一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用，该方法为将编码膜蛋白Cbei_3304的基因进行插入失活后，使此基因在拜氏梭菌中不能正常表达即可。本发明所得的高产电重组菌株葡萄糖种子液中，以甲基紫精为电子介体时，最大输出电压高达409mV，最大输出功率密度为 144.4mW/m2。本发明的工艺简单、操作方便、无污染、成本低，其燃料利用普较广，电子回收率较高，缓解了能源危机；本发明高产电拜氏梭菌是一株适合于微生物燃料电池研究及应用的优良菌株。
【专利说明】
-种提高拜氏梭菌产电的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于环境与新能源技术领域，具体设及一种提高拜氏梭菌产电的方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 随着经济全球化的快速发展，各国对能源需求日益扩大，能源枯竭成为世界的难 题，在面临运一问题时，科学家已经将眼光投入一个庞大家族一-微生物。利用微生物产 电，来解决能源短缺问题。目前，微生物燃料电池 (Microbial Fuel Cell,MFC)技术日益成 熟，并得到重视。
[0003] 然而，微生物的产电能力相差甚远，产电微生物却决定中微生物燃料电池的功能 及应用。经报道，高产电的微生物依旧主要集中在希瓦氏菌属和地杆菌属 (Geobacter)(Ene;rgy Elnviron. Sci 2011, 4, 4366-4379)等一些革兰氏阴性菌。而在 拜氏梭菌等革兰氏阳性菌中报道甚少，Sophie Peguin等人（Biotechnology and Bioengineering, Vol. 51，Pp. 342-348 (1996))利用S电极系统研究了丙酬下醇梭菌 在甲基紫精作为电子介体的情况下的微生物燃料电池产电情况；Liu Jun等人 (Biotechnology Lett，2015，37:95-100)也利用0.15g/L甲基紫精作为电子介体，Ig/L葡 萄糖作为碳源时获得最大电压230mV，最大输出功率密度79.2 mW/m2。可见，拜氏梭菌等革 兰氏阳性菌在微生物燃料电池中的应用日益引起了重视。
[0004] 已知微生物的自身产电能力严重阻碍了 MFC技术的发展，然而通过基因工程改造 菌体，能够加速细胞的代谢，提高电子传递速率及数量。基于此，基因工程手段对促进微生 物燃料电池的发展及产业化应用将具有可观前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种提高拜氏梭菌产电的方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种高活性产电能力的拜氏梭菌在制备微生物燃料 电池中的应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 一种提高拜氏梭菌产电的方法，将拜氏梭菌蛋白化ei_3304的功能进行缺失。
[000引进一步的，上述所述方法，使拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因不能正常表 达。
[0009] 进一步的，上述所述方法，将拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因进行插入失 活。
[0010] 进一步的，上述所述方法，将编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No:l所示。 [0011 ]进一步的，上述拜氏梭菌为beijerinc知'i NCIMB 8052。
[0012] -种高产电拜氏梭菌在产电中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白 Cbei_3304功能的拜氏梭菌。
[0013] -种高产电拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺 失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。
[0014] 进一步的，所述高产电拜氏梭菌为上述所述方法制备得到的拜氏梭菌。
