聚噁唑啉poz化合物、合成其的方法、以及靶分子?poz偶联物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及聚噁唑啉POZ化合物、合成其的方法、以及靶分子?POZ偶联物。本发明公开了一种合成末端活化的聚噁唑啉POZ化合物的方法，所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合物具有基本结构R1?[N(COR7)CH2CH2]n?S?Qq?X，所述方法包括步骤：(a)引发POZ聚合以形成在末端上具有带正电荷的阳离子的POZ聚合物；以及(b)用结构为R25S?Dd?X的硫醇盐终止所述POZ聚合物。本发明还公开了利用该方法制备的聚噁唑啉POZ化合物，另外还公开了通式为A?B?TM的水解稳定的靶分子?POZ偶联物。
【专利说明】聚噁唑啉ΡΟΖ化合物、合成其的方法、以及靶分子-ΡΟΖ偶联物
[0001 ] 本申请是申请日为2008年2月28日、申请号为"200880013983.5"、发明名称为"活 化的聚噁唑啉及包含该聚噁唑啉的组合物"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2007年2月28日提交的美国临时申请60/892，212的权益。
技术领域
[0003] 本公开涉及聚噁唑啉衍生物、这类聚噁唑啉衍生物的制备中可用的合成方法和中 间体、以及用这类聚噁唑啉衍生物产生的水解稳定的靶分子-聚噁唑啉偶联物。
【背景技术】
[0004] 在现代药物科学中，聚合物修饰疗法已被证实具有高实用性。特别地，与聚乙二醇 类(PEGs)偶联的蛋白质现已构成治疗一系列疾病的诸多很重要的疗法。由于聚合物修饰疗 法的成功，故扩展具有这类应用的聚合物的范围、尤其是提供具有聚乙二醇所不具有的性 质的聚合物是人们所感兴趣的。
【发明内容】
[0005] 本发明提出了一种合成末端活化的聚噁唑啉Ρ0Ζ化合物的方法，所述末端活化的 聚噁唑啉Ρ0Ζ化合物具有基本结构Ri-WCOtWOfcO^n-S-Qq-X，所述方法包括步骤：
[0006] (a)引发Ρ0Ζ聚合以形成在末端上具有带正电荷的阳离子的Ρ0Ζ聚合物；以及 [0007] (b)用结构为R25S-Dd-X的硫醇盐终止所述Ρ0Ζ聚合物，
[0008] 其中，
[0009] X为活性官能团或能转化为活性官能团的基团；
[0010] R25 为金属； _] D为连接基团；
[0012] d和q为 1;
[0013] Q为连接基团；
[0014] Ρ0Ζ的各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
[0015] Ri是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；以及
[0016] η为从3至1000的整数；
[0017] 其中，
[0018] 所述活性官能团能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-Ρ0Ζ偶联物。
[0019] 根据本发明的一个实施方式，X选自由醛、活性碳酸盐(-0-C0-Z)、马来酰亚胺、磺 酸酯(〇S02-R 23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸盐、异硫氰酸盐、 硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-C0-Z)和羧酸组成的集合，其 中任何前述基团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R 23为未取代的或取代的烷 基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。
[0020] 根据本发明的一个实施方式，R?含1-12个碳原子。
[0021] 根据本发明的一个实施方式，R?为甲基、乙基或正丙基。
[0022] 根据本发明的一个实施方式，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、 杂环基或芳基、-(CH2 ) m_C0NH- ( CH2 ) m_、_NH- ( CH2 ) m_NHC〇- ( CH2 ) m_、_C〇- ( CH2 ) m_、_C〇-C6H4_、 或-C〇-R8、-(R 15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、Rii和Ri5各自独立地 选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C 6H1Q-CH2-。
[0023] 根据本发明的一个实施方式，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构：
[0024] (a) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H
[0025] (b) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2-C02H
[0026] (c)CH3-[N(COCH2CH3)CH2CH2]n S-CH2CH2-NH2
[0027] (d) CH3- [ N (COCH2CH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H
[0028] (e) H- [ N( COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H
[0029] (f)
[0032] 其中n是从3到1000的整数。
[0033] 根据本发明的一个实施方式，R25是Li、Na或者K。
[0034] 根据本发明的一个实施方式，所述连接基团D是未取代的或取代的烷基、烯基、杂 环基或芳基，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基、芳基、-(CH 2)b_⑶冊-(CH2) b_、-NH- (CH2) b-NHC〇- (CH2) b_、-CO- (CH2) b_、-C0-C6H4-、或-C〇-R26、或-(CR27R28) b，其中， R27和R28各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，以及R26为-c 6h1〇-CH2-0
[0035] 根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团与靶分子形成水解稳定的连接。 [0036]本发明还公开了根据本发明的上述方法所制备的聚噁唑啉Ρ0Ζ化合物。
[0037]本发明还提出了一种末端活化的聚噁唑啉Ρ0Ζ化合物，具有基本结构心-^(0)1?7) CH2CH2]n-S-Qq-X，
[0038]其中，
[0039]所述末端活化的聚噁唑啉Ρ0Ζ化合物中的所有连接是水解稳定的，
[0040] X为能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-Ρ0Ζ偶联物的活性官能团，其 中，该水解稳定的连接不是酯键或者二硫键，所述活性官能团选自由醛、活性碳酸盐(-〇-co-ζ)、马来酰亚胺、磺酸酯(os〇 2-R23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、 氰酸盐、异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-C0-Z) 和羧酸组成的集合，其中任何前述官能团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及 R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基；
[0041] Q为连接基团；
[0042] ΡΟΖ的各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
[0043] Ri是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；
[0044] η为从3至1000的整数；以及
[0045] q为1〇
[0046] 根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团被保护。
[0047]根据本发明的一个实施方式，R7含1-12个碳原子。
[0048]根据本发明的一个实施方式，R7为甲基、乙基或正丙基。
[0049]根据本发明的一个实施方式，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、 杂环基或芳基、-(CH2 ) m_C0NH- ( CH2 ) m_、_NH- ( CH2 ) m_NHC〇- ( CH2 ) m_、_C〇- ( CH2 ) m_、_C〇-C6H4_、 或-C〇-R8、-(R 15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、Rii和Ri5各自独立地 选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C 6H1Q-CH2-。
[0050]根据本发明的一个实施方式，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构：
[0051 ] (a) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H
[0052] (b) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2-C02H
[0053] (c) CH3- [N(COCH2CH3) CH2CH2 ] n S-CH2CH2-NH2
[0054] (d) CH3- [ N (COCH2CH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H
[0055] (e) H- [ N( COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H
[0056] (f)
-. 7
[0059] 其中n是从3到1000的整数。
[0060] 本发明还提出了一种通式为A-B-TM的水解稳定的靶分子-ΡΟΖ偶联物，其中，
[0061] Α为上文所述的本发明的Ρ0Ζ化合物减去所述Ρ0Ζ化合物上的活性官能团与靶分子 上的结合对象的反应过程中消除的任何离去基团；
[0062] ΤΜ为靶分子，所述靶分子含所述结合对象，并且所述靶分子选自药物、低聚核苷 酸、多肽、抗体、抗体片段和蛋白质；以及
[0063] Β为所述活性官能团与所述结合对象间形成的水解稳定的连接，该水解稳定的连 接不是酯键或者二硫键。
[0064]根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为三氟乙基磺酸酯，所述结合对象 为SH，以及Β为硫醚连接。
[0065]根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为马来酰亚胺，所述结合对象为SH， 以及Β为硫醚连接。
[0066]根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为活性碳酸盐，所述结合对象为 懸，以及Β为氨酯连接。
[0067] 根据本发明的一个实施方式，其中，所述活性官能团为活性酯，所述结合对象为 NH2,以及B为酰胺连接。
[0068] 根据本发明的一个实施方式，所述活性官能团为醛，所述结合对象为順2,以及B为 胺连接。
【附图说明】
[0069]图1示出了 2-烷基-2-噁唑啉(如2-乙基-2-噁唑啉)聚合的活性阳离子机制，其中-OTf为-〇S〇2-CF3或"三氟甲磺酸盐"，Nuc_为负的亲核试剂；
[0070]图2A和图2B示出了通过现有技术的方法制得的Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2000的凝胶渗透色谱； [0071 ]图3示出了聚噁唑啉衍生物(这里以2-乙基-2-噁唑啉示出）的聚合过程中链转移 的消除-二聚机制的机制；
[0072] 图4A和图4B示出了通过本发明的优化条件制得的M-TOOZ-OH 2000(图4A)和M-ΡΕ0Ζ-0Η 5000(图4B)的凝胶渗透色谱。
【具体实施方式】
[0073] 定义
[0074]本文中用到的术语"ΡΟΖ"、"Ρ0Ζ化合物"或"Ρ0Ζ聚合物"指含具有结构-[N(C0R7) CH2CH2]n-的重复单元的2-取代-2-噁唑啉聚合物，其中各个重复单元的R7独立地选自未取 代的或取代的烷基、烯基、芳烷基或杂环基烷基，η为3-1000;在一个实施方案中，所述未取 代的或取代的烷基、烯基、芳烷基或杂环基烷基包含1-10个碳原子，在一个更具体的实施方 案中，R?为甲基、乙基或正丙基。
[0075]本文中用到的术语"ΡΜ0Ζ"指含具有结构-[N(COCH3)CH2CH 2]n-的重复单元的Ρ0Ζ。
[0076] 本文中用到的术语"ΡΕ0Ζ"指含具有结构_[Ν(⑶CH2CH3)CH2CH 2]n-的重复单元的 P0Z〇
[0077] 本文中用到的术语Μ-Ρ0Ζ、Μ-ΡΜ0Ζ或Μ-ΡΕ0Ζ指其中引发端（ini tiating end)上的 氮与甲基结合的上述聚合物。
[0078]本文中用到的术语"Ρ0Ζ衍生物"或"聚噁唑啉衍生物"指包含Ρ0Ζ聚合物的结构，所 述Ρ0Ζ聚合物在Ρ0Ζ聚合物的末端上具有单个活性官能团，所述官能团能直接或间接地与靶 分子上的化学基团形成连接;在一个实施方案中，所述Ρ0Ζ衍生物为单官能Ρ0Ζ衍生物。
[0079] 本文中用到的术语"靶分子"指具有治疗、诊断应用或靶向功能的任何分子，其中 所述靶分子能与本公开的Ρ0Ζ聚合物或Ρ0Ζ衍生物上的活性官能团反应，包括但不限于治疗 部分(例如但不限于药物）、诊断部分、靶向部分、有机小分子、低聚核苷酸、多肽、抗体、抗体 片段和蛋白质。
[0080] 本文中用到的术语"水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物"指本公开的Ρ0Ζ衍生物与靶分 子的偶联物，以使Ρ0Ζ偶联物与靶分子间的所有化学连接均水解稳定。
[0081] 本文中用到的术语"水解稳定的"指在生理条件下的水溶液中稳定的连接;在一个 实施方案中，这样的连接将稳定至少12小时、24小时、48小时、96小时、192小时或更久;在一 个替选实施方案中，这样的连接无限期稳定。
[0082] 本文中用到的术语"水解不稳定的"指在生理条件下的水溶液中不稳定的连接。
[0083] 本文中用到的术语"生理条件"指pH为6-8、温度为30-42摄氏度的水溶液。
[0084] 本文中用到的术语"活性官能团"指与反应需要强催化剂、高温或不切实际的反应 条件的那些基团相比，易于与亲电或亲核基团反应或易于通过环加成反应来反应的那些基 团。
[0085]本文中关于本文中所述的Ρ0Ζ衍生物或其组分用到的术语"连接"、"被连接的"、 "连接"或"连接剂"指通常因化学反应而形成且通常为共价连接的基团或键。
[0086] 本文中关于羟基、胺基、巯基及其他反应性基团用到的术语"被保护的"指经本领 域技术人员熟知的保护基（如Protective Groups in Organic Synthesis，Greene，T.W·; Wuts，P.G.M. John Wiley&Sons，New York，N.Y.，（第三版，1999)中记载的那些）保护而避 免不希望的反应的这些官能团形式，所述保护基可用其中记载的程序添加或除去。被保护 的羟基的实例包括但不限于：甲硅烷基醚，如通过羟基与试剂(如但不限于叔丁基二甲基氯 硅烷、三甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷)的反应获得的那些;取代的甲基和乙 基醚，如但不限于甲氧基甲基醚、甲硫基甲基醚、苄氧基甲基醚、叔丁氧基甲基醚、2-甲氧基 乙氧基甲基醚、四氢吡喃醚、1-乙氧基乙基醚、烯丙基醚、苄基醚;酯，如但不限于苯甲酰甲 酸酯、甲酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。被保护的胺基的实例包括但不限于：酰 胺，如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯甲酰胺;酰亚胺，如邻苯二甲酰亚胺和二硫代琥珀酰 亚胺;等等。被保护的巯基的实例包括但不限于:硫醚，如S-苄基硫醚和S-4-吡啶甲基硫醚； 取代的S-甲基衍生物，如硫代半缩醛、二硫缩醛和氨基硫缩醛;等等。
[0087] 无论单独或作为取代基的一部分使用，本文中用到的术语"烷基"包括包含一到二 十个碳原子的直链烃基。因此该表述包括直链烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、 庚基、辛基、壬基、癸基、^^一烷基、十二烷基等。该表述也包括直链烷基的支链异构体，包括 但不限于作为实例给出的如下基团：-ch(ch 3)2、-ch(ch3)(ch2ch3)、-ch(ch 2ch3)2、-c (CH3) 3、-c (CH2CH3) 3、-CH2CH( CH3) 2、-CH2CH(CH3) (CH2CH3)、-CH2CH( CH2CH3) 2、-CH2C (CH3) 3、-CH2C(CH2CH3)3、_CH( CH3)CH(CH3) (CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3) (CH2CH3)、-CH2CH2CH (CH2CH3) 2、-CH2CH2C (CH3) 3、-CH2CH2C (CH2CH3) 3、_CH (CH3) CH2CH (CH3) 2、_CH (CH3) CH (CH3) CH(CH3) CH(CH3) 2、-CH(CH2CH3)CH(CH3) CH( CH3) (CH2CH3)等。该表述也包括环状烷基，如 环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，以及被如上所定义的直链和支链烷基所 取代的这类环。该表述也包括多环烷基，如但不限于金刚烷基冰片基和双环[2.2.2]辛基， 以及被如上所定义的直链和支链烷基所取代的这类环。
