一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒及培养方法
【专利摘要】本发明提供一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，包括试剂盒本体、若干试剂瓶和若干冰袋，若干所述试剂瓶内分别盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子Ⅰ、生长因子Ⅱ、组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液。本发明提供的试剂盒可以从脂肪组织中分离脂肪干细胞，并培养和保存脂肪干细胞，解决了脂肪干细胞分离数量少且纯度低、培养存活率低、培养效率不高、冻存复活率不理想等问题，使脂肪干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化，为利用脂肪干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源，非常适用于培养脂肪干细胞。
【专利说明】
-种用于培养脂肪干细胞的试剂盒及培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于细胞技术领域，尤其设及一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒及培养方 法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，可W不断进行自我更新，并 在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。近年来，干细胞技术被广 泛用于多种疾病的临床试验及治疗中，并且表现出良好的应用前景，逐渐成为近年来新的 医学研究热点之一。
[0003] 脂肪组织中存在一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪干细胞，其具有较高的分 化潜能，可向多个方向进行分化，可W分化为骨、软骨、肌肉、肌腫、初带、神经、肝、内皮和屯、 肌等组织或器官的细胞，医学价值很高。脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，具有 取材容易、不限年龄及时间、少量组织即可获取大量细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小 等优点，而且脂肪来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，具有广阔的临床应用前景。
[0004] 为满足医学研究的需求，大量培养脂肪干细胞成为重要的研究课题，而试验人员 选择的用于分离、培养、保存脂肪干细胞的试剂和方法不够妥当，往往造成了培养的脂肪干 细胞的数量和质量无法达到试验的要求，浪费了人力和其他资源，因此研究一种专口用于 稳定的大量扩增培养脂肪干细胞的试剂盒具有重要意义。现有技术中也公开了一些用于培 养脂肪干细胞的试剂盒，例如CN 104928238A公布了一种用于制备脂肪间充质干细胞的试 剂盒，包括脂肪保存液、脂肪洗涂液、脂肪分解液、细胞洗涂液、细胞培养液、细胞消化液、细 胞冻存液，但此试剂盒培养脂肪干细胞的效果不够理想，存在试剂安全性、稳定性不高，细 胞存活率和增殖率低等问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，包括试 剂盒本体、若干试剂瓶和若干冰袋，所述试剂盒本体包括顶端开口的盒体、与所述盒体较接 的盒盖和设置在盒体内的插托，所述插托与所述盒体的底板平行，其上设有若干个用于放 置所述试剂瓶的插孔，所述插托下方设有与所述盒体的底板平行的缕空隔板，所述缕空隔 板与其下方的所述盒体形成第一空腔，所述第一空腔的侧壁上设有第一开口和与所述第一 开口匹配的第一盖板，所述盒盖由盒盖上板、与所述盒盖上板平行的盒盖下板、连接所述盒 盖上板和所述盒盖下板的盒盖侧壁组成，所述盒盖下板为缕空结构，所述盒盖上板、所述盒 盖下板和所述盒盖侧壁形成第二空腔，所述盒盖侧壁上设有第二开口和与所述第二开口匹 配的第二盖板，若干所述冰袋分别放置在第一空腔和第二空腔内，若干所述试剂瓶内分别 盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子I、生长因子n、组织分解液、细胞 消化液、洗涂液和冻存液。
[0006] 进一步的，所述盒体内设有试剂瓶固定装置，所述试剂瓶固定装置包括固定帽、对 称设于固定帽两侧的第一固定带和所述第二固定带，所述第一固定带的两端分别与所述固 定帽的边沿和所述插托固定连接，所述第二固定带的一端与所述固定帽的边沿固定连接， 另一端通过连接结构与所述插托连接。
[0007] 进一步的，所述试剂盒上还设有溫度监控装置，所述溫度监控装置包括设于试剂 盒内的测溫仪、与所述测溫仪连接的溫度控制器W及与所述溫度控制器连接的报警装置。
[0008] 进一步的，所述试剂盒外表面设有防撞层。
[0009] 进一步的，所述试剂盒外表面与防撞层之间设有保溫层。
[0010] 进一步的，所述盒体与盒盖的连接处设有固定装置，防止运输移动过程中盒盖打 开导致试剂瓶滑落摔碎。
[0011] 进一步的，所述基础培养基为a-MEM培养基溶液，所述a-MEM培养基溶液由a-MEM干 粉培养基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述a-MEM干粉培养基30-50g。
[0012] 进一步的，所述生长因子I为bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)溶液，所述bFGF溶液 化FGF冻干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述bFGF冻干粉8-12yg。
[0013] 进一步的，所述生长因子n为EGF(表皮细胞生长因子)溶液，所述EGF溶液由EGF冻 干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述EGF冻干粉8-12yg。
[0014] 进一步的，所述组织分解液为含1 %胶原酶I型的PBS缓冲液或基础培养基。 [001引进一步的，所述细胞消化液为含0.25%膜酶和0.02%抓14化二胺四乙酸）的口88 缓冲液。
[0016] 进一步的，所述洗涂液为PBS缓冲液。
[0017] 上述PBS缓冲液均为含0.05 %吐溫-20，pH值为7.4的憐酸盐缓冲液。
[0018] 进一步的，所述组织保存液主要是将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤 维素钢、次憐酸钢用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-iffiM干粉培养基 30-50g、所述青霉素1 X 105-2 X 105U、所属链霉素0.1-0.2g、所述径甲基纤维素钢8-12g、所 述次憐酸钢2-5g。上述组织保存液可W有效保持脂肪干细胞活性、提高脂肪干细胞存活率。