[0015] 进一步的，上述高产电拜氏梭菌W葡糖糖、木糖、薦糖、果糖或淀粉为电子供体， 进一步的，上述高产电拜氏梭菌W甲基紫精、亚甲基蓝、或蔥酿-2,6-二横酸钢作为电 子介体。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明通过将拜氏梭菌中编码膜蛋白的化ei_3304基因进行插入失活，使得此基因不 能正常表达，从而达到提高拜氏梭菌产电能力的目的。本发明提供了一种简单、高效的提高 拜氏梭菌产电的方法，借助此方法得到的重组菌株在1 g/L葡萄糖种子液中，0.4 g/L(最佳 浓度）甲基紫精（MV)为电子介体时，最大输出电压高达409mV，比初始菌株CJostric/ium Aeijerinc知'i NCIMB 8052提高了3.13倍，最大输出功率密度为144.4mW/m2，比初始菌株 C/ostric/ium beijerinc知'i NCIMB 8052提高了1.71 倍（8052-MFC中最佳甲基紫精浓度为 O.lg/L)。
[0017] 本发明的工艺简单、操作方便、无污染、成本低，其燃料利用普较广，电子回收率较 高，缓解了能源危机，本发明高产电拜氏梭菌是一株适合于微生物燃料电池研究及应用的 优良菌株。
【附图说明】
[001引图1为本发明插入失活载体pWJ的质粒图谱； 图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图； 图3为转化子菌落PCR电泳图； 图4为本发明拜氏梭菌3304在Ig/L葡萄糖中的产电活性图； 图5为初始菌株NCIMB 8052在Ig/L葡萄糖中的产电活性图； 图6为本发明高产电拜氏梭菌与初始菌株NCIMB 8052利用Ig/L葡萄糖为燃料的产电情 况。
【具体实施方式】
[0019] 一种提高拜氏梭菌产电的方法，将拜氏梭菌蛋白Cbei_3304的功能进行缺失。
[0020] 优选的，上述所述方法，使拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因不能正常表达。
[0021] 优选的，上述所述方法，将拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因进行插入失活。
[0022] 优选的，上述所述方法，将编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No:l所示。
[0023] 优选的，上述拜氏梭菌为beijerinc知'i NCIMB 8052。
[0024] -种高产电拜氏梭菌在产电中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白 Cbei_3304功能的拜氏梭菌。
[0025] 优选的，所述高产电拜氏梭菌为上述所述方法制备得到的拜氏梭菌。
[0026] -种高产电拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺 失正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。
[0027] 优选的，所述高产电拜氏梭菌为上述所述方法制备得到的拜氏梭菌。
[0028] 优选的，上述高产电拜氏梭菌W葡糖糖、木糖、薦糖、果糖或淀粉为电子供体， 优选的，上述高产电拜氏梭菌W甲基紫精、亚甲基蓝、或蔥酿-2,6-二横酸钢作为电子 介体。
[0029] 优选的，上述高产电拜氏梭菌经过双室MFC进行产电。
[0030] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0031] 实施例1 拜氏梭菌化ei_3304基因插入失活突变株的构建 构建拜氏梭菌Cbei_3304基因插入失活突变株的原理如图2所示，具体构建过程包括W 下步骤： (DCbei_3304插入失活载体的构建 1)设计内含子 根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的化ei_3304基因序列（如SEQ ID No:l所示），借助软 件设计合适的插入基因位点化^9://丽￥.(：1〇3付〇]1.(3〇1]1)，选择插入在第101-102个碱基之 间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-304(其序列如SEQ ID N0:2所示），并设计W下引 物。
[00创克隆引物： pWJ-OSC-304-S ： 5' - ggagtgtcgaggatcctcgaga1:aattatcct1:acacttcgcc _3'，其序列 如沈Q ID NO:3所示； pWJ-OSC-304-A ： 5' - ggttctcctacagattg1:acaaatgtggtga1:aacagataag _3'，其序列如 沈Q ID NO:4所示。
[00削验证引物； Cbei-3304-T-S:5'-1:aaattacctacagcaaaactgtg-3'，序列如沈Q ID N0:5所示； Cbei-3304-T-A:5'-ggaattaagaaccttgaatc1:atc-3'，序列如沈Q ID N0:6所示。
[0034] 引物pWJ-OSC-304-S引入趾〇1酶切位点（下划线部分），引物pWJ-OSC-304-A引入 BsrGI酶切位点（下划线部分）。
