一种高活性长效降糖融合蛋白及其制备方法与医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种高活性长效降糖融合蛋白，由高活性艾塞那肽突变体通过连接肽或者直接与优化突变的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段连接而成，所述优化突变的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段包括：优化突变的人IgG1的铰链区、人IgG1恒定区CH2和CH3。本发明所述的融合蛋白不仅具有长效的降糖作用，还能够在大肠杆菌E.coli中进行可溶性表达，表达产物可直接从细菌破壁液上清中分离纯化得到，极大地简化了生产制备工艺，提高了产物收率，降低了生产成本。
【专利说明】
一种高活性长效降糖融合蛋白及其制备方法与医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种高活性长效降糖融合蛋白及其在制 备糖尿病治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种因胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用不足所致的以高血糖为主要特 征的内分泌代谢紊乱性疾病，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病。糖尿病患者中90 %~95 % 属于2型糖尿病，又名非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependent diabetes me 11 itus，NIDDM)，其主要病理表现为组织对胰岛素不敏感(胰岛素抵抗)和由于胰岛功能 明显减退导致的胰岛素分泌相对不足，形成持久高血糖，并可能产生多种致命性并发症。
[0003] 治疗2型糖尿病的药物主要有磺脲类、双胍类、格列奈类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖 苷酶抑制剂、二肽基肽酶IV(DPP_4)抑制剂、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)受体激动剂和钠-葡 萄糖协同转运蛋白2 (SGLT2)抑制剂等。其中，DPP-4抑制剂和GLP-1受体激动剂除具有降血 糖、极少导致低血糖、安全性和耐受性较好等优点外，还对消化、中枢神经、心血管等多系统 具有保护作用。
[0004]胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是一种重要的内源性肠促胰岛素，由小肠 Langerhans 细胞合成分泌，与GLP-1受体结合后刺激胰岛细胞分泌胰岛素、抑制胰高血糖素的分泌、增 强组织对胰岛素的敏感性，从而降低血糖浓度。但GLP-1分泌进入血液后极易被二肽基肽酶 IV(dipeptidylpeptidase 4，DPP_4)降解，半衰期不足 2min(Vilsboll T.J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88: 220-4) jPP-4是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性切割GLP-1N端 二肽使其失活。
[0005] 艾塞那肽(Exendin-4)是一种从北美洲西北部钝尾毒蜥唾液中发现的外源性GLP-1受体多肽激动剂，由39个氨基酸组成，与GLP-1氨基酸序列具有约53%的同源性。它在哺乳 动物体内的生理功能与GLP-1相似，能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，即只有在机体血 糖浓度高时发挥作用，血糖正常或偏低时不发挥作用。
[0006] 艾塞那肽于2005年4月由美国Amylin与Eli Lilly公司开发上市，并于2009年8月 在中国上市，是首个上市的GLP-1受体激动剂药物。艾塞那肽对二肽基肽酶IV (dipeptidylpeptidase 4，DPP_4)不敏感，因此与GLP-1相比，其体内半衰期显著增长，达到 3.3~4小时（Barnett AH.Drugs Today(Barc).2005;41:563-78;Kolterman OG.Am J Health Syst Pharm.2005;62:173-81)。艾塞那肽在临床上与磺酰脲类药物、二甲双胍或噻 唑烷二酮类药物合用，可有效控制2型糖尿病患者的血糖浓度，且在体内具有良好的安全性 和耐受性，极少导致低血糖现象，目前已成为治疗2型糖尿病的一线治疗药物，但缺点是用 药频率较高，病人一天需要注射不低于2次。
[0007] 艾塞那肽是一种外源性的GLP-1受体激动肽，其分子结构及与GLP-1受体间的相互 作用关系已研究比较清楚（Doyle ME.Regul Pept.2003;114:153-8;A1-Sabah S.Br J Pharmacol .2003; 140:339_46;Donnelly D.Br J Pharmacol .2012; 166:27-41·)。艾塞那妝 N端是一段不规则卷曲，第7-28氨基酸残基形成α螺旋，C端是不规则亲水片断，其N端是激活 受体信号传导途径的关键区域，中间部位和C端是受体结合区域。因此，基于艾塞那肽的分 子结构及其与GLP-1受体之间的相互作用关系研究，对艾塞那肽结构进行进一步优化就可 能获得药理活性更优的艾塞那肽突变体。