[0019] 进一步的，所述组织保存液中还含有班巧酸钢和乳糖醇，每L所述注射用水分别溶 解所述班巧酸钢3-8g、所述乳糖醇0.5-1.5g。在组织保存液中添加班巧酸钢和乳糖醇可W 有效提高组织保存液的稳定性，避免组织保存液产生沉淀、分层和变色等问题，减少其中一 个成分，或变化其中一个成分，组织保存液的稳定性会减弱。
[0020] 进一步的，所述组织保存液中还含有水杨酸钢和淀粉甘醇酸钢，每L所述注射用水 分别溶解所述水杨酸钢2-5g、所述淀粉甘醇酸钢l-3g。在组织保存液中添加水杨酸钢和淀 粉甘醇酸钢可W有效提高组织保存液防止细菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成 分，或变化其中一个成分，都会导致组织保存液抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
[0021 ]进一步的，所述培养基添加剂包括如下重量份的各成分：
[0022] 胎牛血清蛋白15-20乙基甲基纤维素8-12
[0023] 木糖醇5-8 甲酸钢1-3。
[0024] 采用上述培养基添加剂与基础培养基和生长因子混合均匀配置的全培养基培养 脂肪干细胞的增殖效率高、增殖效果好。
[0025] 进一步的，所述培养基添加剂还包括如下重量份的各成分：
[00%] 肉桂醇3-8憐酸醋1-3抗坏血酸钢1-3。
[0027]在培养基添加剂中增加肉桂醇、憐酸醋和抗坏血酸钢可W有效提高配置的全培养 基防止细菌、真菌和病毒感染的能力。
[00%]进一步的，所述培养基添加剂还包括如下重量份的各成分：
[00巧]甘氨酸钢3-8 D-木糖2-5。
[0030] 在培养基添加剂中增加甘氨酸钢和D-木糖可W有效提高配置的全培养基的稳定 性，避免全培养基出现沉淀、分层和变色等问题。
[0031] 进一步的，所述冻存液主要是将a-MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露 聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培 养基30-50g、所述人血白蛋白40-60g、所述二甲基亚讽3-8g、所述甘露聚糖2-5g、所述麦芽 糊精1 -3g、所述生物素0.5-1.5g。
[0032] 上述冻存液的冻存性能较好，脂肪干细胞复苏后存活率较高，而且更利于脂肪干 细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。
[0033] 进一步的，所述冻存液中还含有山梨酸钟和烟酷胺，每L所述注射用水分别溶解所 述山梨酸钟1 -3g、所述烟酷胺0.5-1.5g。
[0034] 在冻存液中加入山梨酸钟和烟酷胺可W降低冻存过程中对细胞造成的伤害，进一 步提高冻存液的冻存性能。
[0035] 本发明还提供一种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
[0036] (1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶中并密封，将所 述试剂盒运输至实验室；
[0037] (2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子I和所述生长因子n按 照重量份数比为1:0.05:1:1的比例混合均匀，配置成全培养基，配好的所述全培养基放置 在4°C的冰箱中保存；
[0038] (3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶中取出20ml含有脂肪组织的组织保存 液，倒入所述洗涂液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成l-2mm3大小 的脂肪碎块；
[0039] (4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震 荡一次，持续15-18min，或者放入培养箱中分解10-15min，再加入步骤(2)配置的所述全培 养基终止分解；
[0040] (5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂 肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
[0041] (6)将步骤巧)所得悬液离屯、，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代 脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1-2X106个/ ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37°C、5%C02的C02培养箱中；
[0042] (7)将步骤(6)所得每=天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长 面积达到80%左右时，先用所述洗涂液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃 培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30-60S，最后加入步骤 (2)配置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代 脂肪干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3-5 X106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪 干细胞按照1:化k例进行传代；
[0043] (8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
[0044] 本发明提供的试剂盒可W从脂肪组织中分离脂肪干细胞，并培养和保存脂肪干细 胞，解决了脂肪干细胞分离数量少且纯度低、培养存活率低、培养效率不高、冻存复活率不 理想等问题，使脂肪干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化，为利用脂 肪干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源，非常适用于培养脂肪干细胞。
【附图说明】
[0045] 图1为本发明实施例1的用于培养脂肪干细胞的试剂盒的结构示意图；
[0046] 图2为本发明实施例2的用于培养脂肪干细胞的试剂盒的结构示意图；
[0047] 图3为图2中A的放大示意图；
[0048] 其中：1试剂瓶；2盒体;3盒盖;4插托;5第一开口； 6第一盖板;7盒盖下板;8盒盖侧 壁;9第二开口； 10第二盖板;11固定帽；12第一固定带；13第二固定带；14连接结构。
【具体实施方式】
[0049] 实施例1
