc .Minneapolis公司的Cyt-C-ELISA试剂盒检测。
[0101] ELSIA检测细胞核、细胞浆及线粒体中Cyt-C的结果如表4所示。从表4可见，通过 RSA联合IR组，细胞浆中显示细胞色素 C表达明显上升，两细胞在联合组分别为78.4 土 7.3碰，71.8±4.31^，与自身细胞行11?组比均具有统计学差异（？〈0.05)。野生型？53的的 H1299/WT细胞中呈现细胞核内Cyt-C降低，线粒体中Cyt-C表达无明显改变，突变型p53的 H1299/175细胞中呈现线粒体Cyt-C表达降低，细胞核无明显改变。
[0102]表4.细胞色素 C在各细胞器中的表达
[0104] *与自身的IR组比较有统计学差异(p〈0.05)
[0105] 综合以上的实验数据，可以发现：
[0106] 对于p53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺癌H1299/175细胞，本发明的结 构式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下记为RSA)均具有抑制作用，能够诱导 细胞凋亡及细胞周期的改变。
[0107] 并且，上述RSA联合IR处理后，能够使p53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺 癌H1299/175细胞的〇卩、〇〇、13?2、0值均减小，€1值均增大，且3?2减小具有统计学差异(？〈 0.05)，经本发明的RSA处理后H1299/175、H1299/WT的放射增敏比SER分别为1.55和1.65。这 说明：本发明的结构式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下记为RSA)，既能显 著提高P53野生型肺癌H1299/WT细胞的放射敏感性，又能明显提高p53突变型肺癌H1299/ 175细胞的放射敏感性。将其应用于制备联合放射治疗肺癌的放射增敏药物具有普遍适用 性。
[0108] 为了分析本发明的结构式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下记为 RSA)对于p53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺癌H1299/175细胞的放射增敏作用机 制，对于不同处理组的H1299/WT细胞和H1299/175细胞进行细胞凋亡及周期检测、荧光RT-PCR检测、Western blot检测以及细胞色素 C的ELISA法检测。
[0109] 结果显示:经本发明RSA联合IR处理p53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺 癌H1299/175细胞后，均显示明显的细胞凋亡升高和明显的周期阻滞，与单IR组比均具有显 著统计学差异。进一步分析发现:周期阻滞有所不同，P53突变型肺癌H1299/175细胞阻滞在 G2+M期，而p53野生型肺癌H1299/WT细胞阻滞在G0+G1期，与自身对照比均存在统计学差异。
[0110] 本发明的结构式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下记为RSA)单独 作用于P53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺癌H1299/175细胞，能够降低两细胞的 TG2基因表达，而p53基因表达无明显变化。本发明的结构式如式(I)所示的具有放射增敏作 用的化合物（以下记为RSA)联合IR处理后，p53野生型肺癌H1299/WT细胞TG2基因表达显著 降低，P53基因表达上升;p53突变型肺癌H1299/175细胞TG2基因表达显著降低，p53基因表 达无改变。可见，本发明的结构式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下记为 RSA)能够抑制TG2的表达。
[0111] 并且，通过RSA联合IR，两细胞的细胞浆中细胞色素 C表达均明显上升，可见，本发 明的结构式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下记为RSA)抑制TG2的表达，能 促使细胞经IR处理后细胞色素 C从细胞核和线粒体内释放进入细胞浆，从而发挥凋亡作用。 具体来说，对于野生型P53的H1299/WT细胞，RSA抑制TG2的表达，促使细胞经IR处理后细胞 色素 C从细胞核内释放进入细胞浆;对于突变型p53的H1299/175细胞，RSA抑制TG2的表达， 促使细胞经IR处理后细胞色素 C从线粒体内释放进入细胞浆。
