一种磁微粒偶联抗体分子的方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域,具体涉及一种磁微粒偶联抗体分子的方法，所述方法顺序包括如下步骤：磁微粒的平衡；磁微粒的醛基修饰与还原；活化磁微粒与抗体的偶联。大幅度提高了检测效率，缩短检测时间；本发明操作简单，只需两步即得到稳定的磁微粒偶联的抗体，反应条件温和，对原料无浪费，易于大规模制备；节约生产成本；具有极大的市场前景和经济价值。
【专利说明】
一种磁微粒偶联抗体分子的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磁微粒偶联抗体分子的方法。
【背景技术】
[0002] 磁性微粒具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性。在磁微粒表面 通过化学修饰与抗体分子进行偶联，在外磁场的控制下，通过免疫吸附、洗涤、解吸等步骤， 可以从血液、尿液、白带等复杂的生物样本中分离出目标分子，再利用酶联免疫吸附、化学 发光等技术手段可快速完成目标分子的浓度或含量测定。磁微粒偶联抗体具有分离简单、 亲和吸附高特异性及高敏感性以及物理和化学性能稳定等众多优点，与抗体偶联后磁微粒 主要用于细胞分选、生物分子检测、微生物分离等领域。
[0003] 目前磁微粒与抗体分子的偶联主要通过表面的活性基团如氨基、羧基、巯基、羟基 等与蛋白质分子进行共价结合，公开号为CN 101348517A的中国专利将表面氨基修饰的磁 微粒与蛋白质分子表面的氨基分别活化成马来酰亚胺与巯基，然后将二者偶联，此法偶联 效率较高，但操作复杂，对试剂尤其是需偶联蛋白质的前处理要求尤其高，而且蛋白质表面 活化的巯基容易被氧化成二硫键使其团聚。不利于大规模生产应用。公开号为 CN103357359A的中国专利采用二醛试剂作为偶联剂，通过醛胺缩合生成Schiff碱将抗体偶 联到磁微粒上，此方法反应条件温和、操作简单、对试剂的要求低。但是由于偶联物的亚胺 单元在中性条件下容易发生逆反应，使得抗体分子与磁微粒解离，会造成抗体的自偶联以 及磁微粒的自偶联，因此造成偶联效率降低，浪费原物料，同时使得检测的准确性、重复性 大大降低。
[0004] 因此，对这一方法进行改进，保证其偶联产物的稳定性以及偶联后抗体的高活性， 确保试剂的灵敏度，是该平台发展的核心技术之一。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的技术瓶颈，从而提出一种 偶联效率高、实际灵敏度高、制得的磁微粒活性高的磁微粒偶联抗体分子的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明公开了一种磁微粒偶联抗体分子的方法，所述方法 顺序包括如下步骤：
[0007] a.磁微粒的平衡:取含有磁微粒的分散液，磁分离，去上清，用活化缓冲液洗涤；
[0008] b.磁微粒的醛基修饰:将平衡后的磁微粒加至二醛溶液中，同时加入选择性还原 剂固体，反应;磁分离，得到活化的表面醛基修饰的磁微粒；
[0009] c.活化磁微粒与抗体的偶联:溶解在偶联缓冲液中的抗体其表面游离氨基与醛基 活化的磁微粒通过醛胺缩合被共价偶联在磁微粒表面，同时加入选择性还原剂将亚胺还原 得到稳定的偶联物。
[0010]优选的，所述的选择性还原剂为氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠中的一种。 [0011] 优选的，所述的二醛溶液中的二醛为丁二醛、戊二醛、己二醛中的一种。
[0012]优选的，所述的二醛溶液浓度为0 · 5%~10%。
[0013]优选的，所述的活化缓冲液的pH为7.0~8.0,为MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS 缓冲液、三乙醇胺缓冲液中的一种。
[0014] 优选的，所述的偶联缓冲液的pH为7.0~7.5，为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。
[0015] 优选的，所述的贮存缓冲液为pH值为7.2,为10mM Tris-HCl、150mM NaCl、lmM EDTA、0.5 % BSA、0.05 %叠氮化钠的缓冲液中的一中。