[0088] 无论单独或作为取代基的一部分使用，本文中用到的术语"烯基"包括在任何两个 相邻的碳原子间具有至少一个双键的烷基。
[0089] 无论单独或作为取代基的一部分使用，本文中用到的术语"炔基"包括在任何两个 相邻的碳原子间具有至少一个三键的烷基。
[0090] 本文中用到的术语"未取代的烷基"、"未取代的烯基"和"未取代的炔基"指不含杂 原子的烷基、烯基和炔基。
[0091] 表述"取代的烷基"、"取代的烯基"和"未取代的炔基"指如上所定义的烷基、烯基 和炔基，其中与碳或氢的一个或多个键被与非氢或非碳原子的键所代替，所述非氢或非碳 原子如但不限于基团如烷氧基和芳氧基中的氧原子;基团如烷基和芳基硫化物、讽基、横醜 基和亚讽基中的硫原子;基团如二烷基甲娃烷基、^烷基芳基甲娃烷基、烷基^芳基甲硅烷 基和三芳基甲硅烷基中的硅原子;和各种其他基团中的其他杂原子。
[0092] 本文中用到的术语"未取代的芳基"指环部分中具有6-12个碳原子的不含杂原子 的单环或双环芳族烃基，如但不限于苯基、萘基、蒽基、联苯基和二苯基。虽然表述"未取代 的芳基"包括含稠环的基团（如萘），但其不包括环成员中的一个上结合有其他基团（如烷基 或卤素基团）的芳基，因为如下所述，如甲苯基的芳基在本文中被视为取代的芳基。但未取 代的芳基可与母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子结合。
[0093] 本文中用到的术语"取代的芳基"相对于未取代的芳基具有与取代的烷基相对于 未取代的烷基相同的含义。但取代的芳基也包括其中一个芳族碳与一个非碳或非氢原子结 合的芳基，所述非碳或非氢原子如但不限于上面关于取代的烷基所描述的那些原子，而且 也包括其中芳基的一个或多个芳族碳与如本文中所定义的取代的和/或未取代的烷基、烯 基或炔基结合的芳基。这包括其中芳基的两个碳原子与烷基或烯基的两个原子结合而限定 稠环系（如二氢萘基或四氢萘基）的键合排列。因此，表述"取代的芳基"除了别的之外还包 括但不限于甲苯基和羟苯基。
[0094] 本文中用到的术语"未取代的芳烷基"指如上所定义的未取代的烷基或烯基，其中 未取代的或取代的烷基或烯基的氢或碳键被与如上所定义的取代的或未取代的芳基的键 所代替。例如，甲基(CH 3)为未取代的烷基。如果该甲基的氢原子被与苯基的键所代替，例如 如果该甲基的碳与苯的碳结合，则该化合物为未取代的芳烷基(即苄基）。
[0095] 本文中用到的术语"取代的芳烷基"相对于未取代的芳烷基具有与取代的芳基相 对于未取代的芳基相同的含义。但取代的芳烷基也包括其中基团的烷基部分的碳或氢键被 与非碳或非氢原子的键所代替的基团。
[0096] 本文中用到的术语"未取代的杂环基"指芳族和非芳族环化合物，包括单环、双环 和多环化合物，如但不限于含3个或更多个环成员的奎宁环基，这些环成员中的一个或多个 为杂原子，如但不限于N、0和S。虽然表述"未取代的杂环基"包括稠合杂环(如苯并咪唑基）， 但其不包括环成员中的一个上结合有其他基团（如烷基或卤素基团）的杂环基，因为如2-甲 基苯并咪唑基的化合物为如下面所定义的"取代的杂环基"。杂环基的实例包括但不限于： 含1-4个氮原子的不饱和3-8员环，如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、 二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基;含1-4个氮原子的饱和3-8员环，如但 不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基;含1-4个氮原子的稠合不饱和杂环基，如但不 限于吲哚基、异吲哚基、吲哚啉基、茚满基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三 挫基;含1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和3-8员环，如但不限于嚼唑基、异嚼唑基、嚼二 唑基;含1-2个氧原子和1-3个氮原子的饱和3-8员环，如但不限于吗啉基;含1-2个氧原子和 1-3个氮原子的不饱和稠合杂环基，如苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(如2H-1，4-苯并嚼嗪基等）；含1-3个硫原子和1-3个氮原子的不饱和3-8员环，如但不限于噻挫基、异噻 唑基、噻二唑基（如1，2,3_噻二唑基、1，2,4_噻二唑基、1，3,4_噻二唑基、1，2,5_噻二唑基 等）；含1-2个硫原子和1-3个氮原子的饱和3-8员环，如但不限于噻唑烷基;含1-2个硫原子 的饱和和不饱和3 - 8员环，如但不限于噻嗯基、二氢二硫杂环己二烯基 (dihydrodithiinyl)、二氢二亚硫酰、四氢噻吩、四氢噻喃;含1-2个硫原子和1-3个氮原子 的不饱和稠合杂环，如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(如2H-1，4-苯并噻 嗪基等）、二氢苯并噻嗪基(如2H-3,4-二氢苯并噻嗪基）；含氧原子的不饱和3-8员环，如但 不限于呋喃基;含1-2个氧原子的不饱和稠合杂环，如苯并间二氧杂环戊烯基(如1，3-苯并 间二氧杂环戊烯基等）；含氧原子和1-2个硫原子的不饱和3-8员环，如但不限于二氢氧硫杂 环己二烯基(dihydrooxathiinyl);含1-2个氧原子和1-2个硫原子的饱和3-8员环，如1,4-氧硫杂环己烷；含1-2个硫原子的不饱和稠环，如苯并噻嗯基、苯并二硫杂环己二烯基 (benzodithiinyl);以及含氧原子和1-2个氧原子的不饱和稠合杂环，如苯并氧硫杂环己二 烯基(benzoxathiinyl)。杂环基也包括上面描述的其中环中的一个或多个S原子与一个或 两个氧原子双键键合的那些（亚砜和砜）。例如，杂环基包括四氢噻吩、氧化四氢噻吩、和1， 1-二氧化四氢噻吩。优选的杂环基含5或6个环成员。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、 吡咯烷、咪唑、吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4_三唑、四唑、硫代吗啉、其中硫代吗啉的S原子与一 个或多个〇原子结合的硫代吗啉、吡咯、高哌嗪、噁唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、噁唑、奎宁环、 噻唑、异噁唑、呋喃和四氢呋喃。
[0097] 本文中用到的术语"取代的杂环基"相对于未取代的杂环基具有与取代的烷基相 对于未取代的烷基相同的含义。但取代的杂环基也包括其中一个碳与一个非碳或非氢原子 结合的杂环基，所述非碳或非氢原子如但不限于上面关于取代的烷基和取代的芳基所描述 的那些原子，而且取代的杂环基也包括其中杂环基的一个或多个碳与如本文中所定义的取 代的和/或未取代的烷基、烯基或芳基结合的杂环基。这包括其中杂环基的两个碳原子与烷 基、烯基或炔基的两个原子结合而限定稠环系的键合排列。实例除了别的以外还包括但不 限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶 基。
[0098] 本文中用到的术语"未取代的杂环基烷基"指如上所定义的未取代的烷基或烯基， 其中未取代的烷基或烯基的氢或碳键被与如上所定义的取代的或未取代的杂环基的键所 代替。例如，甲基(CH 3)为未取代的烷基。如果该甲基的氢原子被与杂环基的键所代替，例如 如果该甲基的碳与吡啶的碳2(与吡啶的N结合的碳中的一个)或吡啶的碳3或碳4结合，则该 化合物为未取代的杂环基烷基。
[0099] 本文中用到的术语"取代的杂环基烷基"相对于未取代的杂环基烷基具有与取代 的芳基相对于未取代的芳基相同的含义。但取代的杂环基烷基也包括其中非氢原子与杂环 基烷基的杂环基中的杂原子(如但不限于哌啶基烷基的哌啶环中的氮原子)结合的基团。
[0100] 总体描述
[0101] 聚噁唑啉(Ρ0Ζ)是自2-取代-2-噁唑啉单体制备的聚合物。这些聚合物是水溶性的 且据报道在哺乳动物模型系统中是无毒的。Ρ0Ζ通常通过适当化学计量的量的2-烷基-2-噁 唑啉与亲电引发剂(如对甲苯磺酸甲酯(或"甲苯磺酸酯"，ch 3-os〇2-c6h4-ch3 )或三氟甲磺酸 甲酯(CH3-0S02-CF3))反应、然后用亲核试剂(如氢氧化物或胺)终止制备。所产生的聚合物 便于以简写形式描述为引发基团由最左侧的基团表示、终止基团由最右侧的基团表示、2-烷基-2-噁唑啉组分在中间。因此，当本说明书中使用这种简写描述时，除非另有指出，否则 名称的左侧将代表"引发剂端"，而名称的右侧将代表"末端"。
[0102] 例如，当2-取代-2-噁唑啉为2-甲基-2-噁唑啉、甲苯磺酸甲酯被用作引发剂、氢氧 化物被用作终止剂时，将产生如下聚合物：
[0103] CH3- [ N (COCHs) CH2CH2 ] n-〇H
[0104] 上面的聚合物便于以简写符号描述为Μ-ΡΜ0Ζ-0Η，其中甲基引发剂由最左侧的Μ (在引发剂端处)表示，PMOZ代表聚甲基噁唑啉，其中重复单元的甲基由PMOZ的Μ表示，终止 羟基由-0Η(在末端处)表示。聚合度η可在约3到约1000范围内。
[0105]另一常用的单体为2-乙基-噁唑啉，该单体由三氟甲磺酸甲酯引发、由氢氧化物终 止时将提供如下Ρ0Ζ聚合物：
[0106] CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-〇H
[0107] 上面的聚合物便于以简写符号描述为Μ-ΡΕ0Ζ-0Η，其中甲基引发剂由最左侧的Μ (在引发剂端处)表示，ΡΕ0Ζ代表聚甲基噁唑啉，其中重复单元的乙基由ΡΕ0Ζ的Ε表示，终止 羟基由-0Η(在末端处)表示。
[0108] 可使用更复杂的亲电试剂和亲核试剂。例如，用苄基溴引发2-乙基-2-噁唑啉聚合 并用过量的乙二胺终止产生如下聚合物：
[0109] C6H5-CH2- [ N( COCH2CH3) CH2CH2 ] n-NH-CH2CH2-NH2
[0110] 此外，在相同的聚合物中可使用不同的单体来产生各种无规和嵌段共聚物。
[0111]该聚合工艺被称为活性阳离子聚合，因为用亲电试剂进行的引发产生噁唑啉盐 (oxazolinium)阳离子，该P,惡挫啉盐阳离子然后以链反应与其他单体单元反应产生增长的 "活性，，阳离子。
[0113] 通过假定活性阳离子可由下面的非环形式表示，可以预测终止的产物，虽然事实 上环状形式无疑是最重要的，且所需的产物通过亲核攻击环的5-位产生：
[0114] CH3- [ N (COCH3) CH2CH2 ] n-N (COCH3) CH2CH2+
[0115] 本公开中以Μ-ΡΜ0Ζ+代表该阳离子。如上面所提到的，该ΡΟΖ阳离子可通过与亲核 试剂(如氢氧化物或胺)反应而"被终止"。有趣的是，用弱亲核试剂水进行的终止不产生所 需的5-位攻击产物（"热力学"产物），而是产生2-位攻击（"动力学"产物）。该动力学产物不 稳定且可能重排得到酯产物或变回阳离子（0 . Nuyken，G . Maier，A . Gross， Macromol·Chem.Phys·197,83-85(1996))。
[0116] 羟基终止的聚合物可经进一步改性得到所需的衍生物。例如，Zalipsky使端-OH与 戊二酸酐反应得到由戊二酸酯基团终止的P〇Z(M.C.Woodle，C.M.Engbers and S.Zalipsky,Bioconjugate Chem.,1994,5,493-496)〇
[0117] M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2H
[0118] 上面的聚合物被活化为琥珀酰亚胺基酯、与磷脂偶联并用来制备Ρ0Ζ-修饰脂质 体。已发现这些脂质体与PEG-修饰脂质体具有相似的性质。
[0119] 胺终止的聚合物也具有可用于进一步衍生化的反应性基团。例如，用甲胺终止得 到由活性基团-NHCH3终止的Ρ0Ζ。也可用环状二胺哌嗪终止。
[0120]噁唑啉聚合也可用功能性亲核试剂引发。例如，亲电引发剂3-溴丙酸乙酯已被用 来引发2-乙基-2-噁唑啉聚合。用氢氧化物终止得到如下聚合物：
[0121] HO2C-CH2CH2- [ N( COCH2CH3) CH2CH2 ] n-〇H
[0122] 值得一提的是，在引发剂端和末端上具有相同官能团的ΡΟΖ在化学上是不同的，因 为在引发剂端处的基团与氮相连，而在末端处的基团与碳相连。例如，下面的两种聚合物均 是ΡΜ0Ζ的丙酸衍生物，但不同在于引发剂端的丙酸与氮相连，而末端的丙酸与碳相连(为清 楚起见示出了开始或结束单体单元）：
[0123] HOOCCH2CH2-N( COCHs) CH2CH2-PMOZ-OH
[0124] M-PM0Z-N( COCH3) CH2CH2-O-CH2CH2COOH
[0125] 但制备含活性官能团的聚噁唑啉的另一途径是使单体(如2-乙基-2-噁唑啉)与在 2_位上有活性官能团的噁唑啉单体共聚。例如，Jordan和其同事已制备了 2-位上有乙炔和 被保护的酸、駿酸和胺的噁唑啉（F· C·Gaertner，R·Luxenhofer，B·Blechert，R· Jordan and M.Essler，J· Controlled Release，2007，119，291-300)。这些功能性单体与2-乙基-2-噁唑 啉的共聚产生含多个悬挂或侧链活性官能团的无规共聚物。例如，用三氟甲磺酸甲酯引发 2-乙基-2-噁唑啉和2-戊炔基-2-噁唑啉的聚合，并随后用哌嗪(NHC4H 8NH)终止产生如下无 规共聚物：
[01 26] CH3-{ [N(COCH2CH3)CH2CH2]η-[N(COCH2CH2CH2-CCH)CH2CH2]m}ran-NC4H 8NH
[0127] 下标"ran"表示该聚合物为无规共聚物。n的值通常为约20-30而m为约2-5。
[0128] 为使Ρ0Ζ与靶分子(如但不限于多肽)偶联，有必要通过在聚合物的至少一个末端 连上能与靶分子上的基团形成连接的活性官能团来"活化"该聚合物。关于活化Ρ0Ζ以与靶 分子偶联所做的工作尚很少。活性基团可加在引发剂（左)端处或末(右)端处或两端处。例 如，当靶分子为多肽时，多肽表面上有许多可与Ρ0Ζ上的活性官能团反应的氨基，在唯一出 版了的连接Ρ0Ζ与蛋白质的实例中，Myamoto和其同事将下面的Ρ0Ζ与过氧化氢酶的氨基相 连（Μ.Myamoto，T.Saegusa，et al·，Macromolecules，1990，23，3201-3205):
[0129] M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2-NHS
[0130] 在这种情况下，使Μ-ΡΜ0Ζ-0Η与戊二酸酐反应，所得羧酸经N-羟基琥珀酰亚胺（由 NHS表示)活化。NHS活性酯是常用的羧酸活性形式。在本实例中，Ρ0Ζ-过氧化氢酶偶联物经 证实是活性的。
[0131]现有技术已描述了三种能与靶分子偶联的末端活化的Ρ0Ζ化合物。但各个前述Ρ0Ζ 衍生物均受到限制。Zalipsky描述了活化的丙酸ΡΟΖ化合物NHS-00CCH2CH2-PE0Z-OH，其中活 化基团与分子的引发剂端相连（S · Zal ipsky，C · B · Hansen，J ·Μ· Oaks and T ·Μ· Al len， J.Pharm.Sci.，85,133-137(1996))。该ΡΟΖ化合物通过用含活化基团的部分引发聚合来制 备。但Jordan、Hoogenboom等已说明用不同的活化基团引发聚合可能需要很不同的反应条 件，从而需要广泛的研究来确定最佳反应条件。因此，如果选择引发剂法来制备活化的Ρ0Ζ 化合物，则必须进行探索性工作来为每种新化合物确定适宜的反应条件。此外，上面的化合 物是双官能的，因为其由羟基而非惰性基团（如烷基)所终止。另外，如下面所讨论的，用卤 代烷引发的聚合不经由活性阳离子机制进行并因此发现多分散性高。
[0132] Myamoto和Zalipsky已制备了 NHS-活化的戊二酸酯衍生物。该衍生物自含0Η基团 作为末端活化基团的单官能Ρ0Ζ聚合物(Μ-ΡΜ0Ζ-0Η)制备。但戊二酸酯和琥珀酸酯衍生物具 有连接靶分子与Ρ0Ζ化合物的水解不稳定的酯连接。例如，NHS-活化的戊二酸酯衍生物将如 所示与靶分子(这里以蛋白质示意)反应：
[0133] M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CO2-NHS+PROTEIN-NH24
[0134] 4M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
[0135] 由于水解不稳定的酯连接，故所产生的靶分子-ΡΟΖ偶联物在生理条件下的生物体 系(如人或其他哺乳动物）中将不稳定，而将水解而使Ρ0Ζ与蛋白质分裂：
[0136] M-PMOZ-O2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN4
[0137] 4M-PMOZ-OH+HO2C-CH2CH2CH2-CONH-PROTEIN
[0138] 此外，在上面的图式中，当靶分子-Ρ0Ζ偶联物因不稳定的酯连接的分裂而水解时， 所得靶分子将含"标签"或"半抗原"，其可导致靶分子的免疫原性。
[0139] 最后，已制备出了邻二硫吡啶（0PSS)衍生物（G.Hsiue，et al ·，Bioconjugate Chem.，2006，17，781-786)。理论上该衍生物可与蛋白质硫醇基团偶联产生二硫化物连接， 虽然Hsiue未进行此工作，但众所周知二硫化物是不稳定的而容易在血浆中还原。
[0140] 阻碍已知的Ρ0Ζ聚合物用于修饰靶分子的另一问题在于一些Ρ0Ζ聚合物不具有单 个活性官能团；即它们不是"单官能的"。如果要设法避免交联和/或在聚合物主链上与多个 靶分子结合，则单官能性是必要的。例如，Jordan和其同事已发表著作示出了 2-乙基-2-噁 唑啉与含官能团的噁唑啉单体的共聚。这些悬挂官能团有时能与肽偶联。但该技术未设计 为提供单官能Ρ0Ζ聚合物，而是产生含沿主链的悬挂基团的多官能化合物。在Ρ0Ζ主链中存 在多个官能团有时可能是有利的，但在与多官能靶分子(如但不限于多肽和蛋白质)偶联时 会导致交联和团聚体形成。此外存在希望单个靶分子与聚合物偶联的情况，而多官能Ρ0Ζ聚 合物不允许这样做。
