木栓烷型三萜3,24?环氧?2α,24?二羟基?29?木栓烷酸及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种木栓烷型三萜3,24?环氧?2α,24?二羟基?29?木栓烷酸及其制备方法,本发明所述木栓烷型三萜3,24?环氧?2α,24?二羟基?29?木栓烷酸的提取、分离、纯化方法简单,抑制肿瘤细胞活性明确,具有潜在的开发为抗肿瘤药物的价值,该化合物化学结构经过波谱学数据得到确认,不存在光学异构体,可以避免光学异构体潜在的风险;
【专利说明】
木栓烷型三萜3,24-环氧-2α, 24-二羟基-29-木栓烷酸及其制 备方法和应用 (一)
技术领域
[00011本发明涉及一种木栓烷型三萜3,24_环氧-2α,24_二羟基-29-木栓烷酸及其制备 方法和应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 卫矛科植物中的巧茶属(Catha Benth.)、南蛇藤属(Celastrus L.)、十齿花属 (Dipentodon Dunn)、卫矛属(Euonymus I·)、沟辦属(Glyptopetalum Thw·)、美登木属 (Maytenus Molina)、假卫矛属(Microtropis wall.ex Mcissa)、核子木属(Perrottetia Η.B.K.)、雷公藤属(Tripterygium Hook.F.)的某些植物在我国作为药用植物和民间药用 植物。传统中医认为其具有清热、祛风、除湿、活血、解毒、消肿的功效,常用于治疗风湿积累 的风湿性关节炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、闭经、痢疾、跌打损伤、肠风痔漏、毒蛇咬伤、疮疡、 痈疖等症;现代药理研究表明本科植物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗生育、昆虫拒食及毒杀等 活性,目前多用于治疗风湿性及类风湿性关节炎、血液病及皮肤病,也用作农用杀虫剂。
[0003] 因此对该类植物进行系统、科学的研究,探明其有效成分及作用机理,发现一些结 构新颖的活性成分,将对更深层开发利用卫矛科药用植物的食疗保健产品、开发治疗药物 及临床应用产生重要意义。
[0004] 三花假卫矛(学名:Microtropis triflora)是卫矛科假卫矛属(Microtropis Wal 1. ex Meissn.)植物,灌木,高2.5~5米,是中国的特有植物。分布于中国大陆的云南、贵 州、四川、湖北等地,生长于海拔1300~2100米的地区,一般生长在林中以及山坡林缘。
[0005] 本发明以三花假卫矛植物藤茎为研究对象,进行提取、分离、纯化、结构鉴定得到 3,24-环氧-2α,24-二羟基-29-木栓烷酸,属于木栓烷型三萜化合物,该化合物具有一定程 度的抗肿瘤活性。 (三)
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2α,24-二羟基-29-木栓烷酸及其 制备方法和应用。
[0007] 为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0008] 一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2α,24-二羟基-29-木栓烷酸,其结构式如式(I)所 示:
[0010] 一种式(I)所示的木栓烷型三萜3,24-环氧-2α,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备方 法,所述的制备方法按如下步骤进行:
[0011] (1)甲醇浸提:将三花假卫矛的藤茎粉碎干燥,加入甲醇浸提提取,之后滤除不溶 物,滤液减压蒸干得到甲醇浸膏;
[0012] 步骤(1)中,所述甲醇浸提提取的具体操作方法为:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤 茎与甲醇以料液质量比1:3~5混合,常温(20~30°C)浸提5~10天,过滤得到甲醇提取液, 滤渣重复浸提2~4次,合并每次所得甲醇提取液,减压蒸干,得到甲醇浸膏。
[0013] (2)乙酸乙酯萃取:步骤(1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取,萃取液减压蒸干得到 乙酸乙酯浸膏;
[0014] 步骤(2)中,所述乙酸乙酯萃取的具体操作方法为:将步骤(1)所得甲醇浸膏分散 于5~10倍质量的水中,得到悬浮液,用等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯相,减压 回收溶剂,得到乙酸乙酯相浸膏。
[0015] (3) -次柱层析:用200~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层 析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比5:1~1:5的混合液和乙酸乙酯(纯)为洗脱剂,进行梯度 洗脱,收集含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得粗品;
[0016] 步骤(3)中,所述梯度洗脱的具体操作方法为:以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为 5:1、1:1、1:3、1:5的混合液、乙酸乙酯(纯)为洗脱剂,进行梯度洗脱,洗脱剂的流速为5~ 7mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300~400min,收集含目标化合物的洗脱液,减压 蒸除溶剂得粗品。
[0017] (4)二次柱层析:用300~400目柱层析硅胶继续对步骤(3)所得粗品进行柱层析分 离,以石油醚/乙酸乙酯体积比1:1~1:4的混合液为洗脱剂,进行梯度洗脱,收集含目标化 合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体物质;