[0016] 优选的，所述的磁微粒表面应经过氨基修饰，并可稳定分散于水溶液中。
[0017] 优选的，所述的磁微粒偶联效果检测方法为酶联免疫化学发光法。
[0018] 更为优选的，所述步骤c.后还包括如下步骤：
[0019] d.偶联磁微粒的保存与效果检测:将偶联后的磁微粒分装于贮存缓冲液中保存。
[0020] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0021] 1、本发明偶联的抗体磁微粒复合体可以替代抗体的包被用于酶联免疫吸附、化学 发光、荧光等的检测，合成的复合微粒能稳定的悬浮于缓冲液中与抗原进行类均相反应，大 幅度提高了检测效率，缩短检测时间;本发明操作简单，只需两步即得到稳定的磁微粒偶联 的抗体，反应条件温和，对原物料的无浪费，易于大规模制备。
[0022] 2、本发明将氨基修饰的磁微粒加入至较高浓度二醛试剂中，可较大程度降低磁微 粒之间的自偶联，同时形成亚胺中间体可被反应体系中的特异性还原剂还原为仲胺，而引 入的醛基则未被还原，使得后续磁微粒与抗体偶联过程中不会由于亚胺的逆反应使得磁微 粒脱落，从而大大减少了磁微粒或者抗体的自偶联，大幅度提高偶联的效率以及目标分子 检测的灵敏度与准确性。
[0023] 3、本发明得到的中间品-表面醛基修饰的磁微粒作为"原材料"可长期稳定保存， 并且可用一步法与抗体、抗原、亲和素等进行偶联，是一种通用磁性载体，因此其在试剂盒 生产中可大幅度提高效率，节约生产成本。
[0024] 4、本发明不会影响偶联在磁微粒上的抗体的生物学活性:a)原物料本身不会破坏 生物分子的活性，偶联反应的温度、离子强度、pH值等条件，不会引起抗体的变性;b)抗体与 磁微粒通过多个碳分子的长臂与抗体分子桥联，有效的避免了固相载体的空间位阻效应对 抗体活性的影响。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1本实施例公开了一种磁微粒偶联抗体分子(兔抗雌三醇多克隆抗体)的方 法，包括如下步骤：
[0026] 1.磁微粒的平衡：取lOOmg表面氨基修饰的磁微粒溶胶在磁场作用下沉降（磁分 离）10分钟，去上清液，沉降的磁微粒用20mM pH为7.4的磷酸盐活化缓冲液清洗2~3次，每 次用量l〇ml。
[0027] 2.磁微粒表面醛基活化：
[0028] 2.1.将25%~50%戊二醛溶液用磷酸盐活化缓冲液稀释为5%，取10mL并加入平 衡后的磁微粒，室温下振荡混悬反应1小时后
[0029] 2.2.加入5.6mg三乙酰氧基硼氢化钠，继续反应2小时。
[0030] 2.3.磁分离10分钟，去上清，磁微粒用偶联缓冲液洗涤3次，每次用量10mL。
[0031] 2.4.活化后的磁微粒用lmL偶联缓冲液重分散后4°C保存备用，可长期保存。
[0032] 3.磁微粒与抗体的偶联：
[0033] 3.1.抗体预处理:取3mg兔抗雌三醇多克隆抗体装入透析袋，4°C条件下用1000mL 抗体活化缓冲液透析超过12小时。透析后抗体用紫外分光光度法测量浓度，浓度应大于 lmg/ml，否则通过浓缩调整浓度。
[0034] 3.2.取2mg透析后抗体，加入保存的醛基活化的磁微粒，室温下振荡反应1小时。 [0035] 3.3.加入5.6mg三乙酰氧基硼氢化钠，继续反应3~4小时。
[0036] 3.4.磁分离10分钟，将上清液小心移出后保存于2~8°C，用于偶联效率检测。
[0037] 3.5.分离后的磁微粒偶联抗体用贮存缓冲液洗涤3次，每次用10ml。最后重分散于 贮存缓冲液中，终浓度为1 〇mg/mL，2~8 °C保存。
[0038] 4.磁微粒与抗体偶联效率测定：用Bradford法测定磁微粒偶联后上清液内抗体浓 度，计算未结合抗体质量。用参与偶联的抗体总质量减去未结合抗体质量再除以抗体总量 即为抗体偶联率。
[0039] 5.抗体偶联后磁微粒活性检测：
[0040] 5.1.将酶标抗原(碱性磷酸酶标记的雌三醇抗原)稀释至浓度为0.02μg/ml。
[00411 5 · 2 ·用贮存缓冲液将偶联后磁微粒（浓度10mg/ml)倍比稀释，相应浓度为10mg/ ml、5mg/ml、2 · 5mg/ml、1 · 25mg/ml 等。
[0042] 5.3.将稀释后的磁微粒30μ1与酶标抗原溶液30μ1混合，混匀后37 °C温育5分钟。 [0043] 5.4.磁分离去上清，磁微粒洗涤3次，每次用200ul。
