一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，该方法包括如下步骤：称取藤茶，精选，粉碎，过35?45目筛；加入酒精，浸泡6?10小时，然后回流浸提3?5小时；将浸提液体过滤得到滤液；从滤液中回收酒精至滤液酒精含量为15％以下，然后真空浓缩至得到比重1.0?1.5的浸膏；将浓缩浸膏用热水充分搅拌并用超声波震荡，高速离心，收集上清液；将得到的上清液冷藏过夜，高速离心，收集沉淀，真空烘干得黄绿色粉末初提物；分离纯化；得到98％以上的高纯度杨梅素和二氢杨梅素纯品。本发明方法设备简单，工艺简单可行，便于工业化生产；所用溶剂无毒无残留，不产生环境污染；本发明分离纯化的利用率高、回收率高，所得杨梅素、二氢杨梅素纯度高。
【专利说明】
一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中医药技术领域，更具体涉及一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨 梅素的方法。
【背景技术】
[0002] 藤茶属葡萄科，蛇葡萄属，学名为显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)，味 甘、淡，性凉，具有清热解毒、祛风湿、强筋骨、消炎、镇痛等功效。民间将其幼嫩茎叶制成保 健茶，用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疱疖等症已有数百年的历史，是一种典型 的药食两用植物。藤茶主要有效成分为黄酮类化合物，并以二氢杨梅素 (Dihydromyricetin，简称DMY)含量最高。研究表明，藤茶中总黄酮含量为43.4%~44.0 % (质量分数），二氢杨梅素含量高达37.4 %~40 %，但与地理、气候环境等因素有关。近年来， 国内外已有部分学者开展了从植物中提取二氢杨梅素的研究，通常是以有机溶剂为提取 剂，如醋酸乙酯、正丁醇、乙醇等。这种方法提取成本高，回收溶剂的能耗高，还存在费时、提 取率低、重现性差等不足之处。而且所用溶剂通常有毒，不安全，易对环境和操作人员造成 危害。超临界萃取二氢杨梅素虽具有节省试剂，无污染等优点，但回收率较差，为了获得超 临界条件，设备一次性投资较大，运行成本高。此外，还有大孔树脂吸附法、微波萃取法、逆 流法、乙醇辅助法及超声波辅助溶剂提取法。
【发明内容】
[0003] (一)要解决的技术问题
[0004] 本发明要解决的技术问题就是如何低成本、低能耗、安全、无毒、无污染的提取藤 茶中的有效成分，而提供一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法
[0005] (二)技术方案
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅 素的方法(所用原料均市购获得），该方法包括如下步骤：
[0007] 步骤一:预备:称取藤茶，精选，粉碎，过35-45目筛;太细，太粗提取效率不高；
[0008] 步骤二:浸提:加入藤茶重量18-22倍的75-85%的酒精，用5%碳酸氢钠溶液调节 pH值为7.0-8.0,浸泡6-10小时，然后在35-45°C温度下回流浸提3-5小时;碱性条件有利于 提取；
[0009] 步骤三:二次浸提:加入藤茶重量8-12倍的75-85%的酒精，在35-45°C温度下回流 浸提3-5小时；
[0010] 步骤四:过滤:合并两次浸提液体，过滤得到滤液;过滤掉杂质；
[0011]步骤五：回收酒精:从滤液中回收酒精至酒精含量为15%以下，达到无酒精味道， 然后真空浓缩至得到比重1.0-1.5的浸膏；
[0012]步骤六:水沉:将浓缩浸膏用18-22倍重量的90-98°C的热水充分搅拌并用超声波 震荡2.5-3.5小时，在80-90°C温度下高速离心，收集上清液；