[0008] 免疫球蛋白IgG是血液中最丰富的蛋白之一，其体内半衰期可长达21天。因此，在 生物制药领域人的IgGFc片段（即人IgG的铰链区和恒定区CH2-CH3)已被用来与其它活性蛋 白或多肽进行融合以延长其体内半衰期，从而减少用药频次，改善病人对药物治疗的依从 性和耐受性。如，美国Amgen公司开发上市的Romiplostim(罗米司亭），就是一种由血小板生 成素受体(ΤΡ0)结合肽与人IgGIFc组成的融合蛋白，它既保持了原有的结合并激活促血小 板生成素(ΤΡ0)受体使血小板生成增加的功能，同时其体内半衰期也大大延长，在临床上用 于治疗慢性免疫性血小板减少性紫癜（ITP)，再比如PTH-Fc、Trebananib(Amg386)、AMG819 等也都是通过与人IgG的Fc片段进行融合以延长多肽药物的体内半衰期的（Kostenuik PJ.J Bone Miner Res.2007;22:1534-47;Shimamoto G.MAbs.2012;4:586-91)。由于动物 细胞表达成本高、培养周期长且工艺放大困难，而大肠杆菌表达则具有表达产物均一、无糖 基化修饰且发酵周期短、成本低的显著优点（Shimamoto G.MAbs.2012;4:586-91)，因此，上 述Fc融合蛋白均采用大肠杆菌表达系统进行制备（Kostenuik PJ.J Bone Miner Res · 2007; 22:1534-47; Shimamoto G .MAbs · 2012; 4:586-91)。然而，由于这类Fc融合蛋白在 大肠杆菌E. col i表达过程中会形成包涵体，而包涵体的下游处理工艺复杂，需要进行复杂 的变性和复性过程才能形成有活性的可溶性蛋白，这给样品制备带来了较大困难 (Kostenuik PJ.J Bone Miner Res.2007；22:1534-47；Shimamoto G.MAbs.2012；4:586-91;Baneyx F.Nat Biotechnol.2004;22:1399_408)〇
【发明内容】
[0009] 为了克服现有技术不足本发明提供了使用优化突变的人免疫球蛋白IgGl的Fc片 段修饰的高活性长效降糖融合蛋白，将艾塞那肽或其突变体通过连接肽或者直接与优化突 变的人免疫球蛋白IgGl的Fc片段连接而成。本发明所述的融合蛋白不仅具有长效的降糖作 用，还能够在大肠杆菌E. coli中进行可溶性表达，表达产物可直接从细菌破壁液上清中分 离纯化得到，极大的简化了生产制备工艺，提高了产物收率，降低了生产成本。
[0010] 本发明具体技术方案如下： 一种高活性长效降糖融合蛋白，由高活性艾塞那肽突变体通过连接肽或者直接与优化 突变的人免疫球蛋白IgGl的Fc片段连接而成，所述Fc片段包括优化突变的人IgGl的铰链区 和人IgGl恒定区的CH2和CH3,所述优化突变的人IgGl的铰链区（mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl铰链区）的氨基酸序列为-SGGGGSDKTHTCPPCP-(SEQ ID NO: 6)，由天 然的人IgGl铰链区原形序列-VEPKSCDKTHTCPPCP-(SEQIDN0:5)突变而成。所述的人IgGl 恒定区的CH2和CH3序列如SEQ ID NO:7所示。
[0011] 上述连接肽是指富含Gly和/或Ala和/或Ser的柔性肽，长度在1~50个氨基酸残基 之间，优选连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0012] 本发明所述高活性艾塞那肽突变体由野生型艾塞那肽（SEQ ID NO: 1)的第21位 Leu突变为Lys(EX-L21K，SEQ.ID N0:2)、Arg(SEQ.ID N0:3)或His(SEQ.ID N0:4)而成。
[0013] 本发明的一个优选方案，该融合蛋白包括：药理活性增强的艾塞那肽突变体EX-L21K、富含Gly的连接肽、优化突变的人IgGl的铰链区（mutated human IgGlhinge，简称 mhlgGl铰链区）及人IgGl恒定区CH2-CH3。该融合蛋白简称EX-L21K-mhIgGlFc，其氨基酸序 列如SEQ ID N0:11所示。
[0014] 本发明的另一个优选方案，该融合蛋白包括:野生型艾塞那肽、富含Gly的连接肽、 优化突变的人IgGl的铰链区（mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl铰链区）及人IgGl恒 定区CH2-CH3。简称EX-mhIgGIFc，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0015] 本发明提供的优化突变的人IgGl的铰链区-SGGGGSDKTHTCPPCP-(SEQ ID N0:6)由 天然的人IgGl铰链区原形序列-VEPKSCDKTHTCPPCP-(SEQIDN0:5)突变而成，突变后的人 hlgGl的铰链区(mhlgGl铰链区）的N端区域富含Gly和Ser，这既增强了铰链区N-端的柔韧性 和亲水性，且有利于保持融合蛋白的生物学活性及可溶性，同时又消除了原铰链区N端第1 个Cys在蛋白表达过程中形成错配二硫键的可能性。
[0016]本发明的另一目的在于提供上述高活性长效降糖融合蛋白的制备方法，其特征在 于包括如下步骤： (1) 设计合成并克隆本发明所述融合蛋白的编码基因； (2) 构建成表达质粒后转化大肠杆菌宿主菌中进行可溶性表达； (3) 收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分离纯化后得到如本发明所述可溶性融合蛋 白。
[0017] 本发明所述的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc和EX-L21K-mhIgGlFc其体内降糖活性及 降糖作用持续时间显著高于野生型艾塞那肽Exendin-4,其中以EX-L21K-mh IgGIFc的作用 更为优越。
[0018] 本发明另一目的是提供本发明所述高活性长效降糖融合蛋白在制备降低血糖药 物中的应用。
[0019] 本发明所述的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc和EX-L21K-mhIgGlFc可在大肠杆菌 E. col i中进行可溶性表达，表达产物以可溶的二聚体形式存在，可直接从大肠杆菌E. col i 破壁液上清中分离纯化得到，避免了由于形成包涵体而带来的复杂的下游变性和复性处理 过程。而由野生型艾塞那肽与天然的人IgGlFc(hlgGlFc)组成的融合蛋白在大肠杆菌 E. co 1 i中以包涵体的形式表达，无法避免复杂的下游变性和复性处理过程。