[0018] 步骤(4)中,所述梯度洗脱的具体操作方法为:以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为 1:1、1:2、1:3、1:4的混合液为洗脱剂,进行梯度洗脱,洗脱剂的流速为3~4mL/min,每种梯 度的洗脱剂的洗脱时间为50~70min,收集含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体 物质。
[0019] (5)洗涤除杂:将步骤(4)所得固体物质用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗涤除 杂,最后干燥得到所述式(I)所示的木栓烷型三萜3,24-环氧-2α,24-二羟基-29-木栓烷酸;
[0020] 步骤(5)所述的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂中,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:1; 所述洗涤除杂的具体操作方法为:在离心管中加入所述固体物质,再加入固体物质的质量2 ~3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂,40ΚΗζ超声10s,离心,去除上清液,重复洗涤3次,最后 干燥得到产物。
[0021 ]本发明所述步骤(3)、(4)的柱层析过程中,可通过薄层层析(TLC)检测收集含目标 化合物(木栓烷型三萜3,24-环氧-2α,24-二羟基-29-木栓烷酸)的洗脱液;所述的目标化合 物用TLC检测时,以石油醚:乙酸乙酯=1:2为展开剂,其R f值为0.5。
[0022]经实验证明,本发明所述木栓烷型三萜3,24-环氧_2α,24-二羟基-29-木栓烷酸在 制备抗肿瘤活性药物中有应用前景。
[0023] 本发明所述的木栓烷型三萜3,24-环氧_2α,24-二羟基-29-木栓烷酸与DDP对照组 相比较,高浓度时对人乳腺癌Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体外增殖抑制 作用,且对S丽C7721细胞的抑制作用强于Bcap37细胞。这提示该化合物具有潜在的抗肿瘤 活性。
[0024]本发明的有益效果在于:本发明所述木栓烷型三萜3,24-环氧_2α,24-二羟基-29-木栓烷酸的提取、分离、纯化方法简单,抑制肿瘤细胞活性明确,具有潜在的开发为抗肿瘤 药物的价值,该化合物化学结构经过波谱学数据得到确认,不存在光学异构体,可以避免光 学异构体潜在的风险。 (四)
【附图说明】
[0025]图1为实施例5中DDP、木栓烷型三萜(I)对两种癌细胞的半致死浓度(IC50);
[0026] 图2为实施例5中木栓烷型三萜(I)对两种癌细胞的生长抑制率。 (五)
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不仅限于 此。
[0028] 实施例1:3,24_环氧-2α,24_二羟基-29-木栓烷酸的制备
[0029] (1)甲醇浸提:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎1000g与甲醇3000mL混合,常温浸 提10天,过滤得到甲醇提取液,滤渣重复浸提3次,合并每次所得甲醇提取液,减压蒸干,得 到甲醇浸膏112g。
[0030] (2)乙酸乙酯萃取:将步骤(1)所得甲醇浸膏112g分散于水1000mL中,得到悬浮液, 用等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯相,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯浸膏39g。
[0031] (3)-次柱层析:用200~300目柱层析硅胶300g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏39g 进行柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1:3、1:5的混合液、乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂,进行梯度洗脱,洗脱剂的流速为7mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 300min,收集含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得粗品1.6g;
[0032] (4)二次柱层析:用300~400目柱层析硅胶150g继续对步骤(3)所得粗品1.6g进行 柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1 :1、1:2、1:3、1:4的混合液为洗脱剂,进行 梯度洗脱,洗脱剂的流速为4mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为50min,收集含目标化 合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体物质〇.22g;
[0033] (5)洗涤除杂:在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.22g,再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1:1的混合溶剂0.5mL,40KHZ超声10s,离心,去除上清液,重复洗涤3次,最后干 燥得到产物3,25-环氧-Ια,3a,1 Ια,12,23,25-六羟基-乌苏-12-烯0.18g。
[0034] 实施例2:3,24-环氧_2α,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备
[0035] (1)甲醇浸提:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎500g与甲醇2000mL混合,常温浸提 7天,过滤得到甲醇提取液,滤渣重复浸提2次,合并每次所得甲醇提取液,减压蒸干,得到甲 醇浸膏60g。