[0050] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，如图1所示，包括试剂盒本体、若干试剂瓶1和 若干冰袋，所述试剂盒本体包括顶端开口的盒体2、与所述盒体2较接的盒盖3和设置在盒体 2内的插托4,所述插托4与所述盒体2的底板平行，其上设有若干个用于放置所述试剂瓶1的 插孔，所述插托4下方设有与所述盒体2的底板平行的缕空隔板，所述缕空隔板与其下方的 所述盒体2形成第一空腔，所述第一空腔的侧壁上设有第一开口 5和与所述第一开口 5匹配 的第一盖板6，所述盒盖3由盒盖上板、与所述盒盖上板平行的盒盖下板7、连接所述盒盖上 板和所述盒盖下板7的盒盖侧壁8组成，所述盒盖下板7为缕空结构，所述盒盖上板、所述盒 盖下板7和所述盒盖侧壁8形成第二空腔，所述盒盖侧壁8上设有第二开口 9和与所述第二开 口9匹配的第二盖板10,若干所述冰袋分别放置在第一空腔和第二空腔内，若干所述试剂瓶 1内分别盛装有组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子I、生长因子n、组织分解 液、细胞消化液、洗涂液和冻存液。
[0化1]实施例2
[0052] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，如图2所示，与实施例1不同的是:所述盒体2 内设有试剂瓶固定装置，所述试剂瓶固定装置包括固定帽11、对称设于固定帽两侧的第一 固定带12和所述第二固定带13,所述第一固定带12的两端分别与所述固定帽11的边沿和所 述插托4固定连接，所述第二固定带13的一端与所述固定帽11的边沿固定连接，另一端通过 连接结构14与所述插托4连接，所述连接结构包括设在所述第二固定带13上的母扣和设在 所述插托4上的与所述母扣匹配的公扣。
[0化3]实施例3
[0054] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢用注射用水溶解而成，每L 所述注射用水分别溶解所述a-MBl干粉培养基30g、所述青霉素1 X 105U、所属链霉素0.1 g、 所述径甲基纤维素钢8g、所述次憐酸钢2g。
[0化5] 实施例4
[0056] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢用注射用水溶解而成，每L 所述注射用水分别溶解所述a-MBl干粉培养基50g、所述青霉素2 X 105U、所属链霉素0.2g、 所述径甲基纤维素钢12g、所述次憐酸钢5g。
[0化7] 实施例5
[0058] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢用注射用水溶解而成，每L 所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、所属链霉素 〇.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g。
[0化9] 实施例6
[0060] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、班巧酸钢、乳糖醇用注射 用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基30g、所述青霉素1 X 105U、 所属链霉素 O.lg、所述径甲基纤维素钢8g、所述次憐酸钢2g、所述班巧酸钢3g、所述乳糖醇 0.5g〇
[0061 ] 实施例7
[0062] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、班巧酸钢、乳糖醇用注射 用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基50g、所述青霉素2X105U、 所属链霉素〇.2g、所述径甲基纤维素钢12g、所述次憐酸钢5g、所述班巧酸钢8g、所述乳糖醇 1.5邑。
[0063] 实施例8
[0064] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、班巧酸钢、乳糖醇用注射 用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、所属链霉素0.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g、所述班巧酸钢5g、所述 乳糖醇1邑。
[00化]实施例9
[0066] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、班巧酸钢、乳糖醇、水杨 酸钢、淀粉甘醇酸钢用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-iffiM干粉培养 基30g、所述青霉素1X105U、所属链霉素 O.lg、所述径甲基纤维素钢8g、所述次憐酸钢2g、所 述班巧酸钢3g、所述乳糖醇0.5g、所述水杨酸钢2g、所述淀粉甘醇酸钢Ig。
[0067] 实施例10
[0068] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、水杨酸钢、淀粉甘醇酸钢 用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-iffiM干粉培养基50g、所述青霉素2 X105U、所属链霉素0.2g、所述径甲基纤维素钢12g、所述次憐酸钢5g、所述水杨酸钢5g、所 述淀粉甘醇酸钢3g。
[0069] 实施例11
[0070] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、水杨酸钢、淀粉甘醇酸钢 用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素 1.5X105U、所属链霉素0.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g、所述水杨酸钢 3g、所述淀粉甘醇酸钢2g。
[OOW 实施例12
[0072] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0073] 胎牛血清蛋白15g 乙基甲基纤维素8g
[0074] 木糖醇5g 甲酸钢Ig。
[00对实施例13
[0076] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0077] 胎牛血清蛋白20g 乙基甲基纤维素12g
[007引木糖醇8g 甲酸钢3g。
[0079] 实施例14
[0080] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0081 ]胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素 lOg
[0082] 木糖醇6g 甲酸钢2g。
[0083] 实施例15
[0084] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分； 贻半血清蛋白1员g 乙基甲基纤维素8g 木糖醇5g 甲酸钢Ig
[0085] 肉桂醇始 憐酸酷Ig 抗坏血酸钢Ig。
[00化]实施例16
[0087] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分： 胎牛血清蛋白2Qg 玄基甲基纤维素12g 木糖醇8g 甲酸钢3g