[0020] 本发明所述的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc和EX-L21K-mhIgGlFC，具有降糖活性高 和降糖作用持续时间长的显著优点，这将有利于降低获得治疗效果的用药剂量、减少给药 频率、提高药物治疗的依从性，可用于治疗糖尿病及通过降低血糖而受益的其它疾病。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明所述高活性长效降糖融合蛋白EX-mhIgGIFc的结构示意图。（A.野生 型艾塞那肽(Exendin-4)的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc结构示意图，它主要包括:起始甲硫 氨酸Met、野生型艾塞那肽（Exendin-4)、连接肽（-GGGG-)、优化突变的人IgGl的铰链区 (mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl较链区）、恒定区012_013。13·完整的EX-mhIgGIFc 的氨基酸序列及其人工合成基因序列，阴影所示为野生型艾塞那肽(Exendin-4)部分，下划 线所示为优化突变的人IgGl的铰链区(mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl铰链区）部 分，星号所示为终止密码子）。
[0022]图2为本发明所述高活性长效降糖融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc的结构示意图。（A. 高活性艾塞那肽突变体(EX-L21K)的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc结构示意图，它主要 包括：起始甲硫氨酸Met、高活性艾塞那肽突变体(EX-L21K)、连接肽（-GGGG-)、（mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl铰链区）、恒定区（CH2-CH3) 完整的EX-L21K-mhIgGlFc的 氨基酸序列及其人工合成基因序列，阴影所示为高活性艾塞那肽突变体(EX-L21K)部分，下 划线所示为优化突变的人IgGl的铰链区(mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl铰链区） 部分，星号为终止密码子）。
[0023]图3为:A.野生型艾塞那肽(Exendin-4)的长效融合蛋白EX-hIgGIFc结构示意图， 它主要包括:起始甲硫氨酸Met、野生型艾塞那肽(Exendin-4)、连接肽(-GGGG-)、天然的人 IgGl的铰链区（hlgGl铰链区）、恒定区CH2-CH3A.完整的EX-hIgGIFc的氨基酸序列及其人 工合成基因序列，阴影所示为野生型艾塞那肽(Exendin-4)部分，下划线所示为天然的人 IgGl的铰链区(hlgGl铰链区）部分，星号所示为终止密码子。
[0024] 图4为本发明所述高活性长效降糖融合蛋白的重组表达质粒结构示意图。(A.大肠 杆菌表达野生型艾塞那肽(Exendin-4)的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的重组质粒pET-EX-mhlgGlFc示意图，T7promoter: T7启动子;AP:氨苄抗性基因；EX-mhIgGIFc:野生型艾塞那肽 (Exendin-4)的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的编码基因 ；Ori :pET21b质粒复制起始点；lac I:乳糖操纵子阻遏蛋白。B.大肠杆菌表达高活性艾塞那肽突变体(EX-L21K)的长效融合蛋 白 EX-L21K-mhIgGlFc 的重组质粒 pET-EX-L21K-mhIgGlFc 示意图，T7promoter: T7 启动子； AP:氨苄抗性基因；EX-L21K-mhIgGlFc:高活性艾塞那肽突变体(EX-L21K)的长效融合蛋白 EX-L21K-mhIgGlFc的编码基因 ；Ori :pET21b质粒复制起始点；lac I:乳糖操纵子阻遏蛋白。 C.大肠杆菌表达野生型艾塞那肽长效融合蛋白EX-hIgGIFc的重组质粒pET-EX-hIgGIFc示 意图，T7promoter: T7启动子;AP:氨苄抗性基因；EX-hIgGIFc:野生型艾塞那肽(Exendin-4) 的长效融合蛋白EX-hIgGIFc的编码基因 ；Ori :pET21b质粒复制起始点；lac I:乳糖操纵子 阻遏蛋白）。
[0025] 图5为本发明所述高活性长效降糖融合蛋白的电泳结果。(A.12%SDS-PAGE分析野 生型艾塞那肽（Exendin-4)的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的样品纯度，M:低分子量蛋白 Marker;Lane 1:破菌液上清；Lane 2:Protein A柱穿过液；Lane 3:Protein A亲和柱纯化 的样品；Lane 4~5:Superdex分子筛纯化的样品。B. 12%SDS-PAGE分析高活性艾塞那肽突 变体(EX-L21K)的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc的样品纯度，M:低分子量蛋白Marker; Lane 1:破菌液上清；Lane 2~3:Protein A柱穿过液；Lane 4:Protein A亲和柱纯化的样 品；Lane 5:Superdex分子筛纯化的样品）。