[0036] (2)乙酸乙酯萃取:将步骤(1)所得甲醇浸膏60g分散于水300mL中,得到悬浮液,用 等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯相,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯浸膏22g。
[0037] (3)-次柱层析:用200~300目柱层析硅胶300g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏22g 进行柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1:3、1:5的混合液、乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂,进行梯度洗脱,洗脱剂的流速为5mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 400min,收集含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得粗品0.75g;
[0038] (4)二次柱层析:用300~400目柱层析硅胶75g继续对步骤(3)所得粗品0.75g进行 柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1 :1、1:2、1:3、1:4的混合液为洗脱剂,进行 梯度洗脱,洗脱剂的流速为3mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为70min,收集含目标化 合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体物质0.10g;
[0039] (5)洗涤除杂:在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.10g,再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1:1的混合溶剂0.2mL,40KHZ超声10s,离心,去除上清液,重复洗涤3次,最后干 燥得到产物3,25-环氧-Ια,3a,1 Ια,12,23,25-六羟基-乌苏-12-烯0 · 08g。
[0040] 实施例3:3,24-环氧_2α,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备
[0041] (1)甲醇浸提:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎l〇〇〇g与甲醇4000mL混合,常温浸 提5天,过滤得到甲醇提取液,滤渣重复浸提4次,合并每次所得甲醇提取液,减压蒸干,得到 甲醇浸膏119g。
[0042] (2)乙酸乙酯萃取:将步骤(1)所得甲醇浸膏119g分散于水800mL中,得到悬浮液, 用等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯相,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯浸膏41g。
[0043] (3)-次柱层析:用200~300目柱层析硅胶300g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏41g 进行柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1:3、1:5的混合液、乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂,进行梯度洗脱,洗脱剂的流速为6mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 350min,收集含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得粗品1.7g;
[0044] (4)二次柱层析:用300~400目柱层析硅胶150g继续对步骤(3)所得粗品1.7g进行 柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1 :1、1:2、1:3、1:4的混合液为洗脱剂,进行 梯度洗脱,洗脱剂的流速为3mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为65min,收集含目标化 合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体物质〇.24g;
[0045] (5)洗涤除杂:在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.24g,再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1:1的混合溶剂0.5mL,40KHZ超声10s,离心,去除上清液,重复洗涤3次,最后干 燥得到产物3,25-环氧-Ια,3a,1 Ια,12,23,25-六羟基-乌苏-12-烯0.20g。
[0046] 实施例4:化合物测试 [0047]表1:实验所用仪器
质谱仪 ESI-MS LCQ-Flcct Thermo Fisher Scientific 參司
[0049] 熔点分析仪 ΜΡΛΙΟΟ 美国SRS公司
[0050] 试剂:核磁共振使用氘代DMS0 (二甲亚砜)试剂,质谱使用德国默克(Merck)色谱纯 试剂。
[0051 ]对实施例1、实施例2或实施例3制得的木栓烷型三萜化合物(I)进行理化性质和波 谱学分析,m. p. 297-299 °C,ESI-MS测定值m/z : 487[M-Η] -,结合匪R数据确定其分子式为 C30H48〇5,分子量为488,不饱和度为7。
[0052]表2:所得木栓烷型三萜化合物(I)的NMR数据
[0055] 实施例5:抗肿瘤活性测试
[0056] 我们对实施例1制得的木栓烷型三萜(I)进行了体外抗肿瘤活性测试。