[0013] 步骤七:离心:将步骤六得到的上清液冷藏过夜，第二天进行高速离心，收集沉淀， 真空烘干得黄绿色粉末初提物;冷藏有利于杨梅素和二氢杨梅素结晶沉淀，过夜保证目标 物充分结晶析出；
[0014] 步骤八:分离纯化;对步骤七得到的初提物分离纯化得到98%以上的高纯度杨梅 素和二氢杨梅素纯品。
[0015] 优选地，在步骤八中，所述的分离纯化步骤如下：
[0016] 1)将步骤七中得到黄绿色粉末初提物，分3次用9倍重量的乙酸乙酯加入黄绿色粉 末初提物中，均匀搅拌并用超声震荡2.5-3.5小时，乙酸乙酯层变成黄绿色，合并三次得到 的乙酸乙酯上清液和三次得到的白色沉淀物；
[0017] 2)对步骤1)得到的白色沉淀物用8-12倍5 %碳酸氢钠溶液溶解，高速离心，取上清 液，将上清液酸化，冷藏过夜，得到白色结晶沉淀，烘干得到纯度至少90 %的二氢杨梅素;再 将白色结晶沉淀用5倍重量的90°C以上热水充分搅拌溶解，高速离心，分离沉淀，收集上清 液，将上清液冷藏过夜，高速离心，收集得到白色针状结晶，用纯水洗涤3次，得到白色针状 结晶，烘干得到纯度98%以上的白色针状二氢杨梅素晶体；
[0018] 3)从步骤1)得到的上清液中回收乙酸乙酯，真空烘干得到黄色粉末，将黄色粉末 采用5 %碳酸氢钠溶液溶解，高速离心，除去沉淀收集上清液，将上清液酸化，过夜冷藏，分 离沉淀并真空干燥可得98%以上黄绿色针状杨梅素结晶。
[0019] 优选地，在步骤八中，所述的分离纯化步骤如下：
[0020] 1)将步骤七中得到黄绿色粉末初提物，加入10倍初提物重量的5%硼酸溶液，充分 搅拌并超声震荡2.5-3.5小时，然后静置过夜沉淀;高速离心，除去沉淀，收集上清液；
[0021] 2)在上清液中加入5%氢氧化钙溶液，缓慢搅拌，不断产生白色絮状沉淀，调节稳 定至PH 7.5为止，再缓慢搅动半小时以上，高速离心除去沉淀，收集上清液；
[0022] 3)将收集到的上清液用盐酸调节PH值至4.0，冷藏过夜，高速离心沉淀，收集得到 只有杨梅素和二氢杨梅素的混合物的沉淀；
[0023] 4)在步骤3)得到的沉淀中分3次加入9倍重量的乙酸乙酯，充分搅拌并超声波震荡 3小时以上，静置过夜;高速离心，分别收集沉淀和上清液；
[0024] 5)将步骤4)得到的沉淀真空烘干，即得纯度98%的白色针状二氢杨梅素晶体；
[0025] 6)从步骤4)得到的上清液中真空回收乙酸乙酯，得到膏状体，加入10倍95°C以上 热水，充分溶解，过滤，冷却，过夜，高速离心，收集得到纯度98%以上的黄色针状杨梅素晶 体。
[0026]优选地，在步骤一中，所述的筛为40目。
[0027] 优选地，在步骤二和步骤三中，所述的浸提温度为40°C。
[0028] 优选地，在步骤五中，所述的比重为1.15-1.20。
[0029] 优选地，在步骤六中，所述的水沉温度为95°C。
[0030] 优选地，在步骤3)中，真空度为-0 · 08-0 · 09MPa。
[0031]优选地，所述方法包括如下步骤：
[0032]步骤一:预备:称取藤茶，精选，粉碎，过40目筛；
[0033]步骤二:浸提:加入藤茶重量20倍的重量浓度80 %的酒精，用5 %碳酸氢钠溶液调 节pH值为7.5，浸泡8小时，然后在40 °C温度下回流浸提4小时；
[0034] 步骤三:二次浸提:加入藤茶重量10倍的重量浓度80 %的酒精，在40 °C温度下回流 浸提4小时；
[0035] 步骤四:过滤:合并两次浸提液体，过滤得到滤液；
[0036] 步骤五：回收酒精:从滤液中回收酒精至酒精浓度为15%以下，然后真空浓缩至得 到比重1.2的浸膏；
[0037]步骤六:水沉:将浓缩浸膏用20倍重量的95°C的热水充分搅拌并用超声波震荡3小 时，在85 °C温度下高速离心，收集上清液；