[0026] 图6为SEC-HPLC色谱检测本发明所述高活性长效降糖融合蛋白分子量和纯度结果 (色谱柱：Shodex PROTEIN KW-802.5，SH0WA DENK0 K.K·，Japan 分析四种标准蛋白：BSA (MW = 67kDa)、鸡卵清蛋白（MW = 43kDa)、胰凝乳蛋白酶原（MW = 25kDa)和溶菌酶（MW = 14.41^^)，它们的保留时间分别是11.15111丨11，11.941^11，13.281^11，14.311^11，所对应的保留 体积分别为7.81ml，8.36ml，9.30ml，10.02ml分析纯化的艾塞那肽(Exendin-4)长效融 合蛋白EX-mhIgGIFc，其保留时间为11.532min，对应的保留体积为8.07ml，推算的分子量为 54.62kDa，纯度达98.296%。(：.分析纯化的高活性艾塞那肽突变体化乂-1^211〇长效融合蛋白 EX-L21K-mhIgGlFC，其保留时间为11.534min，对应的保留体积为8.07ml，推算的分子量为 54 · 57kDa，纯度达99 · 642 % )。
[0027] 图7为野生型艾塞那肽（Exendin-4，EX-4)、野生型艾塞那肽长效融合蛋白（EX-mhlgGlFc)及高活性艾塞那肽突变体的长效融合蛋白（EX-L21K-mhIgGlFc)腹腔给药后对 BKS·Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠血糖水平的影响（n = 8，means±SEM)0
[0028] 图8为野生型艾塞那肽（Exendin-4，EX-4)、野生型艾塞那肽长效融合蛋白（EX- mhlgGlFc)及高活性艾塞那肽突变体长效融合蛋白（EX-L21K-mhIgGlFc)腹腔给药后对 BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小鼠血糖水平的影响。AUCo- 12Qh如图所示。#表示与正常组 比较p〈〇 . 0001 和****表示与模型组比较P〈〇. 05，P〈0.01 及P〈0.0001; Λ4πΛΛΛΛ表示与 Ex-4组比较Ρ〈0 · 01 及Ρ〈0 · 0001 (η = 8，means 土 SEM) 〇
[0029] 图9为野生型艾塞那肽（Exendin-4，EX-4)、野生型艾塞那肽长效融合蛋白（EX-mhlgGlFc)及高活性艾塞那肽突变体长效融合蛋白（EX-L21K-mhIgGlFc)对BKS.Cg-Dock7 m +/+Leprdb/JNju小鼠 IPGTT的影响（n = 8，means 土 SEM)。
[0030] 图10为野生型艾塞那肽(Exendin-4，EX-4)、野生型艾塞那肽长效融合蛋白（EX-mhlgGlFc)及高活性艾塞那肽突变体长效融合蛋白（EX-L21K-mhIgGlFc)对糖尿病小鼠糖耐 量的影响。如图所示〇_180min的血糖曲线下面积AUCo-i8〇mi n，_#表示与正常组比较P〈 0 · 0001;****表示与模型组比较P〈0 · 0001 (n = 8，means 土 SEM) 〇
【具体实施方式】
[0031] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0032] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0033] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是 为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0034] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 [0035]下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
[0036] 下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0037] 实施例1野生型艾塞那肽长效融合蛋白及高活性艾塞那肽突变体长效融合蛋白的 设计 1、野生型艾塞那肽Exendin-4氨基酸序列（SEQ ID N0:1)，将其第21位Leu突变成Lys便 得到高活性艾塞那肽突变体(EX-L21K)的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)。
[0038] 野生型艾塞那肽Exendin-4氨基酸序列： HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID Ν0:1)〇
[0039] 高活性艾塞那肽突变体E X - L 2 1 K氨基酸序列： HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRKFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID N0:2)〇
[0040] 2、优化突变的人hIgGl的铰链区(mhIgGl铰链区）氨基酸序列见SEQ.IDN0:6，它由 天然的人hIgGl的较链区（氛基酸序列见SEQ.IDN0:5)(EdelmanGM.ProcNatlAcadSci U S A. 1969;63:78-85)突变而成。与天然的人hlgGl的铰链区（hlgGl铰链区）相比，突变后 的人hlgGl的铰链区(mhlgGl铰链区）的N端区域的氨基酸富含Gly和Ser，这样既增强了铰链 区N-端的柔韧性和亲水性，又消除了原铰链区N端第1个Cys在蛋白表达过程中形成错配二 硫键的可能性。下划线部分为突变区域。
[0041 ] 天然的人hlgGl铰链区（hlgGl铰链区）氨基酸序列：VEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ.ID NO: 5) 优化突变的人hlgGl铰链区(mutated human IgGlhinge，简称mhlgGl铰链区）氨基酸序 列：SGGGGSDKTHTCPPCP(SEQ· ID NO:6) 连接肽序列的设计:连接肽是指富含Gly和/或Ala和/或Ser的柔性肽，长度在1~50个 氨基酸残基之间，优选的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0042] 3、野生型艾塞那肽Exendin-4的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc由以下几部分组成:野 生型艾塞那肽Exendin-4、连接肽、优化突变的人IgGl的铰链区（mhlgGl铰链区）和恒定区 CH2-CH3。其结构示意图见图1A。其氨基酸序列（SEQ.ID N0:9)及根据大肠杆菌偏爱的密码 子设计的编码基因序列（SEQ. ID N0:10)见图1B。