[0035] 2)Cbei_3304-pWJ-304重组载体构建 用化0巧邮srGI双酶切载体pWJ，pWJ质粒图谱如图1所示，其序列如SEQ ID N0:7所示。 酶切产物经纯化试剂盒(Takara)纯化后，与内含子序列S-304通过一步克隆（Clo址xpress) 连接。将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌E. 0册曰，涂布到含有50iig/ml氨节 霉素抗性LB平板，37 °C培养12~16h，挑取转化子，接到液体含有50iig/ml氨节霉素 LB培养 基中，37°C、200巧m培养12h，提取重组质粒(AXYGEN)，测序验证，获得Cbei_3304-pWJ-304重 组载体。
[0036] 3)Cbei_3304-pWJ-304重组载体的甲基化 制备E. Top 10/PAN2的化学感受态，将测序成功的化ei_3304-pWJ-304重组载体 转化到大肠杆菌E. Top 10,由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有50]ig/ml氨 节霉素和lOiig/ml四环素双抗性LB平板，37 °C培养12~16h，挑取转化子，接到液体含有50y g/ml氨节霉素和1化g/ml四环素 LB培养基中，37°C、200巧m培养12h，提取甲基化的饥ei_ 3304-PWJ-304重组载体(pAN2质粒含有一个枯草芽抱杆菌隧菌体基因，能编码甲基转移酶， 能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化），即Cbei_3304插入失活载体。
[0037] (2)饥ei_3304插入失活载体转化拜氏梭菌（C7ostric/it/m 6eije_ri/3c知'i NCIMB 8052) 1)将C/ostric/ium beijeri円cAii NCIMB 8052接种至YPS培养基(酵母粉 3g/L，蛋白 腺5g/L，葡萄糖Ig/L，乙酸锭2g/L，氯化钢3g/L，屯水合硫酸儀3g/L，憐酸二氨钟Ig/L，憐 酸氨二钟Ig/L，屯水合硫酸亚铁0.1 g/L，pH=6。）37°C过夜培养，次日W5%比例接种到YI^培 养基，37°C培养6-化，W10%接种到2XYTG培养基(酵母粉16 g/L，蛋白腺10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钢5 g/L)37°C培养化，0〇6日卿11=1; 2) 取50ml拜氏梭菌菌液，5000rpm，4°C离屯、10 min,弃上清。在WETM缓冲液（270mM薦 糖，0.6mM化抽P〇4,4.4mM化2HP〇4，10mM MgCl2)重悬；同上离屯、，去上清，再次WETM缓冲液 重悬，同上离屯、，彻底取上清； 3) Wlml ET缓冲液（270mM薦糖，0.6mM Na2册〇4,4.4mM化此P〇4重悬，取20化1，加入 lug Cbei_3304插入失活载体，加入0.2cm预冷的电转杯，轻轻混匀； 4) 使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压1.8kV，电阻200 Q，电容2.5yF，电击后 立刻加入ImL 2XYTG培养基，转移到无菌离屯、管中复苏2~化； 5) 取20化1上述菌液，涂布到含有10 μg/ml红霉素的YPS固体培养基，培养2~3天。
[0038] (3)Cbei_3304插入失活突变株的筛选 挑取上述步骤5)中培养2~3天的转化子，使用引物Cbei-3304-T-S和Cbei-3304-T-A对 转化子进行菌落PC閲金证，筛选出内含子插入基因组的突变株(插入后，PCR扩增出基因条带 电泳图上比野生型大约化bp)，如图3所示，将正确插入的突变株传代=次，同时涂布在含有 红霉素抗性和没有红霉素抗性的YI^固体培养基上，筛选出敲除质粒丢失的突变株(在红霉 素抗性平板上不能生长的突变株），即得本发明高产电拜氏梭菌。
[0039] 实施例2 本实施例说明上述构建的高产电拜氏梭菌作为阳极催化剂利用Ig/L葡糖糖的产电实 验。
[0040] (1)构建微生物燃料电池 本实施例按照现有的技术和方法建立了利用拜氏梭菌为阳极催化剂发电的微生物燃 料电池，包括阳极室、阴极室、质子交换膜和外电路四个部分。阳极电极和阴极电极均为PAN 基石墨软拉（5 X 5cm)，W铁丝作为外接电路，外接电阻为1000 Q，质子交换膜为杜邦 NafionN117,采用数据采集器为Keithl巧系列。
[0041] (2)培养基配方： YPS种子培养基:酵母粉3g/L，蛋白腺5g/L，葡萄糖Ig/L，乙酸锭2g/L，氯化钢3g/L， 屯水合硫酸儀3g/L，憐酸二氨钟Ig/L，憐酸氨二钟Ig/L，屯水合硫酸亚铁0.1g/L，pH=6。