[0038] 步骤七:离心:将步骤六得到的上清液冷藏过夜，第二天进行高速离心，收集沉淀， 真空烘干得黄绿色粉末初提物；
[0039] 步骤八:分离纯化;对步骤七得到的初提物分离纯化得到98%以上的高纯度杨梅 素和二氢杨梅素纯品。
[0040] 本发明还提供了上述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法所制得的 杨梅素和二氢杨梅素。
[0041] (三)有益效果
[0042] 本发明方法所采用设备简单，工艺简单可行，便于工业化生产;所用溶剂无毒无残 留，不产生环境污染，后期洗涤结晶用的有机溶剂使用量小;本发明利用藤茶提取分离纯化 的利用率高、所得回收率高，都在90%以上，所得杨梅素、二氢杨梅素纯度也很高，可直接用 于药品工业。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本 发明，但不能用来限制本发明的范围。
[0044]下面所使用的溶剂、HCL、碳酸氢钠、乙酸乙酯均为食用级或者分析纯，不得使用工 业级。
[0045] 实施例1
[0046] 1) 1000公斤，藤茶精选除杂，藤茶粉碎，过40目筛，但不要过细，过秤补齐1000公斤 总量；
[0047] 2)第一次浸提:20吨80%酒精溶液用碳酸氢钠调节PH至7.5,加入10吨提取罐浸泡 8小时然后40°C温度下回流浸提4小时；
[0048] 3)第二次浸提:10吨80 %酒精溶液40 °C温度下回流浸提4小时；
[0049] 4)第一次和第二次浸提液用板框式压滤机过滤，得合并的滤液共28.6吨；
[0050] 5)回收酒精及浓缩:滤液合并后回收酒精，至酒精浓度小于15%，然后真空浓缩至 得到比重1.2的浸膏，浸膏重量为1340公斤；
[0051] 6)浸膏用27吨95°C以上的热水充分搅拌并用超声波震荡3小时，趁热（85°C)下高 速离心收集上清液25.9吨；
[0052] 7)上清液进入冷库，冷藏过夜，第二天高速离心收集沉淀，真空烘干得黄绿色粉末 初提物632公斤；
[0053] 8)对632公斤黄绿色初提物分离纯化提取高纯度98%以上的杨梅素和二氢杨梅素 纯品；
[0054] 8.1)第一种分离纯化方法；
[0055] 8.1.1)步骤7)所得黄绿色初提物312公斤，用2700公斤分析纯乙酸乙酯分3次(每 次900公斤)量加入黄绿色粉末中，不断慢速搅拌并用超声震荡3小时，乙酸乙酯层变成黄绿 色，最后一次3倍乙酸乙酯层基本不变色；
[0056] 8.1.2)分别得到白色沉淀物（1)210公斤和三次乙酸乙酯上清液合并重量2800公 斤；
[0057] 8.1.3)对沉淀（1)用1000公斤5 %碳酸氢钠容易溶解，高速离心，上清液酸化冷藏 过夜得白色结晶沉淀烘干得至少129公斤90%纯度的二氢杨梅素，白色针状结晶用600公斤 95°C以上热水充分搅拌溶解，高速离心分离沉淀收集上清液，上清液冷藏过夜高速离心收 集白色针状结晶，纯水洗涤3次后得黄色针状结晶烘干可得98%以上的白色针状二氢杨梅 素晶体123.3公斤。
[0058] 8.1.4)乙酸乙酯上清液2800公斤;上清液回收乙酸乙酯，真空烘干得黄色粉末9.1 公斤，对黄色粉末采用100公斤5 %碳酸氢钠容易溶解高速离心除去沉淀收集上清液106.4 公斤，上清液酸化过夜冷藏分离沉淀并真空干燥可得98%以上黄绿色针状杨梅素结晶8.7 公斤；
[0059] 8.2)第二种分离纯化方法；
[0060] 8.2.1)步骤7)所得黄绿色粉末初提物316公斤，加入3000公斤重量的5%硼酸溶 液，充分搅拌并超声震荡3小时，然后静置过夜沉淀；
[0061 ] 8.2.2)过夜后高速离心除去沉淀得上清液3260公斤；
[0062] 8.2.3)上清液加入5 %氢氧化钙溶液，缓慢搅拌，不断产生白色絮状沉淀，调节稳 定至PH7.5为止，缓慢搅动半小时以上，高速离心除去沉淀，收集上清液2980公斤；