[0043] 4、高活性艾塞那肽突变体EX-L21K的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc由以下几部 分组成:高活性的艾塞那肽突变体EX-L21K、连接肽、优化突变的人IgGl的铰链区(mhlgGl铰 链区）和恒定区CH2-CH3。其结构示意图见图2A，其氨基酸序列（SEQ. ID NO: 11)及根据大肠 杆菌偏爱的密码子设计的编码基因序列（SEQ. ID N0:12)见图2B。
[0044] 5.野生型艾塞那肽Exendin-4的长效融合蛋白EX-hIgGIFc由以下几部分组成:野 生型艾塞那肽Exendin-4、连接肽、天然的人hlgGl铰链区(hlgGl铰链区）和恒定区CH2-CH3。 其结构示意图见图3A。其氨基酸序列（SEQ.ID N0:13)及根据大肠杆菌偏爱的密码子设计的 编码基因序列（SEQ.ID N0:14)见图3B。
[0045]实施例2野生型艾塞那肽长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的克隆与表达 野生型艾塞那肽的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的编码基因（SEQ.ID N0:10)由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成并克隆，用Nde I和Hind III双酶切后再亚克隆到原核表达载体 pET21b中，构建成表达质粒pET-EX-mhIgGIFc(图4A)，测序验证其序列正确性，再用CaCl2法 将之转化大肠杆菌E. co 1 iBL21 (DE3)宿主菌中进行表达。
[0046]接单菌落于50ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素），200rpm于37°C振荡培 养14h。按1 % (V/V)的接种量转接至200ml TB培养基(胰蛋白胨1 · 2 %，酵母粉2 · 4%，甘油 0.4%(v/v)，17mM KH2P〇4,72mM K2HP〇4 · 3H20，100μg/ml氨苄青霉素），37°C振荡培养至 OD6〇〇nm达1.0左右，加入乳糖至1 % (w/v)，200rpm于25°C振荡诱导表达15h，同时设立阴性对 照（即不加乳糖诱导）。
[0047]收集发酵液，lOOOOrpm离心10min收集菌泥，湿菌泥称重，按照1:15(g/ml)的比例， 用PBS重悬菌泥，均质机(AH100B，ATS Engineering Inc.，Canada)低温破碎细菌，破碎过程 中保持均质机的压力在800~900bar，破碎3次。菌体破碎完成后，将细胞破碎液于4°C离心 (12000rpm，20min)，取上清进行12%SDS-PAGE电泳分析，结果表明在分子量约30KD处有明 显的蛋白表达条带（图5A)，证明该融合蛋白为可溶性表达。
[0048]实施例3高活性艾塞那肽突变体的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc的克隆与表达 以实施例2中野生型艾塞那肽的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的编码基因（SEQ.ID N0:10)为 模板，采用重叠延伸PCR定点突变的方法(Ho SN.Gene. 1989;77:51-9)对之进行突变，得到 高活性艾塞那肽突变体的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc的编码基因（SEQ.ID N0:12)。
[0049]由南京金斯瑞生物科技有限公司合成以下引物： (1) 正向突变引物(EX-L21K-F): 5'GGAAGAAGAAGCGGTTCGTAAATTCATCGAATGGCTGAAAAAC 3'(SEQ. ID NO:17)； (2) 反向突变引物(EX-L21K-R): 5'GTTTTTCAGCCATTCGATGAATTTACGAACCGCTTCTTCTTCC 3'（SEQ.ID N0:18); (3) 外侧正向引物(Ndel-EX-F): 5'AGATATACATATGCACGGTGAAGGTACCTTCACCTCTGAC 3'（SEQ.ID N0:19); (4) 外侧反向引物(HindIII-Fc-R): 5 ' CGTCGACAAGCTTCTATTATTTACCCGGAGACAGAGACAGAG 3 '（SEQ. ID N0:20)。
[0050] 扩增上游片段A:以EX-mhIgGIFc的编码基因（SEQ.ID腸：10)为模板，在?&8七？作 DNA Polymerase聚合酶(TransGen Biotech产品）的作用下进行PCR反应。25μ1反应体系组 成如下：外侧正向引物(Ndel-EX-F)lOpmol;反向突变引物(EX-L21K_R)10pmol ;Fast pfu DNA Polymerase 2.5个单位；5X反应缓冲液5yl;dNTP(10mM each)0.5yl;模板质粒DNA0.5 μL(约2.5ng);用无菌水补足到25以1{〇?反应条件如下:95°C变性2分钟；进入循环反应:95 °C变性20秒，50 °C退火20秒，72 °C延伸10秒，反应30个循环;72 °C延伸5分钟。反应结束后，产 物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并用TaKaRa的胶回收试剂盒进行回收。