[0112] 组织型谷氨酰胺转氨酶（tissue transgiutaminase TG2)，基因定位于20号染色 体的ql2带上，全长约32.5kb。它的蛋白质分子量为80kD(千道尔顿），有687个氨基酸残基， 每个单体含有4个独特的结构域。TG2是谷氨酰胺转氨酶家族中的一个独特成员，存在于细 胞的多个部位，包括胞浆、胞核、线粒体、细胞膜表面以及细胞外基质。它不仅具有Ca 2+依赖 的催化蛋白交联的活性及GTP依赖的G蛋白的功能，还具有蛋白二硫键异构酶活性和蛋白激 酶的功能。TG2参与许多肿瘤细胞的凋亡过程。许多研究结果都支持TG2的促凋亡作用，凋亡 细胞内通常都有高水平的TG2表达，抑制TG2的表达会显著降低细胞死亡数量。然而TG2表达 和凋亡并不是完全一致的。最近又有直接证据表明，升高的TG2通过阻止凋亡来延长细胞的 存活。这些研究结果提示TG2不仅具有促凋亡作用，而且还有抗凋亡作用，这种似乎矛盾的 作用取决于细胞类型、所受刺激类型及TG2在细胞内的定位和酶活性类型。
[0113] 结合Western blot结果分析可能的机制：
[0114] 野生型p53基因的H1299/WT细胞经RSA联合IR处理后，抑制TG2表达，激活了 p53通 路，P21蛋白激活从而抑制Cyc 1 inD表达，ΒΑΧ的表达升高，细胞核内细胞色素 C释放到细胞 质。细胞色素 C在胞质中与Apaf-Ι以及ΑΤΡ组成凋亡小体，进而激活caspase-9，始动激活以 caspase-3和caspase-7为效应分子的caspase信号链，促进凋亡的发生。放射增敏是通过 P53依赖凋亡途径。
[0115] 与野生型细胞不同的是，突变型的p53基因的H1299/175细胞更容易发生辐射诱导 的有丝分裂殇折，经RSA联合IR后，虽然在p53突变的肿瘤细胞中受p53负性调控的CyclinBl 表达上升，但由于RSA对于TG2表达的抑制，仍然使得细胞中G2/M期监测点的调控蛋白 CyclinBl表达显著降低，从而G2/M期监测点功能恢复，使其进入不了有丝分裂，或导致辐射 后受损的DNA修复不完全而进入有丝分裂期发生有丝分裂殇折性的凋亡。降低BCL-2的表 达，促使其线粒体细胞色素 C释放进入细胞浆，与Apaf-Ι以及ATP组成凋亡小体，进而激活 caspase-9，始动激活以caspase-3和caspase-7为效应分子的caspase信号链，促进凋亡的 发生。放射增敏可能依赖线粒体途径。
[0116] 可见，对于p53野生型肺癌H1299/WT细胞和p53突变型肺癌H1299/175细胞，本发明 所述放射增敏剂均抑制了TG2蛋白的表达，经过IR联合处理后，激活了不同的凋亡信号通 路，P53野生型通过p53依赖凋亡途径，p53突变型通过线粒体途径参与调解肿瘤细胞的凋 亡，从而引起在不同细胞周期阻滞，但都具有非常明显的放射增敏效果。因此，将本发明所 述放射增敏剂应用于制备联合放射治疗肿瘤的放射增敏药物具有普遍适用性，尤其是当肿 瘤为P53信号通路过度激活且电离辐射诱导后p53信号通路激活增强的肿瘤时尤为适用。
【主权项】
1. 一种具有放射增敏作用的化合物，其结构式如下式(I)所示：2. 如权利要求1所述的化合物在制备治疗肿瘤的放射增敏剂中的用途。3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，在肿瘤的放射治疗的过程中，在放射疗法的 同时或之前，所述放射增敏剂处理肿瘤区域。4. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为耐放射肿瘤。5. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述化合物在对肺癌细胞无细胞毒性的〈 20 % IC50药物浓度下具有放射增敏作用。7. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为p53信号通路过度激活且电离辐 射诱导后P53信号通路激活增强的肺癌。8. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述处理为放射增敏剂的瘤内注射。9. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述放射使用来自线性加速器的X射线束 或电子束来进行。10. 根据权利要求2-9任一所述的用途，其特征在于，如权利要求1所述化合物或其药学 上可接受的盐与药学上可接受的载体组成肿瘤放射增敏的药用组合物。
【文档编号】C07D261/04GK106045932SQ201610396839
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】陈明, 冯建国
【申请人】浙江省肿瘤医院