[0141] 上述官能Ρ0Ζ化合物中的一些具有与靶分子（如蛋白质和小分子药物）偶联的潜 能。但如对聚乙二醇修饰疗法进行的工作已表明的，聚合物修饰药物的商业开发通常需要 采用分子量(MW)高达40,000Da或以上以及分子量分布或多分散性(PD)低于1.1的聚合物。 大量的工作已表明用常规技术的Ρ0Ζ不能获得在上述范围内的MW和ro。通常见到的是，随着 增长的Ρ0Ζ链的分子量达到大约5，000Da，多分散性也略微增高。副反应(包括链转移)开始 大量发生。非常低的聚合温度与数周的反应时间的结合使用已表明可产生可接受的PD，但 这样的条件对于工业规模的制备来说是不现实的（J.s.Park and K.Kataoka, Macromolecules ,39,6622(2006)) aHoogenboom、Schubert及其同事指出，低-PD ΡΟΖ可通过 使用微波照射制备，但用这种技术同样不能得到工业规模的聚合（R. M. Paulus， T.Erdmenger,C.R.Becer,R.Hoogenboom and U.S.Schubert,Macromo1.Rapid Comm.,28, 484-491(2007))。由于通常发现多分散性宽，故迄今所述的官能Ρ0Ζ化合物在聚合物疗法中 的使用严重受限。
[0142] 阻碍Ρ0Ζ衍生物用于修饰靶分子的又一问题在于不能得到一系列能在一系列条件 下与靶分子反应的适宜的活化的Ρ0Ζ分子。此外，目前可得到的Ρ0Ζ分子是多官能的或当与 靶分子偶联时含水解不稳定的键，而具有与之相关的缺点，或活性取代基在引发反应过程 中加入，而具有与之相关的缺点。此外已描述了悬挂官能性，但这些衍生物是多官能的而不 适合本应用。
[0143] 本公开提供了具有一系列活性基团的单官能Ρ0Ζ衍生物，所述活性基团可使所述 单官能Ρ0Ζ衍生物与广泛的靶分子在广泛的反应条件下偶联以产生水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ 偶联物，其中，一个靶分子与ΡΟΖ衍生物结合。提供具有一系列能在不同的反应条件下与靶 分子上的选定基团反应的活性基团的单官能ΡΟΖ衍生物的能力提供了优于现有技术的I著 优势，因为不同的靶分子对不同的反应条件敏感且对于ΡΟΖ衍生物与靶分子的偶联来说最 有效的反应条件常随靶分子的性质及靶分子上与ΡΟΖ衍生物反应的基团而异。
[0144] 本公开通过提供一系列本领域中先前未知的Ρ0Ζ衍生物解决了前述Ρ0Ζ聚合物的 局限。另外，本公开提供了本领域中先前未知的单官能ΡΟΖ衍生物。此外，本公开提供了在其 末端上有活性官能团的单官能Ρ0Ζ衍生物。此外，本公开通过提供所公开的Ρ0Ζ衍生物的合 成方法解决了现有技术的局限，所述合成方法利用含易于得到且可用熟知的制备化学获得 的终止剂端基（如但不限于羟基）的Ρ0Ζ分子。然后可通过以逐步方式偶联小的活性分子与 可利用的端基而在Ρ0Ζ衍生物（如本文中所述)上生成所需的活性官能团来制得广泛的Ρ0Ζ 衍生物。此外，本公开通过使用所述的单官能ΡΟΖ衍生物提供水解稳定的靶分子-ΡΟΖ偶联物 而解决了现有技术的局限。这样的方法不仅提供了其中不超过一个靶分子与每种ΡΟΖ衍生 物结合的靶分子-Ρ0Ζ偶联物，而且提高了靶分子-Ρ0Ζ偶联物的体内半衰期并减少了与靶分 子的"半抗原标记"有关的免疫原性问题。所公开的单官能ΡΟΖ衍生物、合成方法和所得水解 稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物在现有技术中尚未认识到。
[0145] 因此，所述的单官能Ρ0Ζ衍生物和合成方法避免了现有技术中固有的问题并提供 了产生其中一个靶分子与Ρ0Ζ衍生物结合的水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物的机制。
[0146] 如下面更详细地讨论的，任何2-取代-2-噁唑啉化合物（如但不限于ΡΜ0Ζ和ΡΕ0Ζ) 均可用来产生本公开的Ρ0Ζ衍生物。在某些实施方案中，ΡΕ0Ζ或ΡΜ0Ζ为2-取代-2-噁唑啉Ρ0Ζ 分子。如本领域中熟知的，2-烷基-2-噁唑啉分子中不同的烷基可为本文中所述的ΡΟΖ衍生 物提供不同的溶解性、药代动力学和膜渗透能力。此外，Ρ0Ζ聚合物主链中重复单元的性质 可相同以产生均聚物（如但不限于ΡΜ0Ζ和ΡΕ0Ζ)或至少一个重复单元可不同以提供共聚物 (如但不限于无规或嵌段共聚物）。
[0147] 此外，本公开提供了合成具有低多分散性(PD)值且由不希望的副反应(如但不限 于链转移)所产生的杂质的量减少的Ρ0Ζ聚合物的新方法。在一个实施方案中，本公开描述 了最大限度减少不希望的副反应(如但不限于链转移）的新方法，从而使纯度提高的Ρ0Ζ聚 合物产物的ro值低。在一个实施方案中，本公开的方法提供了在提高的MW值下具有低PD值 的Ρ0Ζ衍生物。在另一实施方案中，产生的Ρ0Ζ聚合物的杂质量减少。本公开中提供的新方法 是对现有技术方法的改进并提供了适用于修饰广泛的靶分子的ΡΟΖ聚合物的大规模工业制 备。
[0148] 因此，本公开也提供了纯度提高且ro值低的适用于药物应用中的Ρ0Ζ聚合物。如本 领域中熟知的，ro值将随MW而变;一般来说，随着分子量增大，PD值也增大。使用本公开的方 法可以工业规模生产各种MW的Ρ0Ζ聚合物，所述Ρ0Ζ聚合物在给定MW下的ro值比用现有技术 的工业适用方法可产生的低。例如，使用本公开的方法可产生MW为20，000Da或以下、ro值低 于或等于1.1的Ρ0Ζ衍生物。在另一特别的实施方案中，产生的前述Ρ0Ζ衍生物的杂质量减 少。如本领域中熟知并在本文中的实施例中示出的，使用现有技术的方法合成的Ρ0Ζ衍生物 含有某些杂质，这些杂质在GPC图中表现为高MW肩和低MW尾。这些杂质至少部分是通过不希 望的副反应(如但不限于链转移)生成的。因此，所公开的Ρ0Ζ衍生物适用于修饰广泛的靶分 子。
[0149] 通过使用本文中所述的方法，可得到一系列具有不同的活性官能团的单官能Ρ0Ζ 衍生物。此外，本公开提供了以高效方式产生这类单官能ΡΟΖ衍生物的合成方法。最后，通过 使用所述的单官能ΡΟΖ衍生物，可产生其中一个靶分子与ΡΟΖ衍生物结合的水解稳定的靶分 子-ΡΟΖ偶联物。
[0150] 合成低PD值Ρ0Ζ衍生物的方法
[0151 ] 聚合2-芳基-和2-烷基-2-噁唑啉的现有技术源于Kobayshi、Nuyken和Jordan的出 版物（S.Kobayashi，E .Masuda，S · Shoda and Y. Shimano，Macromolecules，1989，22，2878-2884;A.Gross，G.Maier and 0·Nuyken，Macromol·Chem.Phys·，1996，197，2811-2826;和 F.C.Gaertner,R.Luxenhofer,B-Blechert,R.Jordan and M.Essler,J.Controlled Re 1 ease，2007，119，291-300)。在这些方法中，聚合由亲电试剂（如对甲苯磺酸烷基酯或三 氟甲磺酸烷基酯）引发;在一个实施方案中，使用甲苯磺酸甲酯或三氟甲磺酸甲酯。使用这 些强亲电试剂是为了通过活性阳离子机制促进聚合，因为理论上该机制不会产生终止或链 转移反应（Q.Liu,M.Konas and J.S.Riffle,Macromolecules,1993,26,5572-5576)(参见 图1)。但从现有技术已知，链转移反应确实发生且该反应不严格按活性阳离子机制进行。如 果使用弱亲电试剂(如但不限于卤代烷），则反应会按共价机制进行，结果ro显著增大。现有 技术聚合方法使用氯苯、二氯苯或乙腈作为溶剂。增长阶段在约80°C下进行约1-3天。终止 通过对碳酸钠水溶液于80-90 °C下加热进行而产生羟基端基或通过与仲胺(如吗啉或哌啶） 反应而得到末端的叔胺。
[0152] 这些典型的现有技术方法的使用导致凝胶渗透色谱中约5-10%的高-MW肩及显著 的低-MW尾的存在。本领域中已注意到这样的结果（参见J.Park and K.Kataoka, Macromolecules ,2006,39,6622-6630)。文献中常见提到，这种MW分布的变宽是由于通过消 除-二聚机制进行的链转移，虽然该过程的结构细节和实验支持是有限的(M.Litt，A. Levy and J · Herz，J · Macromol. Sci ·-Chem ·，1975，A9，703-727)。到链转移反应确实发生的程度， 这样的反应不能被认为是真正的活性聚合。因此，减少不希望的副反应(如链转移）的发生 是有利的。
[0153] 本
【申请人】已弄清了消除-二聚机制的细节、为该机制提供了实验支持并提出了关 于终止步骤的机制的推论。这一新近进展特别重要，因为其揭示了为何某些终止反应会失 败而使我们选择成功的终止反应。这样的发现在本领域中尚未见述及且其为创建最大限度 地减少不希望的副反应的发生并产生所需的终止产物的合成方法提供了指导。
[0154]如本文中所讨论的，使用现有技术方法产生的Ρ0Ζ产物中含占 Ρ0Ζ产物总质量的约 5-10%的高MW肩。该高MW肩导致用现有技术合成方法获得的PD值不可接受。现有技术方法 中观察到的高MW肩至少部分由聚合和/或终止步骤过程中形成的高-MW二聚体组成(参见图 3)。消除-二聚机制预计，如果链转移在终止步骤过程中发生，则高MW肩中的物质将约是所 需产物的MW的两倍。此外，如果链转移在增长步骤过程中发生，则将引发新的聚合物链，且 由于此时单体浓度较低，故该聚合物的MW将低于聚合物本体的MW。此外，由于该新的聚合物 链由链转移得到，故其必须由质子而不是甲基引发，因此该聚合物的MALDI谱将呈现出一组 比主峰的低14Da的峰。
[0155]关于终止步骤也有迄今尚未认识到的推论。例如，为强碱和弱亲核试剂的终止亲 核试剂的加入预计将导致显著的消除和二聚。此外，噁唑啉盐阳离子是离域的或"软"亲电 试剂，且理论预测"软"或弥散的亲核试剂会更可能用作终止亲核试剂而非用作碱。举例来 说，可以预期"软"硫醇盐是比"硬"醇盐更有效的终止剂。
[0156] 上面的预测得到了实验的确认。在一个实施例中，加入了空间受阻的乙基二异丙 基胺(强碱和弱亲核试剂)来终止2-乙基-2-噁唑啉聚合。该反应导致高MW二聚体产物增多 至75% (参见实施例3)。经确认，GPC中杂质峰的丽约为所需产物的丽的两倍。此外，MALDI-T0F谱确认，部分主峰具有比预期的小14质量单位的第二组峰。我们已观察到，该第二组峰 的MW稍小于所需产物的MW的两倍。这大概因为在聚合物完全形成而单体被耗尽之前、在增 长阶段过程中发生了某链转移而发生;在这种情况下，所述碱必定是单体，因为其是增长过 程中存在的最强的碱。
[0157] 此外，由已知为硬亲核试剂的醇盐进行终止导致大量的高MW二聚体而没有源自所 需亲核攻击的产物(参见实施例5)。此外，由已知为软亲核试剂的硫醇盐进行终止确实如预 测的那样导致了所需的亲核攻击产物(参见实施例11)。
[0158] 基于前述观察，本
【申请人】已开发出了新的合成方法，所述新的合成方法减少了不 希望的副反应(如链转移），并可制备出比现有技术具有更优异的性质的Ρ0Ζ聚合物和衍生 物。所述改进的方法可用到如下改进中的一个或多个。
[0159] 在一个实施方案中，Ρ0Ζ聚合反应由强亲电试剂(如但不限于对甲苯磺酸烷基酯或 三氟甲磺酸烷基酯）引发;在一个实施方案中，使用甲苯磺酸甲酯或三氟甲磺酸甲酯。
[0160] 消除-二聚机制也表明，增长和终止应在低温下进行，因为高温有助于双分子消 除。实施例通过示出降低增长和终止的温度会减少高MW二聚体的形成来确认了此言论。此 预测也已得到了Kataoka的确认（参见J. Park and K.Kataoka，Macromolecules，2006，39， 6622-6630)。但如果降低温度至足以消除所有链转移，则可能要花数周来达到反应的完成， 因此这样的反应在工业上是不可行的。本公开下面描述的方法是工业上可行的。我们已观 察到，在增长完成或接近完成后继续加热将引起消除-二聚的产生。本公开已惊人地发现， 通过比现有技术方法中早得多地且在更低温度下终止聚合，Ρ0Ζ衍生物的质量大大改进。此 外，增长反应的持续时间为单体完全或基本完全(高于或等于90%)消耗所需的最短时间。 应指出，增长反应的温度和持续时间是相互关联的。换句话说，可使用较高的增长温度和较 短的增长反应时间。相反，如果使用较长的增长反应时间，则应相应降低温度。
[0161]也已发现，溶剂(如但不限于氯苯）的使用比对于Ρ0Ζ产物的工业大规模制备来说 关键性的常用乙腈溶剂提供更快的聚合。虽然现有技术已认识到以氯苯作溶剂，但尚未认 识到对反应速率的改进。使用氯苯作溶剂提供更快的反应时间这一出乎意料的结果使聚合 反应可较早地在较高温度下终止，而不增加高MW二聚体产物的形成。这样的改进是本领域 中未认识到的。
[0162]此外，Ρ0Ζ产物、特别是用0Η基团终止的那些，通过阳离子交换树脂的过滤改善PD 值。据认为这样的过滤将除去低-MW和高-MW产物。对于较高分子量的Ρ0Ζ产物（例如10， 000Da及以上的那些产物），过滤的效果尤其显著；但过滤为Ρ0Ζ衍生物提供的好处与MW无 关。给出该改进的一个实例，未经过滤的Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 10，000 (通过本公开的方法制备）显示 出Μη为7950Da、PD为1.21 (GPC)，具有显著的低-MW尾。该产物通过羧乙基-琼脂糖凝胶过滤 后得到的Μη为9180Da、PD为1.05(根据GPC)，以及Μη为9780、PD为1.01 (根据MALDI)，且没有 可观察到的低-MW尾，而有微不足道的2 %的高-MW肩(根据GPC测定）。粗产物未呈现出高-MW 肩的事实表明，阳离子交换过滤既除去了低-MW杂质也除去了高-MW杂质。
[0163] 此外，在某些情况下，如果ΡΟΖ产物包含羧酸作为端基，则可使用阴离子交换色谱 来分离所需的产物和除去所形成的任何高分子量产物。我们已对M-PE0Z_S-CH 2CH2-C02!tii 行了该实验。值得一提的是，该色谱实验表明高-MW二聚体是中性的。因此，主要的二聚产物 必定为图3的链烯。在该实验中，粗产物的Μη为9600Da，H)为1.09(GPC)，并有6%的高-MW肩。 在DEAE-琼脂糖凝胶上的阴离子交换色谱后，Μη为9500Da，ro为1.06(GPC)，且无高-MW肩。
[0164] 在另一实施方案中，终止反应在低温(在一个实施方案中，低于80°C ;在一个可替 选的实施方案中，15-40Γ)下用比作为碱更好的亲核试剂的亲核试剂进行;示例性的亲核 试剂包括但不限于软亲核试剂，如硫醇盐。本
【申请人】已发现，醇钠化合物作为终止剂的使用 不产生所需的产物；而是保留未终止的阳离子。但硫醇钠和相关化合物（如但不限于NaS-CH 2CH2-C02Et)的使用产生高效的终止并得到具有所需性质（如但不限于低PD值）的ΡΟΖ产 物。阴离子交换色谱后，该酯水解成为羧酸而产生具有低PD值和无高-MW肩的高质量Ρ0Ζ产 物。在一个这样的实例中，M-PEOZ-S-CH2CH2-CO2H的Μη为9600Da、ro为1.09(GPC)并有6%的 肩。在DEAE-琼脂糖凝胶上的阴离子交换色谱得到Μη为9500、Η)为1.06(GPC)、且无肩。
[0165] 合成中的这些新的改进被用在本文中所述Ρ0Ζ聚合物和衍生物的制备中。本领域 普通技术人员能够明白，合成中的这些改进可以各种组合使用；前述内容不应理解为需要 在给定的合成中使用各个所述改进。
[0166] 使用两种现有技术方法合成Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2000。这些Ρ0Ζ衍生物的合成的描述在实 施例1 (对于图2Α)和实施例2(对于图2Β)中给出。分析所产生的Ρ0Ζ衍生物。对于图2Α的Ρ0Ζ 衍生物，GPC呈现出具有可感知的高-MW肩（Mn = 3600 Da ,9%)的单个峰。主峰的Μη为 1980Da，H)为1.08。匪1?呈现出预期的峰(参见实施例6KMALDI-T0F MS呈现出一组最大值在 2000Da、PD 1.04和分离99.1Da的峰。MALDI谱也呈现出具有分离99.1Da的第二组峰，但各峰 比主要的那组低14Da。这组峰的最大值发生在1600Da。对于图2B的Ρ0Ζ衍生物，GPC呈现出具 有可感知的高-MW肩(Mn = 3300Da，6 % )的单个峰。主峰的Μη为2200Da，PD为1.06。匪1?呈现出 预期的峰（参见实施例6KMALDI-T0F MS呈现出一组最大值在2300Da和分离99.1Da的峰。 MALDI谱也呈现出具有分离99.1Da的第二组峰，但各峰比主要的那组低14Da。这组峰的最大 值发生在2100Da。
[0167] 使用本公开的方法合成用于比较的两种ΡΟΖ衍生物Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2000(图4A)和M-ΡΕ0Ζ-0Η 5000(图4B)。这些Ρ0Ζ衍生物的合成的描述在实施例6(对于图3A)和实施例7(对于 图4Β)中给出。图4Α和图4Β中给出了GPC色谱。图4Α和图4Β示出了用本公开的合成方法获得 的Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2000和5000的有很大改进的GPC。对于Μ-ΡΕ0Ζ 2000,反应条件为：（a)三氟甲 磺酸甲酯引发，在氯苯中于ll〇°C增长1.5小时，以及在室温下用碳酸盐水溶液终止。观察到 Μ-ΡΕ0Ζ 2000衍生物的Μη为 1900Da (根据MALDI 和GPC)、PD为 1 · 07 (GPC)和 1 · 03 (MALDI)、且无 高-MW肩也无低-MW尾。对于Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 5000，反应条件为：（a)三氟甲磺酸甲酯引发，在氯苯 中于42°C增长1小时，然后于80°C增长3.75小时，以及在室温下用碳酸盐水溶液终止。观察 到Μ-ΡΕ0Ζ 5000衍生物的Μη为4900Da(根据MALDI)、PD为 1.06 (GPC)和 1.02 (MALDI)、有非常 轻微的高-MW肩（1 % )、无低-MW尾。在类似条件下制得的Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 10，000的Μη为9780Da (MALDI)、PD为1.01(獻0)1)和1.05(6?〇，有2%的非常轻微的高-丽肩。