[0063] 8.2.4)收集到的上清液用盐酸调节PH至4.0，冷藏过夜；
[0064] 8.2.5)过夜后高速离心沉淀，收集得到只有杨梅素和二氢杨梅素的混合物的沉淀 (2)322 公斤；
[0065] 8.2.6)沉淀(2)用2700公斤的分析纯乙酸乙酯进行分离杨梅素和二氢杨梅素，900 公斤一次分析纯乙酸乙酯分3次充分搅拌并超声波震荡3小时以上，高速离心沉淀收集上清 液，沉淀再次用900公斤乙酸乙酯超声并搅拌再高速离心分离沉淀和上清液，第三次用900 公斤乙酸乙酯对沉淀进行抽提和离心分离；
[0066] 8.2.7)得沉淀(3)119公斤白色结晶烘干后得到白色针状晶体的二氢杨梅素121.7 公斤，合并的三次上清液2690公斤；
[0067] 8.2.8)真空回收乙酸乙酯得膏状体24.5公斤，膏状体加入250公斤95°C以上热水 充分溶解过滤，冷去过夜高速离心收集黄色针状结晶体并真空烘干得8.5公斤杨梅素纯度 98%以上。
[0068] 实施例2
[0069] 1) 1000公斤，藤茶精选除杂，藤茶粉碎，过40目筛，但不要过细，过秤补齐1000公斤 总量；
[0070] 2)第一次浸提:20吨80%酒精溶液用碳酸氢钠调节PH至7.5,加入10吨提取罐浸泡 8小时然后40°C温度下回流浸提4小时；
[0071] 3)第二次浸提:10吨80 %酒精溶液40 °C温度下回流浸提4小时；
[0072] 4)第一次和第二次浸提液用板框式压滤机过滤，得合并的滤液共28.4吨；
[0073] 5)回收酒精及浓缩:滤液合并后回收酒精，至酒精浓度小于15%，然后真空浓缩至 得到比重1.2的浸膏，浸膏重量为1290公斤；
[0074] 6)浸膏用26吨95°C以上的热水充分搅拌并用超声波震荡3小时，趁热（85°C)下高 速离心收集上清液25.1吨；
[0075] 7)上清液进入冷库，冷藏过夜，第二天高速离心收集沉淀，真空烘干得黄绿色粉末 初提物628公斤；
[0076] 8)对628公斤黄绿色初提物分离纯化提取高纯度98%以上的杨梅素和二氢杨梅素 纯品；
[0077] 8 · 1)第一种分离纯化方法；
[0078] 8.1.1)步骤7)所得黄绿色初提物314公斤，用2700公斤分析纯乙酸乙酯分3次(每 次900公斤)量加入黄绿色粉末中，不断慢速搅拌并用超声震荡3小时，乙酸乙酯层变成黄绿 色，最后一次3倍乙酸乙酯层基本不变色；
[0079] 8.1.2)分别得到白色沉淀物（1)201公斤和三次乙酸乙酯上清液合并重量2880公 斤；
[0080] 8.1.3)对沉淀（1)用1000公斤5 %碳酸氢钠容易溶解，高速离心，上清液酸化冷藏 过夜得白色结晶沉淀烘干得至少132.7公斤90%纯度的二氢杨梅素，白色针状结晶用650公 斤95°C以上热水充分搅拌溶解，高速离心分离沉淀收集上清液，上清液冷藏过夜高速离心 收集白色针状结晶，纯水洗涤3次后得黄色针状结晶烘干可得98%以上的白色针状二氢杨 梅素晶体120.2公斤。
[0081 ] 8.1.4)乙酸乙酯上清液2880公斤;上清液回收乙酸乙酯，真空烘干得黄色粉末9.2 公斤，对黄色粉末采用100公斤5 %碳酸氢钠容易溶解高速离心除去沉淀收集上清液110.1 公斤，上清液酸化过夜冷藏分离沉淀并真空干燥可得98%以上黄绿色针状杨梅素结晶8.6 公斤；
[0082] 8.2)第二种分离纯化方法；
[0083] 8.2.1)步骤7)所得黄绿色粉末初提物314公斤，加入3000公斤重量的5%硼酸溶 液，充分搅拌并超声震荡3小时，然后静置过夜沉淀；
[0084] 8.2.2)过夜后高速离心除去沉淀得上清液3310公斤；
[0085] 8.2.3)上清液加入5 %氢氧化钙溶液，缓慢搅拌，不断产生白色絮状沉淀，调节稳 定至PH7.5为止，缓慢搅动半小时以上，高速离心除去沉淀，收集上清液3130公斤；
[0086] 8.2.4)收集到的上清液用盐酸调节PH至4.0，冷藏过夜；