[008引 肉崔醇始 磯酸醋始 抗坏血酸钢3g。
[0089] 实施例17
[0090] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分； 胎牛血清蛋白I8g 乙基甲基纤雞素10呂 木糖醇6g 甲酸钢2g
[0091] 肉桂醇始 憐酸醋2g 抗坏血酸钢雖。
[0092] 实施例18
[0093] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分； 胎牛血清蜜白巧g 古基甲基纤维素8g 木繼醇％ 甲酸钢Ig
[0094] 肉桂醇3g 憐酸廳Ig 抗坏血酸钢Ig 甘氨酸钢3g D-木糖2g。
[0095] 实施例19
[0096] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分：
[0097] 胎牛血清蛋白20g 乙基甲基纤维素12g
[009引木糖醇8g 甲酸钢3g
[0099] 甘氨酸钢8g D-木糖5g。
[0100] 实施例20
[0101] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分：
[0102] 胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素 lOg
[0103] 木糖醇6g 甲酸钢2g
[0104] 甘氨酸钢5g D-木糖3g。
[010引实施例21
[0106] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而 成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基30g、所述人血白蛋白40g、所述二甲基 亚讽3g、所述甘露聚糖2g、所述麦芽糊精1 g、所述生物素0.5g。
[0107] 实施例22
[0108] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而 成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基50g、所述人血白蛋白60g、所述二甲基 亚讽8g、所述甘露聚糖5g、所述麦芽糊精3g、所述生物素1.5g。
[0109] 实施例23
[0110] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而 成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基 亚讽5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素 Ig。
[0川]实施例24
[0112] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钟、烟酷胺 用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基30g、所述人血白蛋 白40g、所述二甲基亚讽3g、所述甘露聚糖2g、所述麦芽糊精Ig、所述生物素0.5g、所述山梨 酸钟Ig、所述烟酷胺〇.5g。
[0113] 实施例25
[0114] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钟、烟酷胺 用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基50g、所述人血白蛋 白60g、所述二甲基亚讽8g、所述甘露聚糖5g、所述麦芽糊精3g、所述生物素1.5g、所述山梨 酸钟3g、所述烟酷胺1.5g。
[011引实施例26
[0116] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钟、烟酷胺 用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋 白50g、所述二甲基亚讽5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素 Ig、所述山梨酸 钟2g、所述烟酷胺Ig。
[0117] 实施例27
[0118] -种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
[0119] (1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中并密封，将 所述试剂盒运输至实验室；
[0120] (2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子I和所述生长因子n按 照重量份数比为1:0.05:1:1的比例混合均匀，配置成全培养基，所述基础培养基为a-MEM培 养基溶液，所述生长因子I为bFGF溶液，所述生长因子n为EGF溶液，配好的所述全培养基放 置在4°C的冰箱中保存；
[0121] (3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中取出20ml含有脂肪组织的组织保 存液，倒入所述洗涂液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成1mm3大小 的脂肪碎块；
[0122] (4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震 荡一次，持续15min，或者放入培养箱中分解lOmin，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终 止分解；
[0123] (5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂 肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
[0124] (6)将步骤巧)所得悬液离屯、，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代 脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照IX 106个/ml 的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37°C、5%C02的C02培养箱中；
[0125] (7)将步骤(6)所得每=天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长 面积达到80%左右时，先用所述洗涂液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃 培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30s，最后加入步骤(2)配 置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪 干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3 X106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞 按照1:化k例进行传代；