[0168] 总之，本公开的
【申请人】已弄清了当使用现有技术的合成方法时发生的不希望的副 反应的性质，从而使本
【申请人】确定最大限度地减少这类副反应的影响的反应条件。因此，本 公开的方法可制备出比现有技术中可得到的那些具有更优异的性质的ΡΟΖ聚合物和衍生 物。在一个实施方案中，本公开的方法可制备出具有低ro值的ροζ聚合物和衍生物;在一个 特别的实施方案中，本公开的方法可制备出在高丽值下具有低ro值的ροζ聚合物和衍生物。 此外，本公开的方法可以适于大规模生产的方式生产前述ροζ聚合物和衍生物。具有这类特 征的这类ροζ聚合物和衍生物及其生产方法是本领域中缺乏的。
[0169]在一个实施方案中，本公开的方法通过提供完全或部分地减少Ρ0Ζ合成的引发、聚 合或终止过程中发生的一种或多种副反应而在Ρ0Ζ聚合物合成中提供这样的好处。在一个 特别的实施方案中，所述副反应为链转移过程。这类不希望的副反应(如但不限于链转移过 程)是制备Ρ0Ζ产物的现有技术程序中存在的问题。这样的副反应使Ρ0Ζ衍生物具有不希望 的特征，如高ro值。
[0170] 合成单官能ροζ衍生物的方法
[0171] 本公开提供了合成所述单官能Ρ0Ζ衍生物的新方法。该新的合成方法在本文中通 常称为构建单元法(building block method)。在构建单元法的一个实施方案中公开了一 步合成法。在构建单元法的一个可替选的实施方案中公开了两步法。在构建单元法的另一 可替选的实施方案中描述了活性聚合物合成。每种方法均将在下面更详细地描述。
[0172] 构建单元一步法
[0173] 在构建单元法的第一个实施方案中公开了一步法。在一步法中，通过单个末端官 能化的Ρ0Ζ分子与含所需活性基团的一组化合物间的反应在单个步骤中生成一系列单官能 Ρ0Ζ衍生物。这样，单个末端官能化的Ρ0Ζ分子可被转化为一系列活化的单官能Ρ0Ζ衍生物。 该方法意味着仅需要优化制备单个单官能Ρ0Ζ衍生物的聚合化学。Ρ0Ζ端基（下面的Υ)经仔 细选取以使这一系列反应可提供一系列活性基团。所述一步法的一般形式可由如下图式1 代表：
[0174] Ri-P0Z-Y^Ri-P0Z-Pp-Qq-X I
[0175] 图式 1
[0176] 其中，
[0177] Ρ0Ζ 为-[N(C0R7)CH2CH2]n-;
[0178] 各重复单元的R7独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，在一个实施 方案中含1-12个碳；
[0179] 办为氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合；
[0180] 1?2-1?4、1?11和1?14-1? 15各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集 合，在一个实施方案中含1-10个碳；
[0181] R8 为-C6H1()-CH2-(环己亚甲基）；
[0182] R23为未取代的或取代的烷基、烯基、炔基或芳烷基集合(在一个实施方案中含1-10 个碳原子）、或为取代的或未取代的芳基；
[0183] Y为-(^、^-((^^-(^^、哌嗪基~取代哌嗪基~取代哌啶基~或-順!^
[0184] P为连接基团；P可为任何能形成图式1中所示的连接的基团并可根据与其形成连 接的基团的化学性质来选择;代表性的P基团包括但不限于-〇-、-3-、_册1-、-~1? 11-、或未取代 的杂环基(如但不限于哌嗪基(NC4H8N));
[0185] Q为连接基团；Q可为任何能形成图式1中所示的连接的基团并可根据与其形成连 接的基团的化学性质来选择;代表性的Q基团包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、 杂环基或芳基、-(CH2 ) m_CONH- ( CH2 ) m_、_NH- ( CH2 ) m_NHC〇- ( CH2 ) m、_C〇- ( CH2 ) m_、_C〇-C6H4_、 或-C0 -R8、_(Rl5)m_ 或 _(CR3R4)m;
[0186] n 为 3-1000 的整数；
[0187] k和m为独立地选自1-10的整数；
[0188] p和q为独立地选自0或1的整数；
[0189] X为能与靶分子形成连接而产生水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物的活性官能团。
[0190] 在一个实施方案中，所述活性官能团选自如下大类的化合物:醛(-CH0)、活性碳酸 盐(-0-C0-Z)、马来酰亚胺、磺酸酯(-0S0 2-R23)(包括但不限于三氟乙基磺酸酯(2,2,2_三氟 乙基磺酸酯）和甲磺酸酯(-0-S0 2-CH3或-OMs))、酰肼(-⑶NHNH2)、环氧化物、碘乙酰胺、炔、 叠氮化物(-N3)、异氰酸盐(-0CN)、氰酸盐(-NC0)、异硫氰酸盐(-SCN)、硫氰酸盐(-NCS)、腈 (-CN)、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰齒、活性酯(-C0-Z)和羧酸(-C0 2-H);以及
[0191] Z为活化基团，本领域内熟知的活性基团有很多，包括N-琥珀酰亚胺氧基、氯、溴、 磺基-N-琥珀酰亚胺氧基、对硝基苯氧基、1-咪唑基和1-苯并三唑氧基；
[0192] 活性官能团也可通过本领域中熟知的方法保护起来而产生被保护的活性官能团。 例如，缩醛[CH(0R14) 2]为示例性的保护基，其可水解产生醛基。活性官能团可被基团（如但 限于关于取代的烷基及取代的和未取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或杂环基烷基所描述的 那些基团）所取代。此外，活性官能团包括可转化为活性官能团的那些化合物。例如，X基团 可包括被在某些反应条件下可被水解的连接改性的化合物(如用来连接Ρ0Ζ衍生物与靶分 子的那些），从而断开连接而暴露活性官能团以与靶分子上的基团反应。
[0193] 在图式1中，反应物心-POZ-Y为Ρ0Ζ聚合的直接产物，Υ基团能直接转化为一系列能 形成水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物的单官能Ρ0Ζ衍生物。例如，在一个实施方案中，￥等于-0Η且当Ρ0Ζ聚合反应由氢氧化物终止时获得。在一个可替选的实施方案中，Υ等于-NHR 2且当 Ρ0Ζ聚合反应由含氨基的化合物R2NH2终止时获得。提供可用的Y基团的其他可用的胺终止剂 有哌嗪或取代的哌嗪，如1 -哌嗪丙醇(H-NC4H8N-CH2CH2CH2-OH)。取代的哌啶也可用，因为它 们提供胺通常提供的快速终止，且它们也引入一系列官能团。市场上可获得的取代的哌啶 包括4-哌啶丁酸、3-哌啶羧酸和4-哌啶甲醇。在一个可替选的实施方案中，Y等于-S-CH 2CH2-C02H且当ΡΟΖ聚合反应由_s-ch2ch 2-c〇2-ch3终止(随后不经分离即水解)时获得。
[0194] 下面示出了说明经由RrPOZ-X衍生物的一步法的制备的各种示例性反应。在下面 给出的反应中，Ri和R7为甲基，Y为-OH或-NHR 2，其中R2为CH3。
[0196] 可以看出上面的结构落在图式1的描述内。例如，对于上面的活性碳酸盐(Μ-ΡΜ0Ζ-0⑶2-NHS)，RjPR7为甲基，p和q为0,以及X为琥珀酰亚胺基碳酸酯。对于上面的活性酯(皿-PMOZ-O-CH2-CO2NHS)，R4PR7为甲基，P为-0-，p为 1，Q为-CH2-，q为 1，以及X为-CO2NHS。
[0197] 含上述活性基团的单官能Ρ0Ζ衍生物提供若干有用而不同的性质，从而可根据靶 分子的性质和所需的反应条件选择具有所需活性官能团的特定单官能Ρ0Ζ衍生物。例如，当 活性官能团为醛时，单官能Ρ0Ζ衍生物在限定的pH范围内主要与靶分子的Ν-端胺反应以形 成亚胺(其通常被氢硼化物还原为仲胺）。当活性官能团为活性酯时，单官能Ρ0Ζ衍生物主要 与胺(包括但不限于靶分子上的非末端赖氨酸基团）反应。同样，当活性官能团为活性碳酸 盐或三氟乙基磺酸酯时，单官能Ρ0Ζ衍生物易于与胺反应，但反应条件和选择性不同于活性 酯和醛。此外，当活性官能团为乙烯基砜或马来酰亚胺时，单官能Ρ0Ζ衍生物主要与硫醇反 应，但反应条件随各个基团而不同，从而提供了一系列适合于一系列靶分子的反应条件。
[0198] 重要的是，用上面的合成图式形成的各个单官能Ρ0Ζ衍生物能形成水解稳定的靶 分子-Ρ0Ζ偶联物。
[0199] 构造单元两步法
[0200] 在一个可替选的实施方案中公开了两步合成法。在两步法的第一步中，通过如上 所述的聚合制得的起始聚合物产物(下面的Ri-POZ-Y)与所需的化合物反应产生Ρ0Ζ中间体 (下面的心-?〇2-￥'）。在两步法的第二步中，该Ρ0Ζ中间体再与一系列包含一系列活性官能 团的化合物反应形成一系列能形成水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物的单官能Ρ0Ζ衍生物（下 面的Ri-POZ-X)。该两步合成法具有仅用两个反应并从单个起始聚合物产物(Ri-POZ-Y)开始 提供一系列单官能Ρ0Ζ衍生物的优势，从而最大限度地减少针对多个聚合物产物优化聚合 条件的需要。该两步法提供用一步法不能得到的单官能Ρ0Ζ衍生物。构造单元两步法的转化 的最一般形式在下面的图式2中示出。
[0201] RrPOZ-Y-Ri-POZ-Y'-Ri-POZ-X II
[0202] 图式 2
[0203] 构造单元两步法可以图式3中的如下详细形式示出。在图式3中，Y'为能与T基团所 代表的功能性亲核试剂反应的活性基团，包括但不限于活性酯和活性碳酸盐。
[0204] 步骤 1
[0205] Ri-P0Z-Y^Ri-P0Z-Pp-Qq-Y'
[0206] 步骤 2
[0207] RrPOZ-Pp-Qq-Y'+T-Uu-X-Ri-POZ-Pp-Qq-Mu-X III
[0208] 图式 3
[0209] 其中，
[0210] 办-1?4、1?7、1?8、1?11、1?14-1?15、1?23、？02、？、〇、1^111、11、？、9、￥和父同如上所述 ；
[0211] U为连接基团；U可为任何能形成图式3中所示的连接的基团并可根据与其形成连 接的基团的化学性质来选择;代表性的U基团包括但不限于-(r 16)。-、
[0212] - (CR5R6)。_、-NH-R21-NHCO-R22-;
[0213] 〇为一到十的整数；
[0214] ￥和!1为独立地选自1或0的整数；
[0215]抱、1?6、1?16、1?21和1? 22各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，在 一个实施方案中含1-10个碳原子；
[0216] R17选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合(在一个实施方案中含1-10个碳原子）、或取代的或未取代的芳基。
[0217] γ '和T为反应形成水解稳定的连接W的反应性对，其中Y '和T反应性对和所得W连接 选自表1中所示的那些基团和连接。Y'和T基团可反过来而不影响W连接的性质。
[0218]
[0219 ]下面示出了说明水解稳定的RrPOZ-Pp-Qq-Ww-Uu-X衍生物的制备的示例性反应。在 该反应中，Ri为氢，R?为甲基，Y为-OH，p和q为0，U为-CH2CH2-，u为1，反应性对T和Y '分别为-nh#p-o-co2-nhs，它们形成氨酯W连接，w为1，以及X为缩醛(被保护的醛）：
[0220] h-pmoz-oh^m-pmoz-o-co2-nhs
[0221 ] H-PMOZ-〇-C〇2-NHS+NH2-CH2CH2-CH( OEt) 2^
[0222] H-PM0Z-0C0NH-CH2CH2-CH(0Et )2,
[0223] 其在水解后产生 H-PMOZ-OCONH-CH2CH2-CHO。
[0224] 下面示出了图式3的另一实例。在该反应中，Ri和R?为甲基，Y为-0Η，Ρ为-0-，p为1，Q 为-CH2CH2-，q为1，反应性对T和Y '分别为-NH2和-CO2H，它们形成酰胺（-C0NH) W连接，w为1，? 为-CH2CH2-，u为1，Χ为缩酸(被保护的酸）：
[0225] M-PM0Z-OH^M-PM0Z-0-CH2CH2-C02H
[0226] M-PMOZ-〇-CH2CH2-C〇2H+NH2-CH2CH2-CH(OEt)2^
[0227] M-PMOZ-O-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CH (OEt) 2
[0228] 其在水解后产生 M-PMOZ-O-CH2CH2-CONH-CH2CH2-CHO0
[0229] 如上面所讨论的，图式3的各活性官能团在与靶分子的反应中具有独特的优势和 特殊性。此外，T和Y'基团与彼此的反应性可通过Q和U基团的性质控制。通过如所述地增大Q 和U基团的尺寸来增大T和Y'和/或T和X基团间的化学距离，改变Y'和T基团的反应性。此外， 活性官能团X与靶分子的反应性可类似地调节。
[0230] 与一步法一样，用上面的两步合成图式形成的各单官能Ρ0Ζ衍生物能形成水解稳 定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物。
[0231] 活性聚合物方法
[0232] 在本发明的另一可替选的实施方案中，可使用小的活性分子来终止噁唑啉聚合以 直接提供单官能ΡΟΖ衍生物，其可与靶分子反应形成水解稳定的靶分子-ΡΟΖ偶联物。该方法 被称为活性聚合物方法。活性聚合物方法的最一般形式可由如下图式4表示：
[0233] Ri-P〇Z++Nuc-Qq-X^Ri-POZ-C-Qq-X IV
[0234] 图式 4
[0235] 其中，
[0236] RrlU、R7、Rs 和 Ri4-Ri5、R23、Ρ0Ζ、Q、k、m、η、q、Y和X 同如上所述；Ρ0Ζ+代表噁唑啉聚合 过程中形成的阳离子-[N( COR?) CH2CH2 ] n+;
[0237] R19选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一个实施方案中含1-10个碳原子;以及
[0238] Nuc为能通过与末端阳离子-N(C0R7)CH2CH2+相互作用终止活性Ρ0Ζ聚合反应而形 成水解稳定的连接C的亲核试剂，其中Nuc基团和所得C连接可选自表2中所示的那些基团和 连接。
[0240]下面给出了说明心-POZ-C-Qq-X衍生物的制备的示例性反应。在下面所示的反应 中，Ri和R?为甲基，Nuc为-NH2，C为-NH-，Q为-CH2-，q为1，以及X为-C0 2H(注：甲酯在下面的反 应过程中水解）：
[0241 ] CH3-PM0Z++-S-CH2-CO2CH34CH3-PMOZ-S-CH2-CO2H
[0242]与本领域中的意见相反，本公开表明，醇盐(如-O-CH2-CO2-CH3)捕获阳离子不产生 所需的产物。
[0243] 如表2中所提及的，当使用哌嗪和哌啶作为Nuc基团时，C连接将结合进哌嗪和哌啶 环结构中。下面提供了用哌嗪和哌啶作为Nuc基团所得到的C连接及结构的实例。
[0244] 在该反应的一个实施方案中，硫醇盐化合物被用来终止噁唑啉聚合。在该方法中， 噁唑啉聚合如本文中所述被引发以形成在Ρ0Ζ聚合物的终止端处具有噁唑啉盐阳离子的 Ρ0Ζ聚合物。通过向反应中加入亲核硫醇盐分子来终止该反应，从而终止活性Ρ0Ζ聚合。硫醇 盐分子包含能与靶分子上的基团反应而形成水解稳定的连接的活性官能团（该活性官能团 可如本文中所述被保护起来）。
[0245] 在该方法的一个具体实施方案中，硫醇盐具有结构R25S-Dd_X，其中：
[0246] X的定义同上；
[0247] R25为金属;在一个实施方案中，R25为Li、Na或K;
[0248] D为连接基团，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基或芳基、_ (CH2) b_⑶NH- (CH2) b_、-NH- (CH2) b-NH⑶-(CH2) b、-CO- (CH2) b_、-C0-C6H4-、或-⑶-R26 或- (CR27R28)b;
[0249] R27和R28各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，在一个 实施方案中含1-10个碳；
[0250] R26 为-C6H10-CH2-(环己亚甲基）；
[0251] d为0或1;以及
[0252] b为1-10的整数。
[0253] 在一个实施方案中，活性官能团为被保护的官能团或可转化为活性官能团的化合 物。如上面所讨论的，各活性官能团在与靶分子的反应中具有独特的优势和特殊性。如同上 述，用上面的合成图式形成的各单官能Ρ0Ζ衍生物能形成水解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物。
[0254] 特定的Ρ0Ζ衍生物
[0255] 本公开描述了多种可通过上述方法制备的单官能Ρ0Ζ衍生物。此外，本公开描述了 许多可用于合成本公开的单官能Ρ0Ζ衍生物的化合物。
[0256] 在一个实施方案中，单官能Ρ0Ζ衍生物由通式(I)、（III)或（IV)描述：
[0257] Ri-P〇Z-Pp-Qq-X (I)
[0258] Ri-P〇Z-Pp-Qq-ffw-Uu-X (III)
[0259] Ri-P〇Z-C-Qq-X (IV)
[0260] 其中通式(I)、（II)和(III)中的定义与上面关于图式1-4中所提供的相同。
[0261] 此外，下面提供了本公开的单官能Ρ0Ζ衍生物的若干具体结构。这些结构仅为示例 的目的给出，而非意在限制本文中所述的单官能Ρ0Ζ衍生物的范围。同上，当在下面提及时， 上面的图式1-4中给出的定义适用于下面的结构；下面的定义也适用于可应用的地方。此 外，对于下面提供的所有结构，Ri基团应理解为含在引发剂基团的位置处（Ρ0Ζ基团的左 侧)。