[0087] 8.2.5)过夜后高速离心沉淀，收集得到只有杨梅素和二氢杨梅素的混合物的沉淀 (2)317 公斤；
[0088] 8.2.6)沉淀(2)用2700公斤的分析纯乙酸乙酯进行分离杨梅素和二氢杨梅素，900 公斤一次分析纯乙酸乙酯分3次充分搅拌并超声波震荡3小时以上，高速离心沉淀收集上清 液，沉淀再次用900公斤乙酸乙酯超声并搅拌再高速离心分离沉淀和上清液，第三次用900 公斤乙酸乙酯对沉淀进行抽提和离心分离；
[0089] 8.2.7)得沉淀（3)129.6公斤白色结晶烘干后得到白色针状晶体的二氢杨梅素 119.8公斤，合并的三次上清液2700公斤；
[0090] 8.2.8)真空回收乙酸乙酯得膏状体25.5公斤，膏状体加入250公斤95度以上热水 充分溶解过滤，冷去过夜高速离心收集黄色针状结晶体并真空烘干得8.3公斤杨梅素纯度 98%以上。
[0091] 实施例3
[0092] 1) 1000公斤，藤茶精选除杂，藤茶粉碎，过40目筛，但不要过细，过秤补齐1000公斤 总量；
[0093] 2)第一次浸提:20吨80%酒精溶液用碳酸氢钠调节PH至7.5,加入10吨提取罐浸泡 8小时然后40°C温度下回流浸提4小时；
[0094] 3)第二次浸提:10吨80 %酒精溶液40 °C温度下回流浸提4小时；
[0095] 4)第一次和第二次浸提液用板框式压滤机过滤，得合并的滤液共29.1吨；
[0096] 5)回收酒精及浓缩:滤液合并后回收酒精，至酒精浓度小于15%，然后真空浓缩至 得到比重1.2的浸膏，浸膏重量为1295公斤；
[0097] 6)浸膏用27吨95°C以上的热水充分搅拌并用超声波震荡3小时，趁热（85°C)下高 速离心收集上清液25.7吨；
[0098] 7)上清液进入冷库，冷藏过夜，第二天高速离心收集沉淀，真空烘干得黄绿色粉末 初提物638公斤；
[0099] 8)对638公斤黄绿色初提物分离纯化提取高纯度98%以上的杨梅素和二氢杨梅素 纯品；
[0100] 8.1)第一种分离纯化方法；
[0101] 8.1.1)步骤7)所得黄绿色初提物319公斤，用2700公斤分析纯乙酸乙酯分3次(每 次900公斤)量加入黄绿色粉末中，不断慢速搅拌并用超声震荡3小时，乙酸乙酯层变成黄绿 色，最后一次3倍乙酸乙酯层基本不变色；
[0102] 8.1.2)分别得到白色沉淀物（1)218公斤和三次乙酸乙酯上清液合并重量2770公 斤；
[0103] 8.1.3)对沉淀（1)用1000公斤5 %碳酸氢钠容易溶解，高速离心，上清液酸化冷藏 过夜得白色结晶沉淀烘干得至少128.6公斤90%纯度的二氢杨梅素，白色针状结晶用600公 斤95°C以上热水充分搅拌溶解，高速离心分离沉淀收集上清液，上清液冷藏过夜高速离心 收集白色针状结晶，纯水洗涤3次后得黄色针状结晶烘干可得98%以上的白色针状二氢杨 梅素晶体123.9公斤。
[0104] 8.1.4)乙酸乙酯上清液2770公斤;上清液回收乙酸乙酯，真空烘干得黄色粉末8.8 公斤，对黄色粉末采用100公斤5%碳酸氢钠容易溶解高速离心除去沉淀收集上清液112.3 公斤，上清液酸化过夜冷藏分离沉淀并真空干燥可得98%以上黄绿色针状杨梅素结晶8.4 公斤；
[0105] 8.2)第二种分离纯化方法；
[0106] 8.2.1)步骤7)所得黄绿色粉末初提物319公斤，加入3000公斤重量的5%硼酸溶 液，充分搅拌并超声震荡3小时，然后静置过夜沉淀；
[0107] 8.2.2)过夜后高速离心除去沉淀得上清液3350公斤；
[0108] 8.2.3)上清液加入5%氢氧化钙溶液，缓慢搅拌，不断产生白色絮状沉淀，调节稳 定至PH7.5为止，缓慢搅动半小时以上，高速离心除去沉淀，收集上清液3030公斤；
[0109] 8.2.4)收集到的上清液用盐酸调节PH至4.0，冷藏过夜；