[0126] (8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
[0127] 实施例28
[01%] -种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
[0129] (1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中并密封，将 所述试剂盒运输至实验室；
[0130] (2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子I和所述生长因子n按 照重量份数比为1:0.05:1:1的比例混合均匀，配置成全培养基，所述基础培养基为a-MEM培 养基溶液，所述生长因子I为bFGF溶液，所述生长因子n为EGF溶液，配好的所述全培养基放 置在4°C的冰箱中保存；
[0131] (3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中取出20ml含有脂肪组织的组织保 存液，倒入所述洗涂液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成2mm3大小 的脂肪碎块；
[0132] (4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震 荡一次，持续18min，或者放入培养箱中分解15min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终 止分解；
[0133] (5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂 肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
[0134] (6)将步骤巧)所得悬液离屯、，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代 脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照2X106个/ml 的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37°C、5%C02的C02培养箱中；
[0135] (7)将步骤(6)所得每=天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长 面积达到80%左右时，先用所述洗涂液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃 培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化60s，最后加入步骤(2)配 置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪 干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为5 X106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞 按照1:化k例进行传代；
[0136] (8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
[0137] 实施例29
[0138] -种培养脂肪干细胞的方法，包括如下步骤：
[0139] (1)无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中并密封，将 所述试剂盒运输至实验室；
[0140] (2)将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子I和所述生长因子n按 照重量份数比为1:0.05:1:1的比例混合均匀，配置成全培养基，所述基础培养基为a-MEM培 养基溶液，所述生长因子I为bFGF溶液，所述生长因子n为EGF溶液，配好的所述全培养基放 置在4°C的冰箱中保存；
[0141] (3)从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶1中取出20ml含有脂肪组织的组织保 存液，倒入所述洗涂液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成1.5mm3大 小的脂肪碎块；
[0142] (4)将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震 荡一次，持续16min，或者放入培养箱中分解12min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基终 止分解；
[0143] (5)将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂 肪组织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液；
[0144] (6)将步骤巧)所得悬液离屯、，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代 脂肪干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1.5 X 106个/ ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37°C、5%C02的C02培养箱中；
[0145] (7)将步骤(6)所得每=天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长 面积达到80%左右时，先用所述洗涂液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃 培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化40s，最后加入步骤(2)配 置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪 干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为4 X106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细胞 按照1:化k例进行传代；
[0146] (8)重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
[0147] 对照例1
[0148] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-iffiM干粉培养基、青霉素、链霉素、次憐酸钢用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分 别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、所属链霉素0.15g、所述次憐酸钢 3g〇