[0051 ] 扩增下游片段B:以EX-mhIgGlFc编码基因（SEQ.IDN0:10)为模板，在FastpfuDNA Polymerase聚合酶(TransGen Biotech产品）的作用下进行PCR反应。25μ1反应体系组成如 下：正向突变引物(EX-L21K-F) lOpmol;外侧反向引物(HindIII-Fc-R) lOpmol ;Fast pfu DNA Polymerase 2.5个单位；5X 反应缓冲液5yl;dNTP(10mM each)0.5yl;模板质粒DNA 0.5μ1 (约2.5ng);用无菌水补足到25μ1 JCR反应条件如下:95°C变性2分钟;进入循环反应： 95°C变性20秒，50°C退火20秒，72°C延伸30秒，反应30个循环；72°C延伸5分钟。PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并用TaKaRa的胶回收试剂盒进行回收。
[0052]重叠延伸PCR扩增获得完整的突变体基因：以上游片段A和下游片段B的混合液为 模板，在Taq plus DNA Polymerase(TAKARA公司产品）的作用下进行PCR反应。50μ1反应体 系组成如下：外侧正向引物(Ndel-EX-F) lOpmol;外侧反向引物(HindIII-Fc-R) lOpmol ;Taq plus DNA Polymerase 2.5个单位；10 X Taq plus bufTer(with MgCl2)5yl;dNTP(10mM each)lyl;上游片段A和下游片段B的混合液ΙμL (约5ng);用无菌水补足到δΟμΚΡΟ?反应条 件如下：95°C变性3分钟；进入循环反应:94°C变性30秒，55 °C退火30秒，72°C延伸1分钟，反 应30个循环;72 °C延伸5分钟。PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用TaKaRa的胶回收试 剂盒进行回收。
[0053] 将获得的突变体基因用Nde I和Hind III双酶切后克隆到原核表达载体pET21b 中，构建成表达质粒pET-EX-L21K-mhIgGlFc(图4B)，DNA序列结果表明与高活性艾塞那肽突 变体的长效融合蛋白EX-L21 K-mhI gG 1 Fc的基因序列（SEQ. ID NO: 12) -致。将该表达质粒 pET-EX-L21K-mhIgGlFc转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)宿主中，参照实例2的蛋白表达方 法对高活性艾塞那肽突变体的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc进行表达。表达后将细胞破 碎液于4°C离心（12000rpm，20min)，取上清进行12% SDS-PAGE电泳分析，结果表明在分子量 约30KD处有明显的蛋白表达条带（图5B )，证明该融合蛋白为可溶性表达。
[0054]实施例4野生型艾塞那肽长效融合蛋白EX-hIgGIFc的克隆与表达 野生型艾塞那肽的长效融合蛋白EX-hIgGlFc的编码基因（SEQ.IDN0:14)由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成并克隆，用Nde I和Hind III双酶切后再亚克隆到原核表达载体 pET21b中，构建成表达质粒pET-EX-hIgGIFc(图4C)，测序验证后用CaCl2法将之转化大肠杆 菌E. coliBL21(DE3)宿主菌中进行表达。
[0055]参照实例2的蛋白表达方法对野生型艾塞那肽的长效融合蛋白EX-hIgGIFc进行表 达，表达后将细胞破碎液于4°C离心（12000rpm，20min)，取上清进行12 % SDS-PAGE电泳分 析，结果在分子量约30KD处未出现目的蛋白表达条带，说明该融合蛋白未能可溶性表达。
[0056] 实施例5融合蛋白EX-mhIgGIFc和EX-L21K-mhIgGlFc的分离纯化 1、收集菌泥及破壁:发酵液于4°C离心（l(KKK)rpm，10min)收集菌泥，湿菌泥称重，按照 1:15 (g/ml)的比例，用PBS缓冲液重悬菌泥，并洗涤菌泥2到3次。再用破菌缓冲液(PBS缓冲 液(pH 7.4)含ImM的PMSF，lmM的EDTA)按 10%(w/v)比例重悬菌泥，ATS均质机(AH100B，ATS Engineering Inc.，Canada)破碎细胞，破碎过程中保持均质机的压力在800~900bar，破碎 3次。4 °C离心（12000rpm，20min)收集破壁液上清。
[0057] 2、Protein A亲和层析：平衡缓冲液PBS(pH 7.4)充分平衡HiTrap rProtein A FF 亲和色谱预装柱(GE公司产品），破壁液上清经0.22μπι水相滤膜抽滤后上样，流速0.5ml/ min，上样完成后用平衡缓冲液冲洗色谱柱，洗去未结合的杂蛋白。然后用洗脱缓冲液(0.1M 柠檬酸，NaOH调pH至4.0)进行洗脱，每毫升收集液加入450μ1中和缓冲液（1M Tris盐酸缓冲 液(pH调至9.0)与甘油按1:2混合而成）。
[0058] 3、硫酸铵沉淀:冰冷饱和硫酸铵溶液0.22μπι膜抽滤后，按lml/min流速滴加至置于 冰水浴的上述蛋白样品溶液，至60%浓度，沉淀目的蛋白，整个过程中磁力搅拌器缓慢搅 拌。4°C离心（1 OOOOrpm，20min)收集沉淀，并用适量PBS缓冲液(pH 7.4)溶解，得到目的蛋白 浓缩液。
[0059] 4、凝胶色谱层析:？85缓冲液化!17.4)充分平衡5卯61(161 200111(^6386 10/30061^ 凝胶过滤预装柱（GE公司产品）。取500μ1硫酸铵沉淀的目的蛋白浓缩液，4°C离心 (lOOOOrpm，10分钟)取上清，上样至已平衡的色谱柱，流速为0.4ml/min。收集目的蛋白洗脱 峰，并在超净台上用〇. 22μπι滤膜过滤除菌后分装，-70°C保存。
[0060] 纯化各步收集的样品经12 % SDS-PAGE电泳分析，结果见图5A和5B。
[00611 实施例6融合蛋白EX-mhIgGIFc和EX-L21K-mhIgGlFc分子量检测及纯度分析利用 分子排阻法（Size Exclusion Chromatography，SEC)在HPLC系统（LC-2010A HT，SmMADZU Corp.，Japan)上进行分析，色谱柱为Shodex PROTEIN KW-802.5(SH0WA DENK0 Κ·Κ·， Japan)，流动相为0.2M磷酸缓冲液(pH 7.4)，含0.1M Na2S04(按层析柱说明书要求添加），流 速为0 · 7ml/min，检测波长为280nm。
