一种控制泥臭味物质pc的复合菌剂及应用
【专利摘要】本发明公开了一种控制泥臭味物质PC的复合菌剂及应用，属于微生物技术领域。本发明得到了三株不产或者低产窖泥臭味物质PC的窖泥功能微生物，本发明的功能微生物额外添加到窖泥后，能够抑制同属的菌株的生长，而对其他属的微生物结构影响不大，得到的窖泥能够维持白酒的正常发酵但能降低白酒中PC含量。本发明还提供了发酵食品中异味物质PC的控制策略。CGMCC NO.1243420160510CGMCC NO.1243220160510CGMCC NO.1243320160510
【专利说明】
-种控制泥臭味物质PC的复合菌剂及应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种控制泥臭味物质PC的复合菌剂及应用，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 白酒是世界著名的六大蒸馈酒之一。浓香型白酒在我国白酒消费市场占据重要地 位，其产量及市场占有率占整个白酒行业的70%左右。浓香型白酒最具特色的生产工艺之 一是采用泥鲁发酵。鲁池作为酒酷发酵容器，提供厌氧环境，其中的鲁泥提供了大量的酿造 用菌，产生许多对酒体有贡献的风味物质。其中，浓香型白酒主体呈香物质己酸乙醋的产生 与鲁泥微生物密切相关。然而，鲁泥作不仅贡献了大量的有益风味物质，一些不好的风味物 质如鲁泥臭也进入酒体。虽然鲁泥臭困扰白酒行业多年，但缺乏该类异味的控制有效控制 措施。
[0003] 徐岩团队检测鲁泥中的可挥发性组分后，应用现代分离及风味研究技术，确认产 生鲁泥臭的化合物是4-甲基苯酪(p-cresol，PC)。通过定量分析酿造过程中大曲、酒酷和鲁 泥中的PC含量，明确了PC主要来源于鲁泥，且鲁泥中PC含量与在鲁池中的位置有关。酒酷自 身产PC的能力较弱。黄水与酒酷接触，使PC进入酒酷;酒酷发酵结束后蒸馈，PC随馈分进入 原酒中。
[0004] 鲁泥微生物菌群在很大程度上影响浓香型白酒品质及风味特征。因此，有必要在 明确产PC的微生物生理生化特性的基础上，筛选与其相似生态位的不产或低产PC的菌株。 并通过在鲁泥中强化运些菌株W便于从源头上降低PC含量并保证白酒风味品质。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明从白酒鲁泥中筛选得到了 =株不产或者低产鲁泥臭味 物质PC的鲁泥功能微生物，分别为不产PC的Lactobacillus acidipiscis JGn2、不产PC的 Clostridium sporogenes JGn4、低产PC的Clostridium butyricum JGn6。
[0006] 所述Lactobacillus acidipiscis JGn2,已于2016年5月10日保藏于中国普通微 生物菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12432。
[0007] 所述Clostridium sporogenes JGn4,已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12433。
[000引所述Clostridium butyricum JGn6,已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12434。
[0009] 本发明的不产或者低产PC的菌株是从浓香型白酒鲁泥中筛选得到的。
[0010] 本发明的不产或者低产PC的菌株具有如下特性：
[0011] (1)不产或者低产PC;
[0012] (2)产酸能力强；Lactobacillus acidipiscis JGn2可产较高浓度的乙酸和癸酸； Closhidium sporogenes JGn4可产较高含量的4-甲基-戊酸；Clostridium butyricum JGn6可产较高含量的下酸。
[0013] (3)额外添加到鲁泥后，能够抑制同属的菌株的生长，而对其他属的微生物结构影 响不大，得到的鲁泥能够维持白酒的正常发酵。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种控制泥臭味物质PC的复合菌剂，所述复合菌剂W Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clostridium sporogenes JGn4和Clostridium butyricum JGn6为主要微生物。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中，Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clost;ridium sporogenes JGn4、Clost;ridium butyri州m JGn6的活菌数比例为（1 ~ 10):(1~10):(1~10)。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中，Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clost;ridium sporogenes JGn4、Clos1:;ridium butyri州m JGn6的活菌数比例为1:1: lo