[0262] R9 为连接部分，如-(R16) 〇-或-NH-R21-NHC〇-R22_;
[0263] G为未取代的或取代的芳基或取代的或未取代的烷基、烯基或炔基，如但不限于氟 代烷基；以及
[0264] Ar为未取代的芳基或取代的芳基。
[0265] 在一个实施方案中，本公开提供了通过构造单元一步法制得的单官能Ρ0Ζ衍生物。 源自该途径的示例性结构包括但不限于如下结构。
[0266] Ρ0Ζ-Ρ- (CR3R4 )m-CH( ORw) 2
[0267] P0Z-P-(CR3R4)m-CH0 and POZ-NHCO-C6H4-CHO
[0268] P〇Z-P-(CR3R4)m-C〇2H
[0269] P0Z-P-(CR3R4)m-C0-Z
[0270] Ρ0Ζ-Ρ- (CR3R4) m-C〇-NH-NH2
[0271] POZ-O2C-O-Z
[0272] POZ-O-SO2-G
[0274] POZ-P-CH2CH2-SO2-CH=CH2 和 POZ-NHCO-C6H4-SO2-CH=CH2
[0275] POZ-NH-CO-C6H4-NHCO-CH2-I
[0276] P〇Z-P-(CR3R4)n-CCH
[0277] 在另一实施方案中，本公开提供了通过构造单元两步法利用ΡΟΖ磺酸酯(源自P0Z-OH的中间体)上的亲核取代制得的单官能ΡΟΖ衍生物：
[0278] POZ-Ns
[0279] Ρ0Ζ-Ρ- (CR3R4) n-CH (ORw) 2
[0280] P0Z-P-(CR3R4)n-CH0
[0281] P0Z-0CN
[0282] P0Z-SCN
[0283] P0Z-CN
[0284] P〇Z-P-(CR3R4)n-CCH
[0285] Ρ0Ζ-Ρ- (CR3R4) n-C02H 和 Ρ0Ζ-Ρ- (CR3R4) n-C〇-Z
[0286] P0Z-P-Ar-C02H 和 P0Z-P-Ar-C0-Z
[0287] 在另一实施方案中，本公开提供了通过构造单元两步法利用Ρ0Ζ活性碳酸盐(源自 Ρ0Ζ-0Η的中间体)上的亲核取代制得的单官能Ρ0Ζ衍生物：
[0289] P〇Z-〇CONH-(CR3R4)n-C〇2H
[0290] P0Z-0C0NH- (CR3R4) n-C〇-Z
[0291] POZ-OCONH-C6H4-CHO
[0292] 在另一实施方案中，本公开提供了通过任何上述活性酯上的亲核取代制得的结合 了马来酰亚胺的单官能Ρ0Ζ衍生物：
[0294] 其中，
[0295] P0Z-L-C0-源自任何本文中所述的活性羧酸酯；以及
[0296] L为任何上面所示的连接Ρ0Ζ与羧基的连接部分，包括-P-(CR3R3)m-、-P-Ar-、和吡 啶盐-NC 5H4+-。
[0297] 可以看出这些马来酰亚胺适合上面的P0Z-PP-Qq-W w-Uu-X式，其中L包含Pp-Qq段，- CONH-包含Wwg，以及R9包含Uu段。
[0298] 在另一实施方案中，本公开提供了通过利用亲核攻击2-烷基-2-噁唑啉的聚合过 程中生成的Ρ0Ζ阳离子的活性阳离子方法制得的Ρ0Ζ衍生物：
[0299] P〇Z-P-(CR3R4)n-C〇2H
[0300] P0Z-P-Ar-C02H 和 P0Z-P-Ar-C0-Z
[0302]所有上面的ΡΟΖ衍生物与靶分子上的基团反应以在靶分子与P0衍生物间形成水解 稳定的连接。
[0303] 源自哌啶或哌嗪的特定Ρ0Ζ衍生物
[0304]如本文中所讨论的，活性Ρ0Ζ阳离子可用取代的或未取代的哌啶或哌嗪或其衍生 物终止。取代基包括但不限于关于取代的烷基及取代的和未取代的烷基、烯基、芳烷基或杂 环基烷基所描述的那些基团。这些Ρ0Ζ衍生物难以用上面的图式1-4说明，因为连接基团（图 式4中指定的C)是哌啶或哌嗪环结构的一部分。例如，Ρ0Ζ阳离子可被4-哌啶甲醇捕获而产 生Ρ0Ζ醇，被4-哌啶丁酸捕获而产生Ρ0Ζ羧酸，或被哌嗪本身捕获而产生Ρ0Ζ胺：
[0306]用这类哌啶和哌嗪的终止是有用的，因为强氮亲核试剂赋予快速并完全的终止而 引入末端活性官能团。市场上可获得的哌啶和哌嗪衍生物有至少四种，包括1-哌嗪丙醇、4-哌啶丁酸、3-哌啶羧酸和4-哌啶甲醇，其他的可容易地合成。
[0307] 应理解，任何上述自Ρ0Ζ醇、酸或胺制得的Ρ0Ζ衍生物也可自这类哌啶或哌嗪制备， 其中的含氮环提供醇、酸或胺。例如，如下化合物可自上面的用4-哌啶甲醇终止的Ρ0Ζ来制 备：
[0309] 这些化合物可再转化为一系列有用的衍生物，包括缩醛、马来酰亚胺和活性酯：
[0311] ΡΟΖ衍生物的使用
[0312]所述单官能ΡΟΖ衍生物可用来通过活性官能团产生水解稳定的靶分子-ΡΟΖ偶联 物。此外，使用本文中所述的单官能Ρ0Ζ衍生物，一个靶分子被每个Ρ0Ζ衍生物结合。换句话 说，各Ρ0Ζ衍生物上结合的靶分子不超过1个。单官能Ρ0Ζ衍生物中存在的活性官能团的多样 性使单官能Ρ0Ζ衍生物可用多种反应化学与靶分子上的多种基团偶联。例如，当活性官能团 为醛时，单官能Ρ0Ζ衍生物在限定的pH范围内主要与靶蛋白分子的Ν-端胺反应。当活性官能 团为活性酯时，单官能Ρ0Ζ衍生物主要与胺(包括但不限于靶分子上的赖氨酸基团）反应。同 样，当活性官能团为活性碳酸盐或三氟乙基磺酸酯时，单官能Ρ0Ζ衍生物与胺反应，但反应 条件和选择性不同于活性酯和醛。此外，当活性官能团为乙烯基砜、马来酰亚胺或碘乙酰胺 时，单官能Ρ0Ζ衍生物主要与硫醇反应，但反应条件随各个基团而不同，从而提供了一系列 适合于一系列祀分子的反应条件。
[0313] 重要的是，用上面的合成图式形成的各个单官能Ρ0Ζ衍生物均能形成水解稳定的 革巴分子-ροζ偶联物。
[0314] 在一个实施方案中，靶分子为多肽，如但不限于蛋白质。例如，单官能Ρ0Ζ衍生物可 与治疗学重要的蛋白质(如但不限于粒细胞集落刺激因子(GCSF))偶联。该示例性的反应在 下面通过如下反应示意性地说明：
[0315] M-P0Z-0C0-0-NHS+GCSF-NH2-
[0316] M-P0Z-0C0NH-GCSF
[0317] 在该实施方案中，GCSF上所示的胺代表若干可利用的赖氨酸基团中的一种。
[0318]同样，GCSF含可利用的硫醇基团，且在适当的条件下，含马来酰亚胺作为活性官能 团的单官能P0Z衍生物可与该硫醇基团反应。
[0319]活性ροζ衍生物也可与肽偶联。例如，含活性酯作为活性官能团的单官能ροζ衍生 物可与胰岛素上可利用的氨基偶联：
[0320] M-POZ-O-CH2-CO2-NHS+胰岛素-NH2-M-P0Z-0-CH2-C0NH-胰岛素
[0321] 在一个可替选的实施方案中，靶分子为小分子、药物或诊断剂。
[0322] 靶分子-ΡΟΖ偶联物
[0323] 如上所讨论的，本公开描述了多种能与靶分子形成连接而产生水解稳定的靶分 子-Ρ0Ζ偶联物的单官能Ρ0Ζ衍生物。在一般的实施方案中，本公开提供了具有通式(IV)的水 解稳定的靶分子-Ρ0Ζ偶联物：
[0324] Α-Β-ΤΜ (IV)
[0325] 其中，
[0326] Α为本文中所述的单官能Ρ0Ζ衍生物减去Ρ0Ζ衍生物上的活性官能团与靶分子上的 结合对象的反应过程中消除的任何离去基团；
[0327] ΤΜ为靶分子；以及
[0328] Β为本公开的单官能Ρ0Ζ衍生物的活性官能团与靶分子上的结合对象间形成的水 解稳定的连接，应理解，水解稳定的Β连接的性质将取决于单官能Ρ0Ζ衍生物上的活性官能 团及靶分子上的结合对象的性质。示例性的活性官能团、结合对象和Β连接在下表3中给出。 表3中的列举不是详尽无遗漏的，根据本公开可想到其他组合和所得的Β连接。
[0330] 实施例 [0331 ] 试剂
[0332] 试剂购自EM Science或Aldrich并在用前蒸馏。氯苯和噁唑啉从氢化钙中馏出。凝 胶渗透色谱(GPC)在具有1100四元栗和RI检测器的Agilent Technologies机器上进行。在 柱加热器（60°C )中串联地使用两个Phenogel? GPC柱（Phenomenex，5μ，500A。，300 X 7.8mm)。流动相为100 %的Ν，Ν' -二甲基甲酰胺(DMF)，流速为lmL/min。校准曲线用据MALDI 测得具有不同分子量(750，11(，21(，51(和101〇的1^^02-〇!1样品生成。凝胶过滤色谱(6?〇用 使用Shodex KW-803柱的相同系统进行，以pH 7.0的ImM HEPES缓冲溶液作流动相。使用UV 检测器对228nm加以监测。MALDI-T0F MS用Bruker，Microflex?仪器使用蒽三酚作为基质进 行。NMR在Varian 500MHz仪器上进行。
[0333] 实施例1 :Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2000的典型现有技术制备。
[0334] 向2-乙基-2-噁唑啉（2 · 02mL，0 · 020mol) /乙腈（3 · OmL，6 · 7M)溶液中加入三氟甲磺 酸甲酯(〇. 113mL，0.00 lmo 1)，溶液搅拌10分钟。然后将反应加热至80 °C并搅拌18小时。加入 碳酸钠（1.167g)和水（lmL)，并且所得混合物于90°C加热整夜。冷却至室温后，混合物用二 氯甲烷(40mL)稀释，然后移入分液漏斗中。加入水(5mL)和盐水(3mL)并摇动。弃去底层，水 层用二氯甲烷萃取两次（2X20mL)。结合的有机层用硫酸镁干燥，过滤并通过旋转蒸发浓 缩。将粗油溶解在丙酮中并通过逐滴加到二乙醚（80mL)中而沉淀。所得粉末经真空干燥 (1.90g，产率 94%)。
[0335] GPC呈现出具有可感知的高-MW肩的单个峰(Mn = 3600Da，9%)(图2A)。主峰的Μη为 1980Da，H)为1.UNMR呈现出预期的峰（参见实施例ehMALDI-TOF MS呈现出一组最大值在 2000Da、PD 1.04和分离99.1Da的峰。MALDI谱也呈现出分离99.1Da的第二组峰，但各峰比主 要的那组低14Da。该组峰的最大值发生在1600Da。
[0336] 实施例2:M-PE0Z-OH 2000的第二种现有技术制备。
[0337] 将氯苯(6.9mL)、乙腈(2.3mL)和三氟甲磺酸甲酯(0.164mL, 1.5mmole)在氮气和环 境温度下混合。然后在搅拌下缓慢加入2-乙基-2-噁唑啉(3.05mL，3.0g，30mm 〇le)。混合物 被加热至70°C并搅拌8小时。然后通过浸没在冰浴中将反应混合物冷却至室温。加入氢氧化 钾(2mmo 1)/甲醇（lmL)，混合物搅拌1小时。然后用二氯甲烷(40mL)萃取混合物。分离出二氯 甲烷层并用水(总共40mL)洗涤三次。有机层被干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩至5mL。产物 通过加到二乙醚(100mL)中沉淀并在真空下干燥(产量0.7g)。
[0338] GPC呈现出具有可感知的高-MW肩的单个峰(Mn = 3300Da，6%)(图2B)。主峰的Μη为 2200Da，ro为1.07。匪1?呈现出预期的峰(参见实施例6KMALDI-T0F MS呈现出一组最大值在 2300Da和分离99. IDa的峰。MALDI谱也呈现出分离99. IDa的第二组峰，但各峰比主要的那组 低14Da。该组峰的最大值发生在2100Da。
[0339] 实施例3:乙基二异丙基胺对Μ-ΡΕ0Ζ+终止的影响。
[0340] 在室温下向2-乙基-2-噁唑啉（1 · 0 lmL，10 · Ommol) /氯苯(5mL，2M)溶液中加入三氟 甲磺酸甲酯（〇 . 〇566mL，0.5mmo 1)，溶液搅拌10分钟。然后将溶液加热至110 °C并搅拌30分 钟。将溶液冷却至〇°C，加入二异丙基乙基胺(0.261mL. 1.5mmol)，所得混合物于50°C搅拌18 小时。将混合物冷却至室温并逐滴加到二乙醚(50mL)中，以得到白色沉淀。固体物于真空下 以几乎为定量产率进行干燥。
[0341] GPC呈现出两个峰，一个在约2000Da处（24%)，一个在约3800Da处(76%)。]\^0)1谱 确认了高-和低-MW产物的存在。
[0342] 实施例4:2，6-二甲基吡定对Μ-ΡΕ0Ζ+终止的影响。
[0343] 在室温下向2-乙基-2-噁唑啉（0.7581^，7.5臟〇1)/氯苯（3.751^)溶液中加入三氟 甲磺酸甲酯(〇. 〇424mL，0.375mmol)，溶液搅拌10分钟。然后将溶液加热至110°C并搅拌30分 钟。将溶液冷却至〇°C，加入2,6_二甲基吡啶(0.170mL. 1.5mmol)，所得混合物于50°C搅拌18 小时。将混合物冷却至室温并逐滴加到二乙醚(20mL)中，得到白色沉淀。固体物于真空下以 几乎为定量产率进行干燥。
[0344] GPC呈现出两个峰，一个在约2000Da处(89 % )，一个在约4000Da处（11 % )，这与某 些二聚相一致。匪R谱在4.2和5. Oppm处呈现出峰，这与未终止的噁唑啉盐阳离子的存在相 一致。
[0345] 实施例5:尝试用乙醇酸甲酯终止噁唑啉聚合。
[0346] 在室温下向2-乙基-2-噁唑啉(4.04mL，0.040mol) /氯苯（5mL，2M)溶液中加入三氟 甲磺酸甲酯（〇 . 453mL，0.004mo 1)，溶液搅拌10分钟。然后将溶液加热至110 °C并搅拌30分 钟。将溶液冷却至〇°C，加入2，6-二甲基吡啶（0.929mL. 0.008mo 1)和乙醇酸甲酯（0.609mL， O.OOSmol)，所得混合物于室温下搅拌18小时。将混合物冷却至室温并逐滴加到二乙醚 (1500mL)中，得到白色沉淀。固体物于真空下以几乎为定量产率进行干燥。
[0347] 匪R在4.46和4.99ppm处呈现出峰，这与噁唑啉盐离子相一致，并与乙醇酸酯未能 终止聚合相一致。
[0348] 实施例6:最适条件下Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2000的制备。
[0349] 将氯苯（30mL)和]\^(^汽344以1^，3.〇111111〇1)在氮气下于室温混合并加到24卜2-(^ (6.06mL，60mmo 1) /氯苯(20mL)中。混合物搅拌35分钟，同时加热到110 °C。接着将混合物冷 却至〇°C，然后加入碳酸钠(2.12g)/水(40mL)溶液并搅拌整夜。将混合物倒进分液漏斗中并 加入40mL水。除去底层，水层用二氯甲烷萃取(3 X 60mL)。结合的有机层用硫酸镁干燥，过滤 并通过旋转蒸发浓缩。将稠油状残余物溶解在7mL二氯甲烷中并于0°C逐滴加到二乙醚 (80mL)中。重复此沉淀作用，得到4.2g白色粉末(产率84 % )。
[0350] NMR(Varian, 500MHz , 1 Omg/mL CDC13)在 1 · 12ppm(s, 3H, CH3CH2CO-)、2 · 31 ppm(小s) 和2.41ppm(大 s)(总面积2H，CH3CH2C0-)、及3.47??111(8,4!1，，01201办-)处呈现出普通的主 链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小）和3.05ppm(大)处的两个单峰出现(CH 3-NCH2CH2)。末端亚甲 基（-CH2-〇H)出现在3.8ppm(s)处。GPC呈现出单个峰，无高MW肩并无可感知的谱尾;Mn = 1900Da，多分散性(PD) = 1.03(图3A) pMALDI谱的Mn= 1900Da，且有99. IDa质量单位的分离。 计算的为1.03。
[0351]对硝基苯基碳酸酯衍生作用。将产物转化为对硝基苯基碳酸酯，其然后经纯化并 在0.2N NaOH溶液（pH 8)的存在下水解。对硝基苯酚的测定（400nm处的UV吸收，ε = 18， 000Μ-Vm-〇表明-0Η取代度为99%。
[0352] 实施例7:最适条件下Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 5000的制备。
[0353] 将氯苯(80mL)和MeOTf (354yL，3.2mmole)于室温在氮气下于250mL单颈圆底烧瓶 中混合。搅拌的同时向烧瓶中缓慢加入2-Et-2-〇x (16.4mL，16.0g，160mmo 1)。加入噁唑啉后 混合物即变混浊。混合物于42 °C加热并搅拌一小时。随着加热混合物，混合物变澄清。然后 将混合物加热至80 °C并搅拌3.75小时。接着通过浸没在冰浴中15分钟而将混合物冷却至室 温。
[0354]聚合通过加入40mL水和2g碳酸钠并然后搅拌30分钟被终止。分离出水层，有机层 被再次用40mL水和lg碳酸钠并然后搅拌30分钟来萃取。分离出水层并与第一水层合并，合 并得到的水溶液于室温下搅拌整夜。混池的水层(~8OmL)然后用0.5M HC1 (~40mL)酸化直 至pH低于6(pH试纸），并获得澄清溶液。
[0355] 然后聚合物用二氯甲烷萃取4次(每次200mL)，合并的有机层在搅拌的同时用无水 硫酸镁干燥一小时。在真空下蒸发二氯甲烷溶液，将所得残余物溶解在25mL干燥的二氯甲 烷中并通过逐滴加到250mL乙醚(室温）中而沉淀。然后将所得白色固体物在真空炉中于50 °C干燥整夜。干燥得到白色粉末（14.1 g，产率88 % )。
[0356] NMR(Varian, 500MHz , 10mg/mL CDC 13)在 1 · 12ppm(s, 3H, CH3CH2CO-)、2 · 31 ppm(小s) 和2.41ppm(大 s)(总面积2H，CH3CH2C0-)、及3.47??111(8,4!1，，01201办-)处呈现出普通的主 链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小）和3.05ppm(大)处的两个单峰出现(CH 3-NCH2CH2)。末端亚甲 基(-CH2-OH)出现在3.8ppm(s)处。GPC呈现出单个峰，保留时间为13.5分钟。此=4100〇8，多 分散性(PD) = 1 · 06 Jn (理论）=4980Da。12 · 4分钟处的小肩表明有约1 %的高MW杂质;Μη = 8900Da(图3B)pMALDI谱的Mn = 4910Da，且有99.1〇8质量单位的分离。？0为1.02。对硝基苯基 碳酸酯衍生作用。将产物转化为对硝基苯基碳酸酯，其然后经纯化并在0.2N NaOH溶液(pH 8)的存在下水解。对硝基苯酚的测定(400nm处的UV吸收，εζΙδ,ΟΟΟΜΛπΓ1)表明-OH取代度 为 99 %。