[0110] 8.2.5)过夜后高速离心沉淀，收集得到只有杨梅素和二氢杨梅素的混合物的沉淀 (2)317 公斤； 8.2.6)沉淀(2)用2700公斤的分析纯乙酸乙酯进行分离杨梅素和二氢杨梅素，900 公斤一次分析纯乙酸乙酯分3次充分搅拌并超声波震荡3小时以上，高速离心沉淀收集上清 液，沉淀再次用900公斤乙酸乙酯超声并搅拌再高速离心分离沉淀和上清液，第三次用900 公斤乙酸乙酯对沉淀进行抽提和离心分离；
[0112] 8.2.7)得沉淀（3)133.3公斤白色结晶烘干后得到白色针状晶体的二氢杨梅素 124.1公斤，合并的三次上清液2720公斤；
[0113] 8.2.8)真空回收乙酸乙酯得膏状体23.7公斤，膏状体加入250公斤95度以上热水 充分溶解过滤，冷去过夜高速离心收集黄色针状结晶体并真空烘干得8.4公斤杨梅素纯度 98%以上。
[0114] 对比实验
[0115] 湖南湘西张家界地区藤茶经我们分析总黄酮含量达到36.5%，其中二氢杨梅素含 量在27.8%，杨梅素含量在2.3%，通过查找资料目前还没有一种成熟的工业方法同时提取 杨梅素和二氢杨梅素，工业上藤茶中杨梅素含量低，一般从杨梅中提取杨梅素，文献中也未 有工业化高纯度杨梅素和二氢杨梅素的提取工艺，本发明具有开拓性和首创性。
[0116] 实验例1
[0117]杨梅素的含量测定方法(邓丹雯，南昌大学食品科学与技术国家重点实验室）
[0118] 1，仪器
[0119] Aglientl260高效液相色谱仪（四元栗、紫外检测器），Simon Aldrich-C 18固相萃 取小柱，JT2003电子精密天平(河北路仪公路仪器有限分公司），DFY-500摇摆式高速万能 粉碎机(温岭市林大机械有限公司），旋转蒸发仪RE - 52 (上海亚荣生化仪器厂），DHG - 9053 型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司），DKS - 24型电热恒温水浴锅(嘉兴市 中新医疗仪器有限公司）。
[0120] 2,色谱条件
[0121] HPLC检测条件色谱柱：Thermo-C 18液相色谱柱（4 · 6mm X 250mm，5μπι);流动相： 0.005mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(体积比30:70);流速为0.5mL/min，进样10yL，柱温25°C， 检测波长360nm〇
[0122] 3标准曲线绘制
[0123] 准确称取杨梅素标品10mg置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作为对照品溶 液。用甲醇稀释并定容，配成10，20，30，40，50yg/mL系列浓度的杨梅素标品溶液，10yL进样， 在1.3.5.2色谱条件下进HPLC分析，以峰面积为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)绘制标准曲 线。所得回归方程为￥ = 54.155乂一161.47，1? = 0.999 6，表明样品在10~5(^/1^内线性关 系良好。
[0124] 实验例2
[0125] 二氢杨梅素含量测定方法(王家胜，中成药2012年1月贵州大学生命科学学院）
[0126] 1，实验仪器
[0127] 试验仪器和设备主要有KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），分 析天平(十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司），多功能粉碎机LX-02(上海江信科技有 限公司）；Agilent 1200LC(美国安捷伦科技有限公司）；Dikma色谱柱（250mmX4.60mm，5μηι， 中国迪马公司）。
[0128] 2,色谱条件