[0149] 对照例2
[0150] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、肝素钢用注射用水溶解而成，每L所 述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、所属链霉素0.15g、 所述径甲基纤维素钢1 Og、所述肝素钢3g。
[0151] 对照例3
[0152] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-iffiM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、班巧酸钢用注射用水溶 解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、所属 链霉素〇.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g、所述班巧酸钢5g。
[0153] 对照例4
[0154] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、海藻酸锭、乳糖醇用注射 用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、所属链霉素0.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g、所述海藻酸锭5g、所述 乳糖醇1邑。
[0155] 对照例5
[0156] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-iffiM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、淀粉甘醇酸钢用注射用 水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X 105U、 所属链霉素〇.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g、所述淀粉甘醇酸钢2g。
[0157] 对照例6
[0158] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述组织保存液主要是 将a-MEM干粉培养基、青霉素、链霉素、径甲基纤维素钢、次憐酸钢、水杨酸钢、抗坏血酸钢用 注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述青霉素1.5 X105U、所属链霉素0.15g、所述径甲基纤维素钢lOg、所述次憐酸钢3g、所述水杨酸钢3g、所 述抗坏血酸钢2g。
[0159] 对照例7
[0160] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0161] 胎牛血清蛋白18g乙基甲基纤维素 lOg
[0162] 甲酸钢2g。
[0163] 对照例8
[0164] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[01化]胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素 lOg
[0166] 海藻糖6g 甲酸钢2g。
[0167] 对照例9
[0168] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0169] 胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素 lOg
[0170] 木糖醇6g 甲酸钢2g
[0171] 肉桂醇5g 憐酸醋2g。
[0172] 对照例10
[0173] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分； 腊半血清蛋白巧g 乙基巧基舒雞素 lOg 木糖醇6g 甲酸钢2g
[0174] 肉桂醇5g 油酸钢2g 抗坏血酸钢2g。
[0175] 对照例11
[0176] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0177] 胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素 lOg
[017引木糖醇6g 甲酸钢2g
[0179] 甘氨酸钢5g。
[0180] 对照例12
[0181] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述培养基添加剂包括 如下重量的各成分；
[0182] 胎牛血清蛋白18g 乙基甲基纤维素 lOg
[0183] 木糖醇6g 甲酸钢2g
[0184] 乙酷胺5g D-木糖3g。
[0185] 对照例13
[0186] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、生物素用注射用水溶解而成，每L所述 注射用水分别溶解所述曰干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚讽5g、所 述甘露聚糖3g、所述生物素 Ig。
[0187] 对照例14
[0188] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、葡聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水溶解而成， 每L所述注射用水分别溶解所述a-iffiM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所述二甲基亚 讽5g、所述葡聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素 Ig。
[0189] 对照例15
[0190] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、山梨酸钟用注射用 水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-MEM干粉培养基40g、所述人血白蛋白50g、所 述二甲基亚讽5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素 Ig、所述山梨酸钟2g。
[0191] 对照例16
[0192] -种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是:所述冻存液主要是将a- MEM干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚讽、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素、对径基苯甲酸丙醋 钢、烟酷胺用注射用水溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述a-iffiM干粉培养基40g、所 述人血白蛋白50g、所述二甲基亚讽5g、所述甘露聚糖3g、所述麦芽糊精2g、所述生物素 Ig、 所述对径基苯甲酸丙醋钢2g、所述烟酷胺Ig。