[0357] 实施例8: ΡΟΖ对硝基苯基碳酸酯的合成
[0359] 用旋转蒸发浓缩M-PE0Z-OH(10.0g，1.0mm〇l)/乙腈(80mL)溶液。将残余物溶解在 二氯甲烷(40mL)中并在0°C下加入对硝基苯基氯甲酸酯（1.61 8,7.96111111〇1)。逐滴加入吡啶 (0.80mL，9.95mmol)，混合物于室温下搅拌三小时。用旋转蒸发浓缩混合物，然后加到二乙 醚中，得到白色沉淀。轻轻倒出溶剂，真空下干燥沉淀。将产物溶解在略酸性的水中，搅拌20 分钟并过滤。产物在二氯甲烷中萃取并用硫酸镁干燥。通过旋转蒸发浓缩溶液并加到二乙 醚中沉淀。轻轻倒出溶剂，产物在真空下干燥。产量8.7g〇NMR(Varian , 500MHz , 10mg/mL CDC13)在1.12口口111(8,3!1，〇13(：!12〇)-)、2.31口口111(小111)和2.41口口111(大8)(总面积2!1，〇13〇12(：0-)、 3.47?卩111(8,4!1，，012〇121)、7.38??111((1，2!1，了 = 5.2抱）和8.29??111((1，2!1，了 = 5.2抱）处呈现 出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小）和3.03ppm(大）处的两个单峰出现（CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基(-CH2-O-CO-)出现在4 · 42ppm(s)处。对硝基苯基碳酸酯取代。使产物 在0.2N NaOH溶液的存在下水解。游离对硝基苯酚的测定(400nm处的UV吸收，ε = 17，000ΙΓ knf1)表明-0Η取代度为100%。
[0360] 实施例9:M-PE0Z胺的合成
[0362] 将 M-PE0Z-PNPC (3 · 60g，0 · 694mmo 1) /二氯甲烷（20mL)溶液冷却至0 °C 并加入乙二 胺（2.33mL，34.7mmol)。溶液在冷态搅拌一小时，然后于室温搅拌18小时。混合物用旋转蒸 发浓缩，通过加入正丁醇(20mL)稀释，然后通过旋转蒸发除去醇（以共沸除去二胺）。将残余 物溶解在二氯甲烷中并加到二乙醚中。轻轻倒出溶剂并将白色粉末溶解在二氯甲烷 (100mL)中。溶液用IN NaOH溶液洗涤。水相用二氯甲烷洗涤两次(2 X 70mL)，合并有机层，并 用硫酸镁干燥。溶液被过滤、浓缩并加到乙醚中。轻轻倒出溶剂，白色粉末在真空下干燥。
[0363] NMR(Varian, 500MHz , 10mg/mL CDC13)在 1 · 12ppm(s, 3H, CH3CH2CO-)、2 · 31 ppm(小s) 和2 · 41ppm(大s)(总面积2H，CH3CH2C0_)和3 · 47ppm( s，4H，-NCH2CH2N_)处呈现出普通的主链 峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.05ppm(大)处的两个单峰出现(CH 3-NCH2CH2)。末端亚甲基 (-CH2-0C0-NH-)出现在4.2ppm(br s，2H)处，与乙二胺有关的质子出现在2.82ppm(m，2H，-NH-CH2-CH2-NH2)和3 · 23ppm(m，2H，-NH-CH2-CH2-NH2)处。
[0364] 实施例10: Ρ0Ζ琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成
[0365] 在5mL干燥的二氯甲烷或干燥的乙腈中制备M-PE0Z-OH(0.5g，0.23mmol)的溶液并 通过旋转蒸发浓缩。制备二琥泊酰亚胺基碳酸酯(0.24g，0.9mmol)在5mL干燥的二氯甲烧或 干燥的乙腈中的悬浮液。向该悬浮液中加入吡啶(〇.〇94mL, 1.16mmol)。向上面的悬浮液中 逐滴加入M-PEOZ-OH溶液，混合物于室温下搅拌整夜。混合物被过滤，用旋转蒸发浓缩，然后 加到二乙醚中。轻轻倒出溶剂，白色粉末在真空下干燥。将粉末溶解在干燥的丙酮中并通过 加到二乙醚中沉淀。产量〇.6g。匪R(Varian，500MHz，10mg/mL CDCI3)在1 · 12ppm( s，3H， CH3CH2CO-)、2 · 31 ppm(小m)和2 · 41 ppm(大s)(总面积2H，CH3CH2CO-)、3 · 47ppm(s，4H，-NCH2CH2N_)、2.70ppm( s，4H，SC基团）处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小）和 3 · 03ppm(大）处的两个单峰出现（CH3-NCH2CH2)。末端亚甲基（-CH2-0-⑶-）出现在4 · 24ppm (s)处。
[0366]实施例 11:M-PE0Z-T-C00H 2000的合成 _7] a.甲酯的合成
[0369] 按如上所述在氯苯中制备lmmo 1 M-PEOZ+的溶液。将溶液冷却至室温。在0 °C下向 NaH(0.12g，5mmo 1)/THF悬浮液中逐滴加入3-巯基丙酸甲酯(0.65mL，6mmo 1)。然后将M-PEOZ +溶液缓慢加到THF溶液中。使所得混合物升温至室温并搅拌整夜。反应混合物被过滤并加 到醚中，得到白色沉淀。轻轻倒出溶剂，固体物在真空下干燥得到1.5g白色粉末。
[0370] NMR(Varian, 50OMHz , 1 Omg/mL CDC13)在 1 · 12ppm(s, 3H, CH3CH2CO-)、2 · 31 ppm(小m) 和2.41ppm(大 s)(总面积2H，CH3CH2C0-)、3.47ppm(s，4H，-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链 峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰出现(CH 3-NCH2CH2)。末端亚甲基 (-CH2-COO-CH3)出现在2·64ppm(s)处，其邻近的亚甲基（S-CH2-CH2-CO-)出现在2 ·81 ppm(s) 处，与硫基团相邻的亚甲基(-CH2-S-CH2-)出现在2.71ppm(s)处。甲酯基团（-CH2-C00-CH 3) 在3.71ppm处以尖锐的单峰出现。
[0371] 硫代酸的合成
[0372] 制备上面的酯（8.1g，0.004mol)在20mL甲醇中的溶液并与30mL 0.05N NaOH溶液 (0.02mol)混合。混合物于室温下搅拌40分钟，然后用5 %的HC1酸化。通过旋转蒸发除去甲 醇，溶液用二氯甲烷萃取。萃取物用硫酸镁干燥，过滤，浓缩并加到醚中沉淀。轻轻倒出醚， 残余物在真空下干燥。NMR谱表明3.71 ppm处的甲酯峰消失。GPC表明有6 %的高MW肩。主峰的 Μη为1870Da，为1.15。上面的样品通过离子交换色谱用DEAE琼脂糖凝胶FF介质纯化。产物 的GPC给出没有高-MW肩的单个主峰，Μη为1970Da，TO为1.08JALDI给出的Μη为2090Da，TO为 1.04〇
[0373] 实施例 12:M-PE0Z-T-丙酸(M-PEOZ-T-PA)1000 的合成
[0374]
[0375] 如上所述，用2-乙基-2-噁唑啉（5.0511^，50111111〇1)和三氟甲磺酸甲酯（0.6311^， 5.56mmol)在氯苯（25mL)中制备M-TO0Z+。为获得终止试剂，在0°C下向叔丁醇钾（1.25g， 11 · lmmo 1)/氯苯（1 OmL)悬浮液中逐滴加入3-疏基丙酸甲酯（2 · 4lmL，22 · 2mmo 1)。混合物在 冷态搅拌2小时后，逐滴加入Μ-ΡΕ0Ζ+/氯苯溶液。混合物在冷态搅拌4小时，然后于室温搅拌 18小时。加入水(50mL)并通过加入5%的HC1水溶液使混合物酸化(pH~3)。用旋转蒸发除去 挥发物(包括氯苯）。所得水溶液用NaOH( 1.33g，33.3mmol)/H20(70mL)溶液处理。搅拌1小时 后，用5 %的HC1水溶液使混合物酸化，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥， 过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。轻轻倒出醚，残余物在真空下干燥。通过离子交换色谱用 DEAE琼脂糖凝胶FF介质进行进一步的纯化。GPC和GFC呈现出单个峰，Μη为910Da，H)为1.02。 MALDI 给出的Μη为 11 OODa，PD为 1 · 05。
[0376] 实施例 13:M-PE0Z-T-丙酸 NHS 酯(M-PE0Z-T-SPA)的合成
[0378] 于0 °C 下向来自上面的制备的M-PE0Z-T-C02H(Mn 910Da，2.0g，2.20mmol)/二氯甲 烷(44mL)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.467g，2.26mmol)和DCC(0.467g，2.26mmol)。 在冷态搅拌2小时后，使混合物升温至室温并搅拌整夜。用针头过滤器过滤混合物并将滤液 加到二乙醚中得到白色粉末。产物通过真空过滤收集并在真空下干燥(2.0g，产率89%)。琥 珀酰亚胺基的连接得到 1H NMR谱的证实，该谱示出除普通的主链峰外还在2.86ppm(s，2H) 处有琥珀酰亚胺基质子。为确定产率，将化合物(Μη计算值1025Da，0.4g，0.39mmol)在二氯 甲烷(4mL)中用苯乙胺(0.15mL，1.17mmol)和三乙胺(0.16mL，1.17mmol)处理。搅拌整夜后， 混合物被过滤并加到二乙醚中。白色粉末被过滤并用真空干燥。根据凝胶渗透色谱，转化产 率为99 %。
[0379] 实施例14:经由硫醇盐合成Μ-ΡΕ0Ζ-硫代-NH2
[0381] tBoc酯的合成
[0382] 向2-乙基-2-噁唑啉（5.0511^，0.05111〇1)/氯苯（251^)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯 (0.283mL，0.0025mol)。室温搅拌10分钟后将混合物加热至110°C并保持30分钟，然后冷却 至〇 °C。为获得终止试剂，在0 °C下向叔丁醇钾(0.561 g，0.005mo 1) /氯苯(5mL)悬浮液中逐滴 加入Boc-半胱胺(0.84mL，0.0075mol)。混合物在冷态搅拌1小时以得到澄清溶液后，在0°C 下用注射器逐滴加入Μ-ΡΕ0Ζ+/氯苯溶液。混合物在冷态搅拌4小时，然后于室温搅拌18小 时。将混合物缓慢加到二乙醚中，得到白色沉淀。轻轻倒出醚，将残余物溶解在水中，然后用 二氯甲烷萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。过滤混合物， 残余的白色粉末在真空下干燥得到4.0g目标化合物，产率为87%。
[0383] NMR(Varian，500MHz，1 Omg/mL CDC13)在 1 · 12ppm(s，3H，CH3CH2CO-)、2 · 31 ppm(s)和 2.41??111(8)(总面积2!1，0130120)-)、及3.47??111(8,4!1，401 201办-)处呈现出普通的主链峰。 引发甲基峰以2.9ppm和3.03ppm处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2) doc半胱胺端基峰出现在 1.44ppm(s，9H，-CH2NHBoc)、2.67ppm(m，2H，-SCH2CH2NHBoc)、2·71ppm(m，2H，-CH2SCH2CH2NHB0C)和3.32ppm(m，2H，-SCH2CH2NHB0C)处。根据 NMR 积分，粗混合物含约 8 % 的Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 物类。GPC 产生 Μη = 1790Da、PD = 1.07 的尖锐峰。
[0384] 胺的合成
[0385] 在0 °C及剧烈搅拌下将盐酸（二氧六环中的4M溶液，34. OmL)加到含Μ-ΡΕ0Ζ-Τ-ΝΗ (Boc) (Mn 1850Da，3.218g，1.74mmol)的烧瓶中。使混合物升温至室温并搅拌1小时。通过旋 转蒸发浓缩混合物并用水(50mL)稀释，调节pH至~13。所得水溶液用二氯甲烷萃取三次。合 并的有机相用Na 2S04干燥，过滤，浓缩，在醚中沉淀以得到白色粉末，过滤该白色粉末并在真 空下干燥，得到2.5g产物。通过离子交换色谱用CM琼脂糖凝胶FF介质进行进一步纯化。通过 柱纯化收集两个馏分。一个〇.2g的馏分含纯胺聚合物，第二个2.2g的馏分含胺聚合物和8% 的从前一步骤带来的杂质(Μ-ΡΕ0Ζ-0Η)。
[0386] 4 MMR(Varian，500MHz，10mg/mL CDC13)在 1.14ppm(m，3H，CH3CH2C0-)、2.32ppm (m)和2.41(s)(总面积 2H，CH3CH2C0-)、及 3.47??111(111，4!1，，0120刷-)处呈现出普通的主链 峰。引发甲基峰以2.9ppm和3.03ppm处的两个单峰出现(CH3-NCH2CH2)。末端半胱氨基峰见于 2 · 69ppm(m，4H，-SCH2CH2NH2，-CH2SCH2CH2NH2)和2 · 9 lppm(m，2H，-SCH2CH2NH2)处。Boc基团的 移除通过1.44??111(8,9!1，-〇12順8〇(3)处峰的消失得到证实。6?(：示出此值为170003，？01为 1.10〇
[0387] 实施例 15:M-PEOZ-T-SCM(M-PEOZ-S-CH2-C〇2-NHS)的合成
[0388] 酸的合成
[0389] 在氩气下混合氯苯（100mL)与2_乙基_2_噁唑啉（39.7g，0.4mol，50eq.)并于0°C搅 拌30分钟。搅拌下向烧瓶中加入三氟甲磺酸甲酯（1.3以，1叫.），继续在0°(：搅拌30分钟、在 25 °C搅拌30分钟、在42 °C搅拌1小时、然后在80 °C搅拌3.5小时。使混合物冷却至室温。在单 独的烧瓶中通过混合叔丁醇钾（2.25g，5eq.)和2-巯基乙酸甲酯（2.9g，6eq.)及氯苯 (100mL)并于0 °C搅拌1小时制备终止混合物。将聚合混合物加到终止混合物中并于室温搅 拌整夜。混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，过滤并加到二乙醚(750mL)中。轻轻倒出上清液，收 集沉淀，在真空下干燥1小时。将粉末溶解在100mL 0.1M NaOH中并搅拌4小时。通过加入 25mL 0.5M HC1使混合物酸化。水溶液用二氯甲烷萃取（150mL X 3次），用MgS〇4干燥，浓缩至 50mL，并在二乙醚(400mL)中沉淀。所得白色粉末在真空下干燥。
[0390] 所得酸通过DEAE离子交换色谱纯化得到纯酸（如GFC色谱所示）JMR表明1.30和 4.19ppm处酯的甲基和亚甲基峰已分别消失。
[0391] NHS酯的合成
[0392] 于0 °C 下向含溶解在二氯甲烷（60mL)中的M-PEOZ-T-CM(M-PEOZ-S-CH2-C〇2H，Μη 4970Da，6.0g，l .21mmol)的溶液中加入Ν-羟基琥珀酰亚胺（0· 139g，1.21mmol)和DCC (0.249g，1.21mmol)。在此温度搅拌2小时后，使该澄清的无色混合物升温至室温并搅拌整 夜。含白色沉淀的混合物用针头过滤器过滤。搅拌下将滤液加到二乙醚中，得到白色粉状沉 淀。残余物用烧结玻璃漏斗收集并在真空下干燥，得到5.2g所需产物(产率85%)。
[0393] tf-NMR:羟基琥珀酰亚胺的连接得到咕NMR谱的证实，该谱表明除ΡΕ0Ζ的普通的主 链峰外还在2.87ppm(s，4H)处有琥?自酰亚胺基质子。
[0394] 为确定转化产率，将该化合物(Μη计算值50700&，0.10(^，0.0197臟〇1)在二氯甲烷 (2mL)中用苯乙胺（0.01211^，0.0987111111〇1)和三乙胺（0.01411^，0.0987_〇1)处理。搅拌整夜 后，混合物被过滤并加到二乙醚中。过滤白色粉末并用真空干燥，得到定量产率的所需酰 胺。根据GFC，转化产率为95+%。
[0395] 实施例16:硫代NHS酯的水解速率
[0396] 硫代NHS酯M-PEOZ-T-SCM 5K和M-PEOZ-T-SPA 5K的反应性在pH 8的硼酸盐缓冲溶 液中评价。精确称量的两种酯的样品，置于l〇〇mL容量瓶中，并溶解在pH 8的硼酸盐缓冲溶 液(0.2M)中。先每1分钟、后每10分钟从各烧瓶中取等分试样并通过UV-分光光度计于260nm 的最大吸收波长(Amax)下分析。以吸光度值增加的速率对时间作图。从这些计算确定最大 吸光度值的50%时的速率。M-PEOZ-T-SCM 5K和M-PEOZ-T-SPA 5K的t1/2计算值分别为〈1分 钟和15分钟。
[0397] 实施例 17:M-PEOZ-〇C〇2-NHS 与 GCSF 的偶联
[0398] 按如下所述使单官能衍生物Μ-ΡΕ0Ζ-0⑶2-NHS与靶分子(本实施例中为GCSF)偶 联。溶解在lml 0.2M的硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)中的4mg GCSF(0.215ymol，MW=18.6kDa) 与每GCSF氨基（总共5个赖氨酸加 α-胺)3当量的M-PE0Z-0C02-NHS在室温下反应60分钟。在 这些反应条件下，单官能Ρ0Ζ衍生物与GCSF上的氨基间的反应主要发生在更裸露的亲核胺 上。
[0399] 605?的修饰通过1^-冊^：采用(：1848丨161^分析柱分析，该柱平衡于60%的缓冲溶 液A (HPLC级水，含0 · 05 %的TFA)中并用1 %的缓冲溶液B/min (70 % CH3CN和0 · 05 % TFA)的线 性梯度以lml/min的流速洗脱30分钟。洗脱的物质通过280nm下的吸光度检测。GCSF-ΡΟΖ偶 联物呈非对称峰被洗脱，保留时间为18.8分钟，其表明了GCSF-ΡΟΖ偶联物在与GCSF分子偶 联的Ρ0Ζ分子数方面的不均一性。氨基含量的Habeeb分析表明70%的蛋白质氨基不再是游 离的。