[0062] 对上海源叶生物科技公司购买的四种标准蛋白进行单独分析和混合分析，结果表 明，四种标准蛋白BSA(MW=67kDa)、鸡卵清蛋白（MW=43kDa)、胰凝乳蛋白酶原(MW = 25kDa) 和溶菌酶(MW = 14 · 4kDa)的保留时间分别是11 · 15 2min，11 · 938min，13 · 284min，14 · 31min (图6A)，所对应的保留体积分别为7.81ml，8.36ml，9.30ml，10.02ml。根据各标准蛋白的分 子量和保留体积做出标准曲线，得到分子量计算公式为lgMW=-〇. 2965 X Ve+4.1308。
[0063] 野生型艾塞那肽长效融合蛋白EX-mhIgGIFc的保留时间为11.532min，如图（6B)所 示，对应的保留体积为8.07ml，根据上述公式计算的分子量为54.62kDa，与ExPASy网站 (http: //web · expasy · org/compute_pi/)预测的二聚体分子量 60 · 92kDa 相近。
[0064]高活性艾塞那肽突变体的长效融合蛋白EX-L 21K -mh I gG1F c的保留时间为 11.534min，如图（6C)所示，对应的保留体积为8.07ml，根据上述公式计算的分子量为 54 · 57kDa，与ExPASy网站（http: //web · expasy · org/compute_pi/)预测的二聚体分子量 60.98kDa 相近。
[0065]由此可知，纯化得到的野生型艾塞那肽的长效融合蛋白EX-mhIgGIFc和高活性艾 塞那肽突变体的长效融合蛋白EX-L21K-mhIgGlFc均以可溶的二聚体形式存在。
[0066]此外，采用峰面积比较法对上述两种蛋白的SEC-HPLC分析结果进行纯度分析，结 果显示，纯化的EX-mhIgGIFc样品的纯度为98.296% (图6B)，纯化的EX-L21K-mhIgGlFc样品 的纯度为99.642% (图6C)。
[0067] 实施例711型糖尿病模型小鼠 C57BL/KsJ-db/db体内降糖试验 六周龄雄性II型糖尿病模型小鼠 C57BL/KsJ-db/db(即S.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju小 鼠）50只及对照小鼠 C57BLKS/JN ju 10只均购自南京大学一南京生物医药研究院（合格证 号：201602819，许可证号：SCXK(苏）2015-0001 )。小鼠饲养于SPF级动物房，室温25°C，湿度 4 0 - 6 0 %，明暗各12 h，适应性饲养一周后进行实验。血糖浓度采用R 〇 c h e Accu-Chck贫 Performa血糖仪及血糖试纸进行测定。实验分组及给药方式见表1。
[0068]表1实验动物分组及给药情况
注:NS，为生理盐水;Ex-4为阳性药醋酸艾塞那肽(Exendin-4)，上海吉尔生化有限公司 产品（目录号：052143;批号:P160102-CQ052143;分子式:(^8^282^0()6(^;纯度99·41 % ;分子 量：4186.66Da) 1.急性降糖试验 给药前检测各组小鼠血糖水平。如表2、图7所示，模型组、Ex-4、EX-mhIgGlFc及EX-L21K-mhIgGlFc(5-20nmol/kg)分别为：24·16±0·81、24·53±1·20、23·31±1·05、23·04± 1，23、22.41±1.51、24.99±1.43111]\1，与正常对照组8.58±0.25111]\1比较，差异极显著（？〈 〇. 0001)，模型组与各药物组之间无差异，说明BKS. Cg-D〇Ck7m+/+Leprdb/JNju已经形成糖尿 病，且药物组与模型组之间无差异，可以进行后续实验。
[0069] 小鼠给药物后，连续监测给药后1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、96、120h血糖水平。 结果如表2及图7所示。给药lh后，Ex-4、EX-L21K-mhIgGlFc(5-20nmol/kg)组即有较显著降 糖作用，而EX-mhIgGIFc直至2h才表现出其降糖作用(P〈0.0 lvs模型组），各药物组至给药8h 还表现出很强的降糖活性(P〈〇.〇〇〇lvS模型组hEx-4组给药12h后小鼠血糖即逐渐回升至 给药前水平，EX-mhIgGIFc组小鼠直至给药48h后血糖才逐渐升至给药前水平。EX-L21K- mhIgGIFc各剂量组降糖作用更持久，其中5nmol/kg EX-L21K-mhIgGlFc降糖作用持续至给 药后72h(P〈0 · Olvs模型组），10nmol/kg EX-L21K_mhIgGlFc(P〈0 · Olvs模型组）和20nmol/kg EX-L21K-mhIgGlFc(P〈0.0001vs模型组)直至给药96h后仍有降糖作用。
[0070]表2 · Ex-4/FC 及 EX-L21K/FC 对 BKS · Cg-Dock7m+/+Leprdb/JN ju小鼠的降糖活性
注:表示与正常组比较P〈〇. 0001 Λ'*#和##表示与模型组比较P〈〇. 05、p〈0.01、P 〈0·001及P〈0·0001;Λ、ΛΛ、ΛΛΛ及 ΛΛΛΛ表示与Eχ-4组比较P〈0·05、P〈0·01、P〈0·001及P〈 0.0001; (n = 8，means 土 SEM)。
[0071 ] 进一步用曲线下面积（area under the curve，AUC)方法分析评价Ex_4、EX_ mhlgGlFc及EX-L21K-mhIgGlFc(5-20nmol/kg)的降糖作用，如图8所示，与正常对照组比较， 模型组 AUCo-24h、AUC〇-72h、AUC〇-12Qh 均显著增大（ρ〈0·0001)。给予 Ex-4、EX-mhIgGlFc及 EX-1^11(1111186卟(3(5-2011111〇1/1^)后41]〇)-2也分别降至374.46±6.201111.11(?〈0.05￥8模型组）、 337.76±13.35111]\1.11(?〈0.0001￥8模型组）、296.69±34.39111]\1.11(?〈0.0001￥8模型组）、 237.34±16.87111]\1.11(?〈0.0001￥8模型组）、230.80±20.09111]\1.11(?〈0.0001￥8模型组）。与 Εχ-4比较，EX-mhlgGlFc 及 EX-L21K-mhIgGlFc(5-20nmol/kg)各组药物的AUC()-24h无显著差 异。EX-mh I gG lFc 及 EX-L21 K-mh I gG lFc (5-20nmo 1/kg)各组 AUCo-72h、AUCo-i2〇h 与模型组比较均 显著降低，而Ex-4组与模型组比较无显著变化。