[0129] 色谱条件进样量10yL;紫外检测波长292nm;柱温40°C ;流动相为0.1 %磷酸-甲醇-乙腈梯度洗脱（〇 ~l〇min，74.4:8:17.6; 10 ~15min，36:20:44; 15.1~18min，74.4:8: 17.6);体积流量lmL/min。
[0130] 3,对照品溶液的制备
[0131] 精密称取二氢杨梅素100.OOmg，置于100mL棕色量瓶中，以甲醇溶解并稀释到刻 度，摇匀，得到质量浓度为1.00mg/mL的二氢杨梅素对照品溶液，分别量取1.0、2.0、4.0、 5.0、8.0、10.0m L，甲醇定容至10m L，得系列对照品溶液。
[0132] 4,线性关系
[0133] 对照品溶液进样10yL，测定峰面积，每个质量浓度进样3次，取平均值。以进样质量 浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得二氢杨梅素的回归方程为γ = 2 832.7Χ - 101.24(r2 = 0.996 0)，线性范围为0.5~lO.Oyg，表明在此范围内二氢杨梅素线 性关系良好。
[0134] 5,样品测定
[0135] 供试品溶液进样10μ1，获得样品色谱图，通过回归方程计算二氢杨梅素的量。
[0136] 表:检测结果
[0138]以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发 明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、 修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要 求范围当中。
【主权项】
1. 一种从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于，该方法包括如下 步骤： 步骤一:预备:称取藤茶，精选，粉碎，过35-45目筛； 步骤二:浸提:加入藤茶重量18-22倍的75-85%的酒精，用5%碳酸氢钠溶液调节pH值 为7.0-8.0，浸泡6-10小时，然后在35-45°C温度下回流浸提3-5小时； 步骤三:二次浸提:加入藤茶重量8-12倍的75-85 %的酒精，在35-45 °C温度下回流浸提 3-5小时； 步骤四：过滤:合并两次浸提液体，过滤得到滤液； 步骤五：回收酒精:从滤液中回收酒精至酒精浓度为15%以下，然后真空浓缩至得到比 重1.0-1.5的浸膏； 步骤六:水沉:将浓缩浸膏用18-22倍重量的90-98°C的热水充分搅拌并用超声波震荡 2.5-3.5小时，在80-90°C温度下高速离心，收集上清液； 步骤七:离心:将步骤六得到的上清液冷藏过夜，第二天进行高速离心，收集沉淀，真空 烘干得黄绿色粉末初提物； 步骤八:分离纯化;对步骤七得到的初提物分离纯化得到98%以上的高纯度杨梅素和 二氢杨梅素纯品。2. 根据权利要求1所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤八中，所述的分离纯化步骤如下： 1) 将步骤七中得到黄绿色粉末初提物，分3次用9倍重量的乙酸乙酯加入黄绿色粉末初 提物中，均匀搅拌并用超声震荡2.5-3.5小时，乙酸乙酯层变成黄绿色，合并三次得到的乙 酸乙酯上清液和三次得到的白色沉淀物； 2) 对步骤1)得到的白色沉淀物用8-12倍5 %碳酸氢钠溶液溶解，高速离心，取上清液， 将上清液酸化，冷藏过夜，得到白色结晶沉淀，烘干得到纯度至少90 %的二氢杨梅素;再将 白色结晶沉淀用5倍重量的90°C以上热水充分搅拌溶解，高速离心，分离沉淀，收集上清液， 将上清液冷藏过夜，高速离心，收集得到白色针状结晶，用纯水洗涤3次，得到白色针状结 晶，烘干得到纯度98%以上的白色针状二氢杨梅素晶体； 3) 从步骤1)得到的上清液中回收乙酸乙酯，真空烘干得到黄色粉末，将黄色粉末采用 5 %碳酸氢钠溶液溶解，高速离心，除去沉淀收集上清液，将上清液酸化，过夜冷藏，分离沉 淀并真空干燥可得98%以上黄绿色针状杨梅素结晶。