[0400] 若干偶联物的形成通过SDS-PAGE及通过尺寸排除HPLC确认。SDS-PAGE实验用 Pharmacia Phast System进行。微型凝胶（12%的聚丙稀酰胺)上施加恒定电压(200V)，并 按Laemml i的方法制备。对于蛋白质染色，将凝胶置于Coomassie蓝色溶液中，而对于聚合物 染色，使用碘化钡溶液。聚合物染色基于碘化钡络合物的形成（K u r f u s t，M. Μ .，19 9 2， Analytical Biochemistry，200,244-248)。SDS-PAGE数据显示出若干条带，表明获得了化 学上不同的分子GCSF偶联物的混合物，这样的偶联物包含一个、两个或三个Ρ0Ζ分子。
[0401 ] 尺寸排除HPLC分析用Biosep SEC S2000分析柱进行，该柱用0.1M磷酸钠、0.2M氯 化钠 (pH 7.2)和20%乙腈的等强度流动相以0.5ml/min的流速洗脱。洗脱的物质通过280nm 下的吸光度检测。色谱在5.75min处呈现出洗脱峰，其对应着比天然蛋白质（洗脱峰在 9. OOmin处)高的分子量，表明形成了GCSF-P0Z偶联物。
[0402] 实施例18:M-PEOZ-〇C〇2-NHS与核糖核酸酶A的偶联
[0403]按如下所述使单官能Ρ0Ζ衍生物M-PE0Z-0C02-NHS与靶分子(本实施例中为核糖核 酸酶A(RNAse Α))偶联。溶解在lml 0.2Μ的硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)中的5mg RNAse A (0·36μπιο1，Mff 13kDa)与每RNAse A氨基（总共5个赖氨酸加 α-胺)3当量的M-PE0Z-0C02-NHS 反应。反应在室温下进行60分钟。RNAse A修饰的程度通过RP-HPLC采用C4Agilent分析柱分 析，该柱平衡于80 %的缓冲溶液A(HPLC级水，含0.05 %的TFA)中并用1 %的缓冲溶液B/min (90%CH3CN和0 · 05 %TFA)的线性梯度以lml/min的流速洗脱30分钟。洗脱的物质通过280nm 下的吸光度检测。色谱表明有少量(〈10 % )未被修饰的蛋白质。ΡΟΖ-修饰蛋白质的峰很宽， 表明了RNAse Α-Ρ0Ζ偶联物在与RNAse Α分子偶联的Ρ0Ζ分子数方面的不均一性。氨基含量 的Habeeb分析表明RNAse Α上26%的氨基被修饰。
[0404] 若干偶联物的形成通过SDS-PAGE及通过尺寸排除HPLC确认。SDS-PAGE实验用 Pharmacia Phast System进行并按上面的实施例中所述染色。同GCSF结果一样，SDS-PAGE 数据显示出若干条带，表明有若干不同的RNAse Α-Ρ0Ζ偶联物。尺寸排除HPLC分析用Biosep SEC S2000分析柱按上面的实施例中所述进行。色谱较早出现宽峰，其对应着比天然蛋白质 高的分子量，这与RNAse Α-Ρ0Ζ偶联物的形成相一致。
[0405] 实施例19:M-PE0Z-马来酰亚胺和邻二硫吡啶的制备
[0406] 本实施例中自M-TO0Z-NH2(见上）制备单官能Ρ0Ζ衍生物Μ-ΡΕ0Ζ-马来酰亚胺。向 100mg(0.55mmol，3eq)4_马来酰亚胺丁酸中加入无水氯仿中的126mg Η0ΒΤ( 1.09mmol)和 226mg DCC(1.09mmol)。3小时后加入 16mg(0.00254mmol )M-PE0Z-NH2。所得溶液在室温下保 持整夜。反应混合物用〇. IN HC1洗涤，干燥，并真空蒸发。加入乙醚，通过过滤收集沉淀并干 燥。反应产率为65 %。
[0407]以同样的方式通过在氯仿中于室温下及三乙胺（3eq.)存在下偶联琥珀酰亚胺丙 酸二硫吡啶（SPDP) (3倍过量)与M-PE0Z-NH2 5小时制备邻二硫吡啶(0PSS)试剂。最终产物 在醚中沉淀获得，产率为65 %。
[0408] 实施例20:M-PE0Z-马来酰亚胺、M-PE0Z-0PSS、PEG_马来酰亚胺和PEG-0PSS与硫醇 的反应的比较
[0409] 为评价Μ-ΡΕ0Ζ-马来酰亚胺和M-PE0Z-0PSS的反应性以及比较Μ-ΡΕ0Ζ-马来酰亚胺 和M-PE0Z-0PSS衍生物与它们的相应的PEG衍生物的反应性，将ΡΕ0Ζ和PEG聚合物偶联到含 半胱氨酸的三肽谷胱甘肽上。与谷胱甘肽的反应用本领域中熟知的Ellman's分析监测。在 0.1M pH=7的磷酸盐缓冲溶液(含5mM EDTA)中制备20mM ΡΕ0Ζ或PEG衍生物和2mM硫醇的溶 液。取等分试样(30μ1)并通过加入到920μ1 pH 7的缓冲溶液猝灭。加入50微升DTNB，5分钟 后测定420nm下的吸光度来评价剩余的硫醇。半胱氨酸修饰的程度在表4中给出。
[0410]
[0411] 实施例21 :Μ-ΡΕ0Ζ-对硝基苯基碳酸酯和PEG-对硝基苯基碳酸酯的水解和氨解研
[0412] Μ-ΡΕ0Ζ-对硝基苯基碳酸酯和相应的PEG-对硝基苯基碳酸酯的水解速率通过释放 在0.1M pH 8的硼酸盐缓冲溶液中的对硝基苯酚在室温和412nm下的UV吸光度或聚合物对 胺的反应性评价。本实施例中向活化的ΡΕ0Ζ或PEG溶液中加入Gly-Gly(Gly-Gly/聚合物比 率1:1)的溶液。表5以半衰期记载了水解和氨解速率。
[0414] 实施例 22 :M-PEOZ-〇-CH2-C〇2H的制备
[0415] 在60ml甲苯中共沸蒸馏M-PE0Z_0H(1.5g，0.00024mol，leq);除去30ml蒸馏物。使 反应混合物缓慢冷却至室温，然后加入0.5ml (0.5mmol) 1.0M的叔丁醇钾/叔丁醇溶液。所得 混合物在室温下搅拌1小时，然后加入94mg(0.48mmol)溴代乙酸叔丁酯。将所得混浊混合物 加热至回流，冷却并于室温下搅拌18小时。反应混合物通过Celite过滤并在真空下除去溶 剂。残余物在乙醚中沉淀。产物于4°C离心，洗涤三次并除去溶剂。NMR中叔丁基峰（1.47ppm) 与末端甲基峰的比较表明为定量转化。
[0416] 将所得羧酸叔丁酯溶解在CH2CI2/三氟乙酸/水(50ml/0. lml/100ml)的混合物中， 溶液于室温搅拌3小时。然后在真空下除去溶剂以完全除去TFA，然后在乙醚中离心，得到 900mg产物(60 % )。NMR表明叔丁基峰已消除而在4.08ppm处观察到新的亚甲基峰。
[0417] 通过阴离子交换色谱从过量的Μ-ΡΕ0Ζ-0Η中纯化羧酸。将900mg产物装入预平衡的 柱(QAE 50)中，流速为lml/min。用水进行等强度洗脱直至Μ-ΡΕ0Ζ-0Η被完全洗脱。将溶剂换 为0.01N的NaCl并收集产物。馏分通过1 2分析鉴定。在真空下浓缩馏分至30ml并用CH2C12洗 涤六次(40ml X 6)。产量为600mg。
[0418] 实施例 23:M-PEOZ-〇-CH2-C〇2-NHS 的制备
[0419] 将|^^02_0)0!1(60〇11^，0.11111111〇1)溶解在151^二氯甲烷中，并加入^羟基琥珀酰 亚胺（104mg，Ο · 9mmol)和DCC( 185mg，Ο · 9mmol)。让反应混合物反应24小时，然后通过加入乙 醚沉淀产物，通过过滤收集产物并干燥。根据用于测定残余NH2基团的TNBS测得的作为底物 的甘氨酸-甘氨酸的氨基修饰率确定活化度为85%。
[0420] 实施例 24:M-PEOZ-〇-CH2-C〇2-NHS 和 PEG-O-CH2-CO2-NHS 的水解和氨解研究
[0421] M-PEOZ-O-CH2-CO2-NHS和PEG-O-CH2-CO2-NHS的水解速率通过测定释放在0.1M pH 8的硼酸盐缓冲溶液中的N-羟基琥珀酰亚胺在室温和260nm下的UV吸光度来评价。为评价聚 合物对胺的反应性，向M-PE0Z-0-^-C0 2-NHS和PEG-O-迎-⑶2-NHS (按本领域中熟知的那 样制备)溶液中加入Gly-Gly(Gly-Gly/聚合物比率1:1)的溶液，以用于比较。表6以半衰期 记载了水解和氨解。
[0423] 实施例 25:M-PEOZ-〇-CH2-C〇2-NHS 与 GCSF 的偶联
[0424] 溶解在 lml 0.2M 的硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)中的 2.5mg GCSF(0.134ymol，MW = 18.6kDa)与每GCSF氨基(总共5个赖氨酸加 α-胺)3当量的M-PE0Z-0-CH2-C02-NHS在室温下反 应60分钟。在这些条件下，修饰主要发生在更裸露的亲核胺上。
[0425] GCSF的修饰通过RP-HPLC采用C18Agilent分析柱分析。洗脱剂A为含0.05%TFA的 H20，洗脱剂B为含0.05 % TFA的乙腈。流速为lml/min，检测在280nm下进行。所用梯度为0分 钟时B为30 %; 30分钟内B从30 %变到80 %，3分钟内B从80 %变到30 %。色谱表明无游离蛋白 质存在，且在比游离GCSF晚的保留时间下出现宽峰，表明存在GCSF-ΡΟΖ的多种形式。
[0426] 若干偶联物的形成通过尺寸排除HPLC确认。尺寸排除HPLC分析用Agilent GF-250 柱进行，该柱用0.謂磷酸钠、0.21氯化钠(？!17.2)和20%乙腈的等强度流动相以0.31111/1^11 的流速洗脱。色谱呈现出宽洗脱峰，这对应着比天然GCSF具有更高分子量的GCSF-ΡΟΖ偶联 物，并与广泛的偶联和质量的增加相一致。
[0427] 实施例26:经M-POZ-O-CH2-CO2-NHS和PEG-O-CH2-CO2-NHS修饰的酶的性质的比较
[0428] 为评价因与本公开的ΡΟΖ衍生物和本领域中熟知的相应PEG聚合物的聚合对酶性 质的影响，将三种不同的酶--核糖核酸酶A、尿酸酶和过氧化氢酶用m-peoz-o-ch 2-c〇2-NHS (6kDa)和PEG-0-CH2-C02-NHS (5.5kDa)修饰。为便于比较，各酶在就聚合物-酶比率、缓冲 溶液、pH和反应温度方面而言相似的条件下被修饰。
[0429] 用上述ΡΟΖ和PEG聚合物修饰酶的条件为0.2M、pH 8.5、硼酸盐缓冲溶液。修饰所用 Ρ0Ζ和PEG聚合物的量根据各酶中总共可利用的氨基的计算值来计算。例如，核糖核酸酶A的 分子量为13.7kDa，有11个可利用的氨基；尿酸酶的分子量为130kDa，有100个可利用的氨 基;过氧化氢酶的分子量为240kDa，有112个可利用的氨基。
[0430]室温下分别以2/1和1/1的聚合物-蛋白质氨基摩尔比向三种酶溶液(2.5mg/ml)中 加入M-P0Z-0-CH2-C02-NHS或PEG-〇-CH2-C〇2-NHS固体。天然形式的核糖核酸酶、尿酸酶和过 氧化氢酶的蛋白质浓度分别用9.45 X 103、13 ΧΙΟ3和1.67 ΧΙΟ5的摩尔消光系数在280nm下 用分光光度法评价。30分钟后，通过凝胶过滤色谱36口1^(1616-75柱用0.謂口!17.4的磷酸 盐缓冲溶液作洗脱剂从未反应的聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺中纯化聚合物-酶偶联物。
[0431] 用比色法通过TNBS分析评价蛋白质修饰度并以偶联的氨基对蛋白质上存在的总 的氨基的百分数表示。天然和经修饰的酶的酶活性按如下评价:核糖核酸酶活性通过Crook 等(Biochem J. 1960Feb;74: 234-8)的方法分析;尿酸酶活性通过Mahler的方法测定(Anal Biochem. 1970Nov;38(l) :65-84);过氧化氢酶按Beers和Sizer报道的方法分析 (J.Biol.Chem.l952Mar;195(1):133-40)。
[0432] 核糖核酸酶(RNAse)、尿酸酶和过氧化氢酶的结果分别在表7A-C中给出。
[0434]
[0435] 发现当用PEG-0-CH2-C02-NHS修饰时比用M-P0Z-0-CH2-C0 2-NHS修饰时核糖核酸酶 被修饰的程度高并因此有更高的活性损失。在尿酸酶中，使用PEG-0-CH2-C02-NHS和Μ-Ρ0Ζ-0-CH 2-C02-NHS时的修饰度和活性损失相似;但在受试的两种摩尔比下Ρ0Ζ偶联物表现出略 高的活性。对于过氧化氢酶，使用PEG-〇-CH 2-C〇2-NHS和M-P0Z-0-CH2-C02-NHS时的修饰程度 相似，且注意到两种情况下酶活性的损失均较小，且在受试的两种摩尔比下Ρ0Ζ偶联物的活 性比PEG偶联物更高。
[0436] 实施例 27:TGAse 下 M-PE0Z-NH2 与 G-CSF 的偶联
[0437] 本实施例中检查了使用酶TGAs e时P0Z-NH2对G-CSF的位点特异性修饰。也用PEG-NH2和相同的试剂浓度进行相同的反应作为比较。
[0438] 如上所述从产物Μ-ΡΕ0Ζ-0Η开始制备单官能烷基胺Μ-ΡΕ0Ζ衍生物。TGAse-催化的 M-PE0Z-NH2和PEG-NH2与G-CSF的偶联在0.1MpH7.2的磷酸盐缓冲溶液中于室温进行18小 时，其中使用1.6mg G-CSF、50mg任一胺和2mg/ml TGAse (市场上可获得）。在这些条件下，G-CSF与M-PE0Z-NH2没有显著或明显的偶联发生(如反相色谱所示;详情见上），而PEG-NH 2给出 明显的偶联。
[0439] 当向M-PE0Z-NH2的反应混合物中再加入2mg/ml TGAse酶时，天然G-CSF蛋白质峰 将减小并观察到代表偶联物M-PE0Z-G-CSF的新峰。
[0440] 实施例28 :Μ-ΡΕ0Ζ醛的制备
[0442] 二醇的制备
[0443] 在细颈瓶中制备3-氨基-1，2-丙二醇（1.41gm，15mm〇l)/0.1M pH 8.0的硼酸缓冲 溶液（3mL)。用浓HC1调节溶液pH至pH 9。剧烈搅拌下向该溶液中加入如上所述制备的M-PEOZ NHS酯（1.00gm，0.197mmol)。加入IN NaOH使溶液pH保持在9。溶液在室温下搅拌三小 时。用IN HC1调节溶液pH至pH 6.8。向溶液中加入氯化钠(3gm)。向溶液中加入水（lmL)，然 后用二氯甲烧萃取三次(3 X 1 OmL)。弃去水相。有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并通过旋转 蒸发浓缩。浓缩溶液在二乙醚(l〇〇mL)中沉淀。所得粉末在高真空下干燥整夜。产量:0.7gm。 根据NMR，取代度为96% ;根据GFC，取代度为95%。在DMS0-d6中的NMR:-C( = 0)NHCH2CH(OH) CH20H ： 1Η, δ 4.49, t; -C (= 0) NHCH2CH (OH) CH2OH: 1Η, δ 4.70, d ； -C (= 0) NHCH2CH (OH) CH20H: 1Η, 57.87，以分辨率不良）。
[0444] 氧化成醛
[0445] 将二醇（0 · 500gm，0 · 112mmol)溶解在水（8mL)中。通过加入0 · IN NaOH调节溶液pH 至6.85，然后加入高碘酸纳（27.9mg，0.130mmol)。溶液于室温搅拌一小时。向溶液中加入水 (2mL)和NaCl (2gm)。用二氯甲烷萃取溶液三次（3 X 10mL)。合并的有机层用无水硫酸钠干 燥。过滤混合物，然后在减压下浓缩滤液。残余物通过加到乙醚(50mL)中而沉淀。过滤后所 得粉末在高真空下干燥。产量:〇. ATgnuGPC测得Μη为4840Da。根据CDC13中的NMR，醛取代度 为 89%<XDC13 中的lH-NMR:-C(=0)NHCH2CH0，lH，S9.635，s;-C(=0)NHCH2CH0,2H，S4.175，q (分辨率差）。
[0446] 实施例29:从M-PE0Z-PNPC合成Μ-ΡΕ0Ζ马来酰亚胺2K
[0448] 向二氯甲烷(5mL)中N-(2-氨乙基）马来酰亚胺三氟乙酸盐(0.065g，0.255mmolWP 三乙胺（0. 〇97mL，0.696mmol)的混合物中加入如上所述制备的Μ-ΡΕ0Ζ对硝基苯基碳酸酯 (Mn 2150Da，0.500g，0.232mmol)。室温搅拌18小时后，混合物被过滤，然后逐滴加入二乙醚 中，得到淡黄色沉淀。轻轻倒出溶剂，固体物在真空下干燥，得到定量产率。除普通的主链峰 外，咕NMR谱还表明在4.15ppm(br s，2H)处有末端亚甲基质子(-CH2-0C0-NH-)且在6.72ppm (s，2H)处有与马来酰亚胺有关的质子。通过比较引发甲基和马来酰亚胺的积分，确定产率 为~80%。
[0449] 实施例30:经由异烟酸乙酯合成M-PEOZ NHS酯
[0451 ] 乙酯的合成
[0452] 在室温下向2-乙基-2-噁唑啉单体(50.4711^，0.500111〇1)/氯苯(2501^)溶液中加入 三氟甲磺酸甲酯（2.83mL，25.Ommol)。搅拌10分钟后，将反应混合物加热至110°C并保持40 分钟。将反应混合物冷却至〇°C，然后加入异烟酸乙酯（11.55mL，75. Ommol)。所得混合物于 室温搅拌2小时后，在醚（1500mL)中沉淀，得到57g白色粉末。将沉淀溶解在200mL H20中，然 后用200mL二氯甲烷萃取三次。合并的有机层用MgS04干燥，过滤并在真空下浓缩。将稠油状 残余物溶解在CH 2Cl2(100mL)中并在二乙醚（lOOOmL)中沉淀。轻轻倒出溶剂后，残余物经真 空干燥得到43.58白色粉末，产率为86%。匪1?(50010^，1〇11^/11110)(：1 3)在1.12口口111(8,3!1， 〇13〇12(：0-)、2.31??111(小8)和2.41??111(大8)(总面积2!1，〇13〇12(：0-)、及3.46??111(8,4!1，-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2.9ppm(小)和3.03ppm(大)处的两个单峰 出现(CH3-NCH2CH2)。哌啶峰出现在 1.68ppm(br s，3H)、1.90ppm(br s，2H)、2.15ppm(br s, 2H)和2 · 84ppm(br s, 2H)处。末端乙酯峰出现在 1 · 26ppm( t, 3H, J = 7 · 0MHz, -C( = 0)OCH2CH3) 和4.13口口111(9,2!1，了 = 6.51!^，-(：(=0)0012(：!13)处。6?(：表明]\111 = 17700&，？0=1.06。]\^0)1给 出 Mn = 2050Da，PD = 1.02。
[0453] 酸的合成