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂，是制备Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clost;ridium sporogenes JGn4、Clost;ridium butyricum JGn6的种子液，然后按照 体积比（1~2): (1~2): (1~2)的比例将种子液混合制备得到的。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中还含有任何可W应用于发酵食品或 者发酵食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽抱杆菌、酿酒酵母、枯草芽抱杆菌等等。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中还含有任意能用于发酵食品的载 体。
[0020] 本发明的第S个目的是提供一种发酵食品中异味物质PC的控制方法，所述方法是 将本发明的复合菌剂，或者是本发明的JGn2、JGn4、JGn6单独或者按任意比例混合，接种到 发酵食品的生产过程中，通过不产或者低产PC的菌株竞争性替代原发酵食品生产体系中的 产PC的菌株，进而控制发酵食品中的异味物质PC。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为白酒。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述方法，是将复合菌剂的菌液，或者是本发明的 JGn2、JGn4、JGn6单独或者按任意比例混合的菌液与鲁泥混菌悬浮液于培养基中培养鲁泥， 并在培养过程中接种1次或者多次复合菌剂或JGn2、JGn4、JGn6(单独或者按任意比例混合） 菌株菌液进行强化，得到强化后鲁泥混菌微生物，然后再培养强化后鲁泥混菌微生物得到 强化鲁泥，再利用强化鲁泥进行白酒酿造。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述控制方法，是将Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clost;ridium sporogenes JGn4、Clost;ridium butyricum JGn6同时制备菌株菌液， 同时与鲁泥混菌悬浮液进行培养。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述控制方法中，Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clost;ridium sporogenes JGn4、Clost;ridium butyri州m JGn6是按照接种量体积比 (1~2) :(1~2) :(1~2)的比例接种制备菌株菌液。
[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述培养基为己酸菌培养基。
[00%] 在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clost;ridium sporogenes JGn4、Clost;ridium butyri州m JGn6是按照接种量体积比 (1~2): (1~2): (1~2)的比例接种制备菌株菌液，然后将菌液与鲁泥混菌悬浮液于己酸菌 培养基培养鲁泥1天，并每隔3天再次强化接种不产/低产PC菌液接两次，得到强化后鲁泥混 菌微生物;随后，在新的己酸菌培养基中发酵培养强化后鲁泥混菌微生物9天，得到强化鲁 泥，再利用强化鲁泥进行白酒酿造。
[0027] 本发明的第四个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有本发明所述的 不产或者低产PC的菌株中的任意一种或者多种。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有本发明的不产或低产PC的菌株 的菌体活细胞、冷冻干燥得到的本发明的不产或低产PC的菌株的干菌体、固定化的本发明 的不产或低产PC的菌株的细胞、本发明的不产或低产PC的菌株的液体菌剂、本发明的不产 或低产PC的菌株的固体菌剂，或者W其他任何形式存在的本发明的不产或低产PC的菌株。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可W应用于发酵食品 或者发酵食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽抱杆菌、酿酒酵母、枯草芽抱杆菌等等。
[0030] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于发酵食品的载 体。
[0031] 本发明的第五个目的是提供所述不产或低产PC的菌株的应用，是应用于食品技术 领域，尤其是发酵食品技术领域。
[0032] 在本发明的一种实施方式中，所述应用，是应用于酿造酒、蒸馈酒等方面，比如白 酒、葡萄酒、黄酒、果酒方面。
[0033] 在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将本发明的不产或低产PC的菌株添加 到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。
[0034] 在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将本发明的不产或低产PC的添加到鲁 泥中。
[0035] 本发明的有益效果：
[0036] 本发明得到了 S株不产或者低产鲁泥臭味物质PC的鲁泥功能微生物，本发明的功 能微生物额外添加到鲁泥后，能够抑制同属的菌株的生长，而对其他属的微生物结构影响 不大，得到的鲁泥能够维持白酒的正常发酵但能降低白酒中PC含量。本发明还提供了发酵 食品中异味物质PC的控制策略。
[0037] 生物材料保藏