[0193] 组织保存液对脂肪干细胞存活率的影响分析：
[0194] 将相同数量的脂肪干细胞分别放入实施例5、对照例1、对照例2的组织保存液和 CN104928238A的脂肪保存液中，置于灭菌的西林瓶中，在4°C下保存240小时，期间分别于第 12h、2地、4她、96h、24化时观察脂肪干细胞形态，并用台吩兰染色计数脂肪干细胞存活率， 试验结果见表1。
[01M]表1组织保存液对脂肪干细胞存活率的影响
[0196]
[0197] 其中:A表示细胞分散度好、大小均匀、形态不变、轮廓清晰；
[0198] B表示细胞体积变大、大小不等、轮廓模糊、出现楠圆或不规则等异常形态。
[0199] 上述试验结果表明，采用本发明提供的组织保存液保存脂肪干细胞的效果与对比 试验1-2的组织保存液和CN104928238A的脂肪保存液相比，其保存的脂肪干细胞存活率明 显较高，且脂肪干细胞的形态也保持得更好，由此可知本发明提供的的组织保存液可W有 效保持脂肪干细胞活性、提高脂肪干细胞存活率。
[0200] 组织保存液稳定性评价：
[0201 ] 取实施例5、实施例8、对照例3-4的组织保存液，均在溫度40°C ±2°C下，相对湿度 为75% ±5%的条件下放置12个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别 取样一次，检测组织保存液的性状和色泽，试验结果见表2。
[0202]表2组织保存液稳定性评价
[0203]
[0204] 其中：表示没有，" V "表示有。
[02化]比较实施例8与实施例5和对照例3-4的组织保存液的稳定性状况可知，在组织保 存液中添加班巧酸钢和乳糖醇可W有效提高组织保存液的稳定性，避免组织保存液产生沉 淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，组织保存液的稳定性会 减弱。
[0206] 组织保存液安全性评价：
[0207] 取实施例5、实施例11、对照例5-6的组织保存液，均在溫度40°C ±2°C下，相对湿度 为75% ±5%的条件下放置12个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别 取样一次，检测组织保存液中细菌、真菌和病毒的感染情况，检验结果见表3。
[0208] 表3组织保存液安全性评价
[0209]
[0210] 其中：表示"没嘗V'V "表示"嘗'。
[0211] 比较实施例11与实施例5、对照例5-6的组织保存液的细菌、真菌和病毒的感染状 况可知，在组织保存液中添加水杨酸钢和淀粉甘醇酸钢可W有效提高组织保存液防止细 菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致组织保存 液抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
[0212] 培养基添加剂对全培养基增殖能力的影响分析
[0213] 将实施例14、对照例7、对照例8的培养基添加剂分别按照实施例27的培养脂肪干 细胞的方法配置全培养基，再将上述全培养基和CN104928238A的细胞培养液分别按照实施 例27的培养脂肪干细胞的方法培养扩增脂肪干细胞，采用台吩蓝经典染色法对细胞进行计 数，分别统计原代、第3代、第6代和第9代活脂肪干细胞的数量，结果见表4。
[0214] 表4脂肪干细胞体外培养扩增效果评价
[0215]
[0216] 由上述结果可W得出，采用本发明提供的培养基添加剂配置的全培养基培养脂肪 干细胞的增殖速度明显高于CN104928238A的细胞培养液，也优于采用对照例7和对照例8的 培养基添加剂配置的全培养基。
[0217] 培养基添加剂对全培养基安全性的影响分析
[0218] 取实施例14、实施例17、对照例9、对照例10的培养基添加剂分别按照实施例27的 培养脂肪干细胞的方法在无菌条件下配置全培养基，将上述全培养基均在溫度-4 °C±2°C 下，相对湿度为60% ±5%的条件下放置1个月后，检测全培养基中细菌、真菌和病毒的感染 情况，实施例17的培养基添加剂配置的全培养基中未发现细菌、真菌和病毒，而实施例14、 对照例9、对照例10的培养基添加剂配置的全培养基中均发现了细菌、真菌和病毒中的一种 或几种。
[0219] 由上述试验结果可知，在培养基添加剂中增加肉桂醇、憐酸醋和抗坏血酸钢可W 有效提高全培养基防止细菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个 成分，都会导致配置的全培养基抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
[0220] 培养基添加剂对全培养基稳定性的影响分析
[0221] 取实施例14、实施例20、对照例11、对照例12的培养基添加剂分别与a-iffiM培养基 溶液、bFGF、EGF混合配置成全培养基，将上述全培养基均在溫度-4°C ± 2°C下，相对湿度为 60% ±5%的条件下放置6个月后，检测全培养基的性状和色泽，实施例20的培养基添加剂 配置的全培养基的形状和色泽未发生明显变化，而实施例14、对照例11、对照例12的培养基 添加剂配置的全培养基均出现了少量沉淀或分层现象。
[0222] 由上述试验结果可知，在培养基添加剂中增加甘氨酸钢和D-木糖可W有效提高全 培养基的稳定性，避免全培养基出现沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化 其中一个成分，配置的全培养基的稳定性会减弱。
[0223] 冻存液对脂肪干细胞冻存性能的影响分析
[0224] 收集实施例27制得的P2代脂肪干细胞，将细胞重悬混匀后，进行细胞计数，将所需 的细胞悬液分装至离屯、管中离屯、去除上清液，收集细胞沉淀，分别加入1.5mL实施例23、实 施例26、对照例13-16的冻存液和CN104928238A的细胞冻存液重悬后加入2mL细胞冻存管 中，并控制细胞数量为1 X 106个/mL迅速将细胞冻存管转移至已加好异丙醇的细胞程序降 溫盒中，放入-80°C超低溫冰箱2~3天后，将细胞冻存管转移至液氮保存;一个月后进行细 胞复苏，将保存于液氮中的细胞冻存管取出，转移至37°C水浴锅中迅速解冻，用移液管将细 胞转入之前预溫好的lOmL按照实施例27的方法配置的全培养基中，轻轻吹打混匀后，取 0.5mL细胞悬液检测细胞存活率和细胞形态变化情况，实验结果见表5。
[0225]表5冻存液对脂肪干细胞冻存性能的影响
L 〇227」将买施例2 3、买施例2 6的冻巧汲的冻巧巧能与对脫例13、对脫例14的冻巧汲和 CN104928238A的细胞冻存液的冻存性能相比，可W得出本发明提供的冻存液的冻存性能相 对更好，脂肪干细胞复苏后存活率较高，而且更利于脂肪干细胞冻存前后细胞形态的维持 和稳定。
[02%]实施例26的冻存液的冻存性能比实施例23、对照例15、对照例16的冻存液的冻存 性能更佳，说明在冻存液中加入山梨酸钟和烟酷胺可W降低冻存过程中对细胞造成的伤 害，进一步提高冻存液的冻存性能。