[0044] 5.5.加入碱性磷酸酶催化化学发光底物3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧 酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)30ul，37°C温育5min后测量其发光值，根据发光 值可确定偶联物的活性。
[0045] 实验例
[0046] 1、将实施例1所述方法的磁微粒偶联效率与现有技术未加特异性还原剂的偶联效 率比较，得到的结果如表1所示
[0047]表1磁微粒偶联效率的比较(磁微粒质量为500mg)
[0049] 2、将实施例1所述方法所得到的磁微粒与现有技术未加特异性还原剂制得的磁微 粒进行活性检测比较，得到的结果如表2所示。
[0050] 表2抗体偶联后磁微粒活性检测
[0052]由上表可以看出，实施例1所述的方法，大幅度提高了检测效率，缩短检测时间；用 实施例所述方法制得的磁微粒，活性高;较现有技术有着显著的进步和实用性价值。
[0053]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述方法顺序包括如下步骤： a. 磁微粒的平衡:取含有磁微粒的分散液，磁分离，去上清，用活化缓冲液洗涤； b. 磁微粒的醛基修饰:将平衡后的磁微粒加至二醛溶液中，同时加入选择性还原剂固 体，反应;磁分离，得到活化的表面醛基修饰的磁微粒； c. 活化磁微粒与抗体的偶联:溶解在偶联缓冲液中的抗体其表面游离氨基与醛基活化 的磁微粒通过醛胺缩合被共价偶联在磁微粒表面，同时加入选择性还原剂将亚胺还原得到 稳定的偶联物。2. 如权利要求1所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的选择性还原剂 为氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠中的一种。3. 如权利要求2所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的二醛溶液中的 二醛为丁二醛、戊二醛、己二醛中的一种。4. 如权利要求3所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的二醛溶液浓度 为 0.5% ~10%〇5. 如权利要求4所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的活化缓冲液的 pH为7.0~8.0，为MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、三乙醇胺缓冲液中的一种。6. 如权利要求5所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的偶联缓冲液的 pH为7.0~7.5，为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。7. 如权利要求6所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的贮存缓冲液为 pH值为7.2,为10mM Tris-HCl、150mM NaCl、lmM EDTA、0.5%BSA、0.05%叠氮化钠的缓冲液 中的一中。8. 如权利要求7所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的磁微粒表面应 经过氨基修饰，并可稳定分散于水溶液中。9. 如权利要求8所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述的磁微粒偶联效 果检测方法为酶联免疫化学发光法。10. 如权利要求9所述的磁微粒偶联抗体分子的方法，其特征在于，所述步骤c .后还包 括如下步骤： d. 偶联磁微粒的保存与效果检测:将偶联后的磁微粒分装于贮存缓冲液中保存。
【文档编号】C07K17/14GK106046169SQ201610388140
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】郑招荣, 刘金超
【申请人】深圳市瀚德标检生物工程有限公司