[0072] 综上所述，Ex-4、EX-mhIgGlFc及EX-L21K-mhIgGlFc 3个药物均有降糖作用，其中 Ex-4起效较快，给药lh后即有显著降糖作用。EX-mhlgGlFc降糖作用起效相对较慢，给药2h 后才表现出降糖作用，但是其降糖作用持续时间较长，可延长至给药后48LEX-L21K-mhlgGlFc不仅给药lh内即有降糖作用，而且持续时间更延长至给药后96h。
[0073] 2 ·腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT) 实验前各组动物过夜禁食18h，首先分别腹腔注射生理盐水、Ex-4、EX-mhIgGlFC及EX-L21K-mhIgGlFc，给药2h后，每只小鼠腹腔注射1.5g/kg葡萄糖，尾静脉取血，记录_120、0、 15、30、45、60、90、120、180min血糖浓度。实验期间动物正常饮食供水。
[0074] IPGTT实验结果见图9,给 10nmol/kg Ex_4、10nmol/kg EX-mhlgGlFc及5_20nmol/ kg EX-L21K-mhIgGlFc后，小鼠空腹血糖均显著降低(P〈0.0001vS模型组）。腹腔注射1.5g/ kg葡萄糖15min后，模型组小鼠血糖由8.49 ± 0.54升至22.55 ± 1.77mM并且一直维持较高水 平，而Ex-4、EX-mhIgGlFC及EX-L21K-mhIgGlFc各药物组小鼠腹腔注射葡萄糖后，血糖虽有 升高，但很快降低至正常水平，并持续维持较低水平，直至给药后180min还未升至给糖前水 平。
[0075]进一步应用曲线线下面积分析，结果如图10所示，与正常对照组比较，模型组 AUCo-i8〇min显著增大（p〈0 · 0001)。首先给10nmol/kg Ex-4、10nmol/kg EX-mhlgGlFc及5-20nmol/kg EX-L21K_mhIgGlFc预作用 120min，然后再腹腔注射 1.5g/kg葡萄糖，AUCo-i8〇min分 别降至 2058±109.5(卩〈0.0001￥8模型组）、2397±62.49(卩〈0.0001￥8模型组）、2338±181.2 (P〈0.0001 vs模型组）、2035 ± 169.6(Ρ〈0· 0001 vs模型组）、2082 ± 119.9mM · min(P〈 O.OOOlvs模型组）。由此可见，Ex-4、EX-mhIgGlFc及EX-L21K-mhIgGlFc均可显著增强糖尿病 小鼠对于葡萄糖的耐受性。
【主权项】
1. 一种高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于由高活性艾塞那肽突变体通过连接肽或 者直接与优化突变的人免疫球蛋白IgGl的Fc片段连接而成。2. 根据权利要求1所述的高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于所述优化突变的人免 疫球蛋白IgGl的Fc片段包括:优化突变的人IgGl的铰链区、人IgGl恒定区CH2和CH3,所述优 化突变的人IgGl的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。3. 根据权利要求2所述的高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于所述的人IgGl恒定区 的CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。4. 根据权利要求1所述的高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于所述连接肽是指富含 Gly和/或Ala和/或Ser的柔性肽，长度在1~50个氨基酸残基之间。5. 根据权利要求4所述的高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于所述连接肽的氨基酸 序列如SEQ ID NO: 8所示。6. 根据权利要求1所述的高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于所述高活性艾塞那肽 突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。7. 根据权利要求1所述的高活性长效降糖融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID N0:ll、15、16所示。8. 根据权利要求1-7之一项所述的高活性长效降糖融合蛋白的制备方法，其特征在于 所述融合蛋白可在大肠杆菌中进行可溶性表达，具体包括如下步骤： (1) 设计合成并克隆得到根据权利要求1-7之一项所述融合蛋白的编码基因； (2) 构建成表达质粒后转化大肠杆菌宿主菌中进行表达； (3) 收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分离纯化后得到如权利要求1-7之一项所述的 可溶性融合蛋白。9. 根据权利要求1-7之一项所述的高活性长效降糖融合蛋白在制备降低血糖药物中的 应用。
【文档编号】A61K38/22GK106046176SQ201610678121
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月16日
【发明人】谭树华, 古丽丽, 付剑, 张永波, 田清华, 王玥, 龚晓健
【申请人】中国药科大学