[0229]最后应说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照 较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括试剂盒本体、若干 试剂瓶(1)和若干冰袋，所述试剂盒本体包括顶端开口的盒体(2)、与所述盒体(2)铰接的盒 盖(3)和设置在盒体(2)内的插托(4)，所述插托(4)与所述盒体(2)的底板平行，其上设有若 干个用于放置所述试剂瓶（1)的插孔，所述插托(4)下方设有与所述盒体(2)的底板平行的 镂空隔板，所述镂空隔板与其下方的所述盒体(2)形成第一空腔，所述第一空腔的侧壁上设 有第一开口（5)和与所述第一开口（5)匹配的第一盖板(6)，所述盒盖(3)由盒盖上板、与所 述盒盖上板平行的盒盖下板(7)、连接所述盒盖上板和所述盒盖下板(7)的盒盖侧壁(8)组 成，所述盒盖下板(7)为镂空结构，所述盒盖上板、所述盒盖下板(7)和所述盒盖侧壁(8)形 成第二空腔，所述盒盖侧壁(8)上设有第二开口（9)和与所述第二开口（9)匹配的第二盖板 (10)，若干所述冰袋分别放置在第一空腔和第二空腔内，若干所述试剂瓶(1)内分别盛装有 组织保存液、基础培养基、培养基添加剂、生长因子I、生长因子Π 、组织分解液、细胞消化 液、洗涤液和冻存液。2. 根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述组织保存液 主要是将α-ΜΕΜ干粉培养基、青霉素、链霉素、羟甲基纤维素钠、次磷酸钠用注射用水溶解而 成，每L所述注射用水分别溶解所述α-ΜΕΜ干粉培养基30-50g、所述青霉素1 X 105-2 X 105U、 所属链霉素0.1-0.2g、所述羟甲基纤维素钠8-12g、所述次磷酸钠2-5g。3. 根据权利要求2所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述组织保存液 中还含有琥珀酸钠和乳糖醇，每L所述注射用水分别溶解所述琥珀酸钠3-8g、所述乳糖醇 0·5-1·5g〇4. 根据权利要求2所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述组织保存液 中还含有水杨酸钠和淀粉甘醇酸钠，每L所述注射用水分别溶解所述水杨酸钠2-5g、所述淀 粉甘醇酸钠 l_3g。5. 根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述培养基添加 剂包括如下重量份的各成分： 胎牛血清蛋白15-20乙基甲基纤维素8-12 木糖醇5-8 甲酸钠1-3。6. 根据权利要求5所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述培养基添加 剂还包括如下重量份的各成分： 肉桂醇3-8磷酸酯1-3抗坏血酸钠1-3。7. 根据权利要求5所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述培养基添加 剂还包括如下重量份的各成分： 甘氨酸钠3-8 D-木糖2-5。8. 根据权利要求1所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述冻存液主要 是将α-ΜΕΜ干粉培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜、甘露聚糖、麦芽糊精、生物素用注射用水 溶解而成，每L所述注射用水分别溶解所述α-ΜΕΜ干粉培养基30-50g、所述人血白蛋白40-60g、所述二甲基亚砜3-8g、所述甘露聚糖2-5g、所述麦芽糊精l-3g、所述生物素0.5-1.5g。9. 根据权利要求8所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒，其特征在于:所述冻存液中还 含有山梨酸钾和烟酰胺，每L所述注射用水分别溶解所述山梨酸钾l_3g、所述烟酰胺0.5-1.5g〇10.-种应用权利要求1-9任一所述的用于培养脂肪干细胞的试剂盒培养脂肪干细胞 的方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤： (1) 无菌收集脂肪组织，放入盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶（1)中并密封，将所 述试剂盒运输至实验室； (2) 将所述基础培养基、所述培养基添加剂、所述生长因子I和所述生长因子Π 按照重 量份数比为1:0.05:1:1的比例混合均匀，配置成全培养基，配好的所述全培养基放置在4°C 的冰箱中保存； (3) 从盛装有所述组织保存液的所述试剂瓶（1)中取出20ml含有脂肪组织的组织保存 液，倒入所述洗涤液，洗去血污，获得脂肪组织，将所述脂肪组织用眼科剪剪成l_2mm 3大小 的脂肪碎块； (4) 将步骤(3)获得的所述脂肪碎块加入所述组织分解液中，水浴震荡，每3min震荡一 次，持续15_18min，或者放入培养箱中分解10-15min，再加入步骤(2)配置的所述全培养基 终止分解； (5) 将步骤(4)所得反复吹打，混匀细胞浆，先用100目的细胞筛过滤掉未分解的脂肪组 织，再用300目的细胞筛过滤掉成熟脂肪组织，收集悬液； (6) 将步骤(5)所得悬液离心，弃掉上层清液，得脂肪干细胞单细胞悬液，记为P0代脂肪 干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养基将P0代脂肪干细胞重悬，再按照1-2X10 6个/ml的 密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37°C、5%0)2的0)2培养箱中； (7) 将步骤(6)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到脂肪干细胞生长面积 达到80%左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养 瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30-60S，最后加入步骤(2)配 置的所述全培养基终止消化，所得脂肪干细胞记为P1代脂肪干细胞，取出一部分P1代脂肪 干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3-5 X106个/ml冻存液，剩余P1代脂肪干细 胞按照1:3比例进行传代； (8) 重复步骤(7)，将脂肪干细胞进行多次的培养和传代。
【文档编号】C12N5/0775GK106047702SQ201610671756
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月15日 公开号201610671756.8, CN 106047702 A, CN 106047702A, CN 201610671756, CN-A-106047702, CN106047702 A, CN106047702A, CN201610671756, CN201610671756.8
【发明人】张晓南, 吴芳春, 陈虎, 侍晓云, 张斌
【申请人】北京昱龙盛世生物科技有限公司