3. 根据权利要求1所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤八中，所述的分离纯化步骤如下： 1) 将步骤七中得到黄绿色粉末初提物，加入10倍初提物重量的5 %硼酸溶液，充分搅拌 并超声震荡2.5-3.5小时，然后静置过夜沉淀;高速离心，除去沉淀，收集上清液； 2) 在上清液中加入5%氢氧化钙溶液，缓慢搅拌，不断产生白色絮状沉淀，调节稳定至 PH 7.5为止，再缓慢搅动半小时以上，高速离心除去沉淀，收集上清液； 3) 将收集到的上清液用盐酸调节PH值至4.0,冷藏过夜，高速离心沉淀，收集得到只有 杨梅素和二氢杨梅素的混合物的沉淀； 4) 在步骤3)得到的沉淀中分3次加入9倍重量的乙酸乙酯，充分搅拌并超声波震荡3小 时以上，静置过夜;高速离心，分别收集沉淀和上清液； 5) 将步骤4)得到的沉淀真空烘干，即得纯度98%的白色针状二氢杨梅素晶体； 6) 从步骤4)得到的上清液中真空回收乙酸乙酯，得到膏状体，加入10倍95°C以上热水， 充分溶解，过滤，冷却，过夜，高速离心，收集得到纯度98%以上的黄色针状杨梅素晶体。4. 根据权利要求1所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤一中，所述的筛为40目。5. 根据权利要求1所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤二和步骤三中，所述的浸提温度为40°C。6. 根据权利要求1所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤五中，所述的比重为1.15-1.20。7. 根据权利要求1所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤六中，所述的水沉温度为95°C。8. 根据权利要求2所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法，其特征在于， 在步骤3)中，真空度为-0.08-0.09MPa。9. 根据权利要求1，4-7任一项所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法， 其特征在于，该方法包括如下步骤： 步骤一:预备:称取藤茶，精选，粉碎，过40目筛； 步骤二：浸提：加入藤茶重量20倍的80 %的酒精，用5 %的碳酸氢钠溶液调节pH值为 7.5，浸泡8小时，然后在40°C温度下回流浸提4小时； 步骤三:二次浸提:加入藤茶重量10倍的80%的酒精，在40°C温度下回流浸提4小时； 步骤四：过滤:合并两次浸提液体，过滤得到滤液； 步骤五：回收酒精:从滤液中回收酒精至酒精含量为15%以下，然后真空浓缩至得到比 重1.2的浸膏； 步骤六:水沉:将浓缩浸膏用20倍重量的95°C的热水充分搅拌并用超声波震荡3小时， 在85°C温度下高速离心，收集上清液； 步骤七:离心:将步骤六得到的上清液冷藏过夜，第二天进行高速离心，收集沉淀，真空 烘干得黄绿色粉末初提物； 步骤八:分离纯化;对步骤七得到的初提物分离纯化得到98%以上的高纯度杨梅素和 二氢杨梅素纯品。10. 权利要求1-9任一项所述的从藤茶中分离提纯杨梅素和二氢杨梅素的方法所制得 的杨梅素和二氢杨梅素。
【文档编号】C07D311/32GK106045958SQ201610621955
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】张宝堂, 谭家忠
【申请人】湖南绿蔓生物科技股份有限公司