[0042] 双室MFC中阳极液:酵母粉3g/L，蛋白腺5g/L，葡萄糖Ig/L，乙酸锭2g/L，氯化钢 3g/L，屯水合硫酸儀3g/L，憐酸二氨钟Ig/L，憐酸氨二钟Ig/L，屯水合硫酸亚铁O.lg/L，甲基 紫精（3304-MFC中MV浓度为0.4g/L，8052-MFC中MV浓度为0.1 g/L)，pH=6。
[0043] 双室MFC中阴极液:二水合憐酸二氨钢2.772g/L，十二水合憐酸氨二钢11.5g/L，氯 化钟0.13g/7l，铁氯化钟40mM，pH=7。
[0044] (3)在YPS种子液中分别活化高产电重组菌株3304(实施例1构建的高产电拜氏梭 菌）和初始菌株8052(CJostric/ium beijerinc知'i NCIMB 8052)，培养溫度37°C，厌氧培养 时间12h。然后进行250mL双室MFC技术，向阳极室中接入阳极液225mL，甲基紫精(MV)，通入 化3分钟，再接入25血的拜氏梭菌(接种量10%( v/v))，通入化3分钟，排出溶液中的氧，迅速 密封阳极室，向阴极室加入阴极液，迅速密封阴极室，培养溫度30°C，产电检测时间33h，最 终得到结果如1表和图4~6所示。
[0045] 表1本发明高产电拜氏梭菌与出发菌株产电性能的检测结果
根据输出电压数据，计算电子回收率与获得产电的极化曲线图，实验结果如表1和图4~ 6所示;其中，图4为本发明高产电拜氏梭菌在Ig/L葡萄糖中的产电活性图；图5为初始菌株 NCIMB 8052在Ig/L葡萄糖中的产电活性图；图6为本发明高产电拜氏梭菌与初始菌株NCIMB 8052利用Ig/L葡萄糖为燃料的产电情况。从中可W看出本发明高产电拜氏梭菌最大输出电 压高达409mV，比初始菌株NCIMB 8052提高了3.13倍，最大输出功率密度为144.4mW/m2，比 初始菌株NCIMB 8052提高了 1.71倍。
[0046] 本发明在研究过程中，还发现将葡糖糖替换为木糖、薦糖、果糖或淀粉作为电子供 体，本发明高产电拜氏梭菌同样也能产生类似效果的最大输出电压高、最大输出功率密度； 将甲基紫精替换为亚甲基蓝、蔥酿-2,6-二横酸钢作为电子介体，本发明高产电拜氏梭菌同 样也能发挥类似效果的产电性能。
[0047] 上述结果说明本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌产电的方法，所得到 的高产电拜氏梭菌可用于产电，尤其是用于微生物燃料电池的产电中；故可将本发明高产 电拜氏梭菌用于微生物燃料电池的制备。
[004引上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种提高拜氏梭菌产电的方法，其特征在于，将拜氏梭菌蛋白Cbei_3304的功能进行 缺失。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因 不能正常表达。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将拜氏梭菌中编码蛋白Cbei_3304的基因 进行插入失活。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将编码蛋白Cbei_3304的碱基序列如SEQ ID No: 1 所示。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拜氏梭菌为C7os iric/i beijerinckii NCIMB 8052〇6. -种高产电拜氏梭菌在产电中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失正常蛋白Cbei_ 3304功能的拜氏梭菌。7. -种高产电拜氏梭菌在制备微生物燃料电池中的应用，所述高产电拜氏梭菌为缺失 正常蛋白Cbei_3304功能的拜氏梭菌。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述高产电拜氏梭菌为权利要求1~5任一 所述方法制备得到的拜氏梭菌。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述高产电拜氏梭菌以葡糖糖、木糖、蔗 糖、果糖或淀粉为电子供体。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述高产电拜氏梭菌以甲基紫精、亚甲基 蓝、或蒽醌-2,6-二磺酸钠作为电子介体。
【文档编号】C12N1/20GK106047754SQ201610399488
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】郭亭, 冯春华, 陈瑞荣, 万辉, 王庆福, 梁磊, 安玉兴
【申请人】广州甘蔗糖业研究所