[0454] 将Μ-ΡΕ0Ζ乙酯（Mn = 2050Da，10 · 0g，4 · 89mmol)溶解在H2〇(60mL)中。加入NaOH (0.977g，24.4mmol )/H20(20mL)溶液，混合物被搅拌40分钟。用5 %的HC1水溶液酸化混合 物，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。轻 轻倒出醚，残余物在真空下干燥得到9.0g白色粉末，产率为91 %。4 NMR表明水解后乙酯基 峰已完全消失。
[0455] NHS酯的合成
[0456] 在〇°C下向M-PEOZ-C〇2H(Mn 20200&，3.(^，1.49111111〇1)/二氯甲烷（5011^)的溶液中 加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.173g，1.50mmol)和DCC(0.310g，1.5mmol)。在冷态搅拌2小时后， 使混合物升温至室温并搅拌整夜。过滤混合物并将滤液加到二乙醚中，得到白色粉末。通过 过滤收集产物并在真空下干燥(2.8g，产率93%)。咕NMR谱在2.89ppm(s，2H)处呈现出琥珀 酰亚胺基质子并有普通的主链峰。
[0457] 实施例31:尝试制备Μ-ΡΕ0Ζ-甲磺酸盐
[0459] 按如上所述制备Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2K。将Μ-ΡΕ0Ζ-0Η 2K(1.00gm，0.608mmol)溶解在无水 乙腈(20mL)中并在旋转蒸发器上蒸发至近干。将残余浆料再次溶解在乙腈(20mL)中并通过 旋转蒸发蒸发至近干。加入无水二氯甲烷(5mL)。在缓慢的氩气流下先后加入三乙胺（169.3 yL, 1.215mmol)和甲磺酰氯(84.6yL, 1.094mmol)。溶液在氩气氛下于室温搅拌整夜。通过旋 转蒸发浓缩溶液。通过加到二乙醚中使浓缩溶液沉淀。收集沉淀并在高真空下干燥。产量： 0.6gm<XDCl 3中的NMR表明有-CH2CH2〇Ms(S4.44)的峰，但面积与仅有约50%转化的情况相一 致。-OMs的低取代归因于形成甲磺酸盐后形成噁唑啉盐离子的副反应。CDC1 3中的匪R在δ 5.01(2!1，丨，带正电荷的五员环：-〇-〇12〇12幻和34.44(2!1，丨，相同的五员环：-〇-〇12〇121位 移与-CH2-0MS同）处呈现出峰。
[0460] 实施例32 :Μ-ΡΡ0Ζ-0Η的合成
[0462] 向刚干燥并蒸馏的2-正丙基-2-噁唑啉(0.500g，4.42mmol)与刚干燥并蒸馏的氯 苯(2mL)的混合溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(MeOTf，25. OyL，0.22 lmmo 1)。搅拌10分钟后，将 混合物加热至110 °C并保持20分钟。将混合物冷却至0 °C并用NaOH( 0.044g，1.1 lmmo 1) /甲醇 (2mL)溶液终止。匪R(500MHz，10mg/mL CDC13)在0 · 95ppm( s，3H，CH3CH2CH2CO-)、1 · 65ppm(s， 2H，CH3CH2CH2CO-)、2 · 25ppm(小s)和2 · 34ppm(大s)(总面积3H，CH3CH2CH2CO-)、及3 · 45ppm(s， 4H，-NCH2CH2N-)处呈现出普通的主链峰。引发甲基峰以2 · 94ppm(小）和3 · 03ppm(大)处的两 个单峰出现(CH3-NCH2CH2，总面积3H)。末端亚甲基(-0CH2-OH)出现在3.8ppm处。粗混合物的 GPC 表明 Mn = 1760Da，PD = l.l。
[0463] 实施例33 :Μ-ΡΡ0Ζ-硫代丙酸的合成
[0464]
[0465] 按如上所示用2-丙基-2-噁唑啉（5 · 66mL，50mmo 1)和三氟甲磺酸甲酯（0 · 808mL， 7.14mmol)在氯苯(25mL)中加热至110°C保持25分钟并然后冷却至0°C制备Μ-ΡΕ0Ζ+。为获得 终止试剂，在0 °C下向叔丁醇钾（1.60g，14.3mmol) /氯苯（14mL)悬浮液中逐滴加入3-巯基丙 酸甲酯（3.09mL，28.6mmo 1)。混合物在冷态搅拌2小时后，用注射器逐滴加入Μ-ΡΕ0Ζ+/氯苯 溶液。混合物在冷态搅拌4小时，然后于室温搅拌18小时。加入水（30mL)并通过加入5 %的 HC1水溶液使混合物酸化(pH~3)。用旋转蒸发除去挥发物(包括氯苯）。所得水溶液用H20 (60mL)和固体NaOH(l.43g，35.7mmo 1)稀释。搅拌1小时后，用5%的HC1水溶液使混合物酸 化，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过加到醚中沉淀。轻 轻倒出醚，残余物在真空下干燥得到粘稠而澄清的黄色油。G P C呈现出单个主峰，Μ η为 867Da，PD为1.01XFC表明粗产物含两种不同的物类:M-PPOZ-T-C〇2H(80%)和Μ-ΡΡ0Ζ-Τ-0Η (20%)〇
[0466] 实施例34:M-PE0Z-T-视黄酸的合成
[0467] 将视黄酸（0 · 0102g，0 · 0425mmol)和羟基苯并三唑(HOBt，0 · 0115g，0 · 0849mmol)溶 解在乙腈（10mL)中并用旋转蒸发共沸。将残余物再溶解在二氯甲烷(3mL)中。加入固体DCC (0.0088g，0.0425mmo 1)，混合物搅拌2小时。向混合物中加入M-PEOZ-NH2 4300Da(0.122g， 0.0283mmol)并搅拌40小时。将混合物缓慢加到二乙醚中，得到浅黄色粉末。过滤产物并干 燥，得到〇. 〇823g产物，产率为63 %。
[0468] 实施例35:用M-PE0Z-SCM修饰Ara-C及偶联物活性
[0469] Ρ0Ζ-偶联
[0470] 将M-PEOZ-〇-CH2-C〇2-NHS(M-PEOZ-SCM 5000) (180mg，0.034mmol)溶解在llmL吡啶 中并于0 °C下加到事先溶解在5mL无水P比啶中的胞啼啶阿拉伯糖（Ara-c) ( 5.7mg， 0.023mmo 1)溶液中。所得溶液于室温搅拌72小时。反相HPLC(C-l8柱)表明反应完全。蒸发除 去溶剂后将产物溶解在二氯甲烷(5mL)中并逐滴加到150mL醚中。于4°C离心收集沉淀并在 真空下干燥。产量150mg，产率80%。匪1?呈现出Μ-ΡΕ0Ζ主链的普通峰(见上)及在7.31、7.67、 8.16和8.62ppm处呈现出Ara-C的嘧啶质子峰。将偶联物暴露于pH 8缓冲溶液后显示Ara-C 缓慢释放(24小时后释放15% )，故该偶联物可被视为前药。
[0471 ] 偶联物活性
[0472] 将按标准程序培养的人子宫颈腺癌细胞(HeLa)接种在24孔细胞培养板的各孔中。 24小时后更换新鲜的培养基并用浓度渐增的M-PEOZ-Ara-C或游离的Ara-C(20mM，Ara-C中） 的水溶液处理细胞。将细胞在标准条件下孵育72小时。进行台盼蓝检测确定细胞活力。该检 测发现偶联的Ara-C对Hela细胞有细胞毒性，但比游离的Ara-C的细胞毒性低约30倍，这与 偶联物的缓慢释放过程相一致。与以类似方式制备的PEG-Ara-C的比较表明，PEG-和Ρ0Ζ-偶 联物具有相似的性质。
[0473] 实施例 36:H-PEOZ-S-CH2CH2-C〇2H 的合成
[0474] 在环境温度和氩气下混合氯苯（25mL)与2-乙基-2-噁唑啉（9.92g，0.1mol， 200eq.)并冷却至0°C。搅拌下加入三氟甲磺酸(0.075g，leq.)，反应混合物被搅拌30分钟。 然后将混合物加热至80°C并搅拌7小时。通过使叔丁醇钾（168mg，3eq.)与3-巯基丙酸甲酯 (0.360g，6eq.)在0°C下反应6小时单独制备终止混合物。将终止混合物在0°C下加到聚合反 应中，然后于室温搅拌整夜。然后将溶液与50mL0.25M的氢氧化钠混合并搅拌一小时。分离 水层，用氯化钠饱和，并用二氯甲烷萃取(250mL X 3)。通过旋转蒸发除去二氯甲烷，聚合物 在真空下干燥。
[0475] 所得酸通过DEAE色谱纯化，得到1.5克白色粉末。质子NMR在1 . 12ppm(m，3H， CH3CH2C0-)、2.31ppm(m)和2.41ppm(s)(面积2H，CH3CH2C0-)、及3.47ppm(m，4H，-NCH2CH2N_) 处呈现出普通的主链峰。丙酸酯亚甲基峰出现在2.74、2.81和2.85??111处。6?(：呈现出单个 峰。GPC 给出 Μη为 15，200Da，PD为 1 · 09。
[0476] 前面的描述说明和描述了本公开的化合物和应用的某些实施方案。此外，本公开 仅示出和描述了所述化合物和应用的示例性实施方案，如上面所提到的，应理解本公开的 公开能用于各种其他组合、变型和环境中并能与上面的公开和/或相关领域技能或知识相 适应地在本文中所明确的构思范围内变化和改变。上文中描述的实施方案还意在说明已知 的实施本发明的最佳方式以及使本领域技术人员能以这样或那样的实施方案及本发明的 特定应用或用途所需的各种变型利用本发明。因此，本说明书非意在限制本发明于本文中 所公开的形式。本文中引用的所有参考文献通过引用结合到本文中，就好像完全是本公开 中给出的一样。
【主权项】
1. 一种合成末端活化的聚噁唑啉POZ化合物的方法，所述末端活化的聚噁唑啉POZ化合 物具有基本结构Ri-[N(C0R7)CH 2CH2]n-S-Qq-X，所述方法包括步骤： (a) 引发P0Z聚合以形成在末端上具有带正电荷的阳离子的P0Z聚合物；以及 (b) 用结构为R25S-Dd_X的硫醇盐终止所述P0Z聚合物， 其中， X为活性官能团或能转化为活性官能团的基团； R25为金属； D为连接基团； d和q为1; Q为连接基团； P0Z的各重复单元的R?独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基； Ri是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基；以及 n为从3至1000的整数； 其中， 所述活性官能团能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-P0Z偶联物。2. 如权利要求1所述的方法，其中，X选自由醛、活性碳酸盐(-0-C0-Z)、马来酰亚胺、磺 酸酯(0S02-R 23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸盐、异硫氰酸盐、 硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-C0-Z)和羧酸组成的集合，其 中任何前述基团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R 23为未取代的或取代的烷 基、烯基、炔基、芳烷基或芳基。3. 如权利要求1所述的方法，其中，R7含1-12个碳原子。4. 如权利要求1所述的方法，其中，R?为甲基、乙基或正丙基。5. 如权利要求1所述的方法，其中，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳烷基、 杂环基或芳基、-(CH2 ) m_C0NH- ( CH2 ) m_、_NH- ( CH2 ) m_NHC〇- ( CH2 ) m_、_C〇- ( CH2 ) m_、_C〇-C6H4_、 或-C〇-R8、-(R 15)m-或-(CR3R4)m-，其中m独立地为从1至10的整数，R3、R4、Rii和Ri5各自独立地 选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，R8为-C 6H1Q-CH2-。6. 如权利要求1所述的方法，其中，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结构： (a) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H (b) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2-C02H (c) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] nS-CH2CH2-NH2 (d) CH3- [ N (COCH2CH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H (e) H- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H (f)其中n是从3到1000的整数。7. 如权利要求1所述的方法，其中，R25是Li、Na或者K。8. 如权利要求1所述的方法，其中，所述连接基团D是未取代的或取代的烷基、烯基、杂 环基或芳基，包括但不限于未取代的或取代的烷基、烯基、杂环基、芳基、-(CH 2)b-⑶冊-(CH2) b_、-NH- (CH2) b-NHCO- (CH2) b_、-CO- (CH2) b_、-C0-C6H4-、或-C〇-R26、或-(CR27R28) b，其中， R27和R28各自独立地选自氢或未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基集合，以及R 26为-c6h1〇-CH2-09. 如权利要求1所述的方法，其中，所述活性官能团与靶分子形成水解稳定的连接。 1 〇.根据权利要求1 -9中任一项所述的方法所制备的聚噁唑啉P0Z化合物。11. 一种末端活化的聚噁唑啉P0Z化合物，具有基本结 其中， 所述末端活化的聚噁唑啉P0Z化合物中的所有连接是水解稳定的， X为能与靶分子形成水解稳定的连接以形成靶分子-P0Z偶联物的活性官能团，其中，该 水解稳定的连接不是酯键或者二硫键，所述活性官能团选自由醛、活性碳酸盐(-o-co-z)、 马来酰亚胺、磺酸酯(0S0 2-R23)、酰肼、环氧化物、碘乙酰胺、炔、叠氮化物、异氰酸盐、氰酸 盐、异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈、羰基二咪唑衍生物、乙烯基砜、羧酰卤、活性酯(-C0-Z)和羧 酸组成的集合，其中任何前述官能团都可以是取代的或未取代的，Z为活化基团，以及R 23为 未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基或芳基； Q为连接基团； P0Z的各重复单元的R?独立地选自未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基； R:是氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基； n为从3至1000的整数；以及 q为1〇12. 如权利要求11所述的化合物，其中，所述活性官能团被保护。13. 如权利要求11所述的化合物，其中，R7含1-12个碳原子。14. 如权利要求11所述的化合物，其中，R7为甲基、乙基或正丙基。15. 如权利要求11所述的化合物，其中，连接基团Q是未取代的或取代的烷基、烯基、芳 烷基、杂环基或芳基、_( CH2 ) m_C0NH- ( CH2 ) m_、_NH- ( CH2 ) m_NHC〇- ( CH2 ) m_、_C〇- ( CH2 ) m_、_C〇-C6H4-、或-C〇-R8、-(R 15)m-或-(CR3R4)m-，其中 m 独立地为从 1 至 10 的整数，R3、R4、Rii 和 Ri5 各自 独立地选自氢、或者未取代的或取代的烷基、烯基或芳烷基，Rs为-C6H1Q-CH 2-。16. 如权利要求11所述的化合物，其中，所述末端活化的聚噁唑啉化合物具有如下结 构： (a) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H (b) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2-C02H (c) CH3- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] nS-CH2CH2-NH2 (d) CH3- [ N (COCH2CH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H (e) H- [ N (COCH2CH3) CH2CH2 ] n-S-CH2CH2-C〇2H (f)其中n是从3到1000的整数。17. -种通式为A-B-TM的水解稳定的靶分子-POZ偶联物，其中， A为权利要求11所述的P0Z化合物减去所述P0Z化合物上的活性官能团与靶分子上的结 合对象的反应过程中消除的任何离去基团； TM为靶分子，所述靶分子含所述结合对象，并且所述靶分子选自药物、低聚核苷酸、多 肽、抗体、抗体片段和蛋白质；以及 B为所述活性官能团与所述结合对象间形成的水解稳定的连接，该水解稳定的连接不 是酯键或者二硫键。18. 如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为三氟乙基磺酸酯，所述结合 对象为SH，以及B为硫醚连接。19. 如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为马来酰亚胺，所述结合对象 为SH，以及B为硫醚连接。20. 如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为活性碳酸盐，所述结合对象 为順2,以及B为氨酯连接。21. 如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为活性酯，所述结合对象为NH2， 以及B为酰胺连接。22. 如权利要求17所述的偶联物，其中，所述活性官能团为醛，所述结合对象为NH2,以及 B为胺连接。
【文档编号】C08G73/06GK106046370SQ201610344386
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2008年2月28日
【发明人】J.·米尔顿·哈里斯, 迈克尔·大卫·本特利, 尹君尚, 方志浩, 弗朗西斯科·玛丽亚·委罗内塞
【申请人】塞瑞纳治疗公司