[0057]方法:取对数生长期肿瘤细胞,调整细胞悬液浓度,每孔100此细胞悬液接种于96 孔细胞培养板中,接种24h后给药(100μL孔),分别设细胞对照组以及4个浓度受试药物组。 继续培养72h后每孔加入100yL MTT(lmg/mL,以DMEM培养液溶解),37°C孵育2h,弃去各孔内 液体后加入150yL酸化异丙醇(含0.04mol/L HC1),避光放置30min,DG3022A型酶联免疫检 测仪测定570nm处吸光度,计算各受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率,以孙瑞元教授编写的 NDST计算机程序计算各受试药物的半数抑制浓度(IC50)。
[0058]结果:实施例1所制得的木栓烷型三萜与DDP对照组相比较,高浓度时对人乳腺癌 Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体外增殖抑制作用,其中对SMMC7721细胞的 抑制作用强于Bcap37细胞。这提示该化合物是潜在的抗肿瘤活性的药物(如图1、2所示)。
【主权项】
1. 一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2a,24-二羟基-29-木栓烷酸,其结构式如式(I)所示:2. 如权利要求1所述的式(I)所示木栓烷型三萜3,24-环氧-2a,24-二羟基-29-木栓烷 酸的制备方法,其特征在于,所述的制备方法按如下步骤进行: (1) 甲醇浸提:将三花假卫矛的藤茎粉碎干燥,加入甲醇浸提提取,之后滤除不溶物,滤 液减压蒸干得到甲醇浸膏; (2) 乙酸乙酯萃取:步骤(1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取,萃取液减压蒸干得到乙酸 乙酯浸膏; (3) -次柱层析:用200~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层析分 离,以石油醚/乙酸乙酯体积比5:1~1:5的混合液、乙酸乙酯为洗脱剂,进行梯度洗脱,收集 含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得粗品; (4) 二次柱层析:用300~400目柱层析硅胶继续对步骤(3)所得粗品进行柱层析分离, 以石油醚/乙酸乙酯体积比1:1~1:4的混合液为洗脱剂,进行梯度洗脱,收集含目标化合物 的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体物质; (5) 洗涤除杂:将步骤(4)所得固体物质用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗涤除杂,最 后干燥得到所述式(I)所示的木栓烷型三萜3,24-环氧-2a,24-二羟基-29-木栓烷酸。3. 如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)甲醇浸提的操作方法为:将 粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎与甲醇以料液质量比1:3~5混合,常温浸提5~10天,过滤得 到甲醇提取液,滤渣重复浸提2~4次,合并每次所得甲醇提取液,减压蒸干,得到甲醇浸膏。4. 如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)乙酸乙酯萃取的操作方法 为:将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于5~10倍质量的水中,得到悬浮液,用等体积的乙酸乙酯 萃取3次,合并乙酸乙酯相,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯相浸膏。5. 如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述梯度洗脱的操作方法 为:以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1 :3、1:5的混合液、乙酸乙酯为洗脱剂,进行 梯度洗脱,洗脱剂的流速为5~7mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300~400min,收 集含目标化合物的洗脱液,减压蒸除溶剂得粗品。6. 如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述梯度洗脱的操作方法 为:以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1:1、1: 2、1: 3、1:4的混合液为洗脱剂,进行梯度洗脱, 洗脱剂的流速为3~4mL/min,每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为50~70min,收集含目标化合 物的洗脱液,减压蒸除溶剂得到固体物质。7. 如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)洗涤除杂的操作方法为:在 离心管中加入所述固体物质,再加入固体物质的质量2~3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂, 40KHz超声10s,离心,去除上清液,重复洗涤3次,最后干燥得到产物;所述的石油醚/乙酸乙 酯混合溶剂中,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:1。8. 如权利要求1所述的木栓烷型三萜3,24-环氧-2a,24-二羟基-29-木栓烷酸在制备抗 肿瘤活性药物中的应用。9. 如权利要求8所述的木栓烷型三萜3,24-环氧-2a,24-二羟基-29-木栓烷酸在制备抗 人乳腺癌或人肝癌药物中的应用。
【文档编号】C07J71/00GK106046110SQ201610439596
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】王奎武, 周蔓青
【申请人】浙江工商大学