[0038] Lactobacillus acidipiscis JGn2,分类学命名为Lactobacillus acidipiscis， 已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12432,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0039] Clostridium sporogenes JGn4,分类学命名为生抱梭菌Clostridium sporogenes，已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏编号为 CGMCC NO. 12433,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0040] Clostridium butyricum JGn6,分类学命名为下酸梭菌Clostridium butyri州m， 已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12434，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】
[0041] 图1:鲁泥稳态结构菌群。
【具体实施方式】
[0042] 培养基：
[0043] 强化梭菌培养基(g. 1/1):蛋白腺10,牛肉膏10,酵母膏3,葡萄糖5,氯化钢5,醋酸 钢3，硫酸儀0.2，硫酸锭0.5，憐酸氨二钟1，憐酸二氨钟0.5)。
[0044] 己酸菌培养基(g ? 1/1):酵母膏5,蛋白腺5,乙酸钢6,憐酸氨二钟0.4,硫酸儀0.2， 硫酸锭0.5,碳酸巧5,憐酸氨二钟1，憐酸二氨钟0.5。乙醇20mL(接种前加入）。
[0045] 实施例1:鲁泥微生物的分离与鉴定
[0046] (1)菌株分离:将5g新鲜鲁泥悬于lOOmL 0.9%化C1溶液，在固体培养基涂布后，放 于厌氧培养箱37°C静置培养3天;划线得到单菌落后挑选单菌落于12mL强化梭菌培养基中， 每块平板挑选3个平行，在37 °C的厌氧培养箱中培养3天。
[0047] (2)菌株培养后发酵液风味的检测:发酵液经8000r ? mirTi离屯、lOmin后取上清液 8mL，加3g氯化钢饱和后，经顶空微萃取-气相色谱-质谱联用化S-SPME-GC-MS)技术测定其 中的可挥发性风味。
[004引 GC-MS 条件：
[0049] 萃取条件:DVB/CAR/PBDS萃取头萃取45min，萃取溫度为45°C。
[0050] GC条件:进样口溫度250°C，载气化，流速2血? min-i，不分流进样，色谱柱为CP-Wax (60mX0.25mmi.d. X0.25皿 J&W Scientific)。检测时的升溫程序为：50°C恒溫2min，W6 ? min-i的速度升溫至230°C，保持15min。
[0化1] MS条件:EI电离源，电子能量70eV，离子源溫度230°C，扫描范围35.00~350曰11111。质 谱分析用数据库来源于NIST05a丄(Agilent公司）。
[0052] (3)菌株16S rRNA鉴定:发酵液离屯、后得到细胞沉淀，提取基因组，测定保守区域 16S rRNA序列鉴定种属，PCR用的引物序列为27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R (5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。
[0053] 对鲁泥中产PC微生物进行分离，通过初步菌落形态判断共分离到34株细菌，测定 16S rRNA基因序列后与Genbank数据库比对，确定种属，得到了几株不产或低产PC的菌株， 结果如表1所示。
[0054] 表1微生物的分离与鉴定 [0化51
[0056] 注:ND表示低于检测限；表示未比对
[0化7] 其中Lactobacillus acidipiscis JGn2,已于2016年5月10日保藏于中国普通微 生物菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC N0.12432DClost;ridium sporogenes JGn4,已 于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12433。 Clostridium butyricum JGn6,已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理 中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 12434。
[0058]实施例2:鲁泥功能微生物的产风味物质的种类和含量测定 [0化9]将鲁泥中分离得到功能纯菌CGMCC N0.12432、CGMCC N0.12433、CGMCC N0.12434 分别接种至强化梭菌培养基(g ? [1):蛋白腺10,牛肉膏10,酵母膏3,葡萄糖5,氯化钢5,醋 酸钢3,硫酸儀0.2,硫酸锭0.5,憐酸氨二钟1，憐酸二氨钟0.5。菌株培养后发酵液风味的检 测:发酵液经8000r ? mirfi离屯、lOmin后取上清液8mL，加3g氯化钢饱和后，经顶空微萃取-气 相色谱-质谱联用化S-SPME-GC-MS)技术测定其中的可挥发性风味。
[0060] 萃取条件:DVB/CAR/PBDS萃取头萃取45min，萃取溫度为45°C。
[0061 ] GC条件:进样口溫度250°C，载气化，流速2血? min-i，不分流进样，色谱柱为CP-Wax (60mX0.25mmi.d. X0.25皿 J&W Scientific)。检测时的升溫程序为：50°C恒溫2min，W6 °C ? mirTi的速度升溫至230°C，保持ISmiruMS条件:El电离源，电子能量70eV，离子源溫度 230°C，扫描范围35.00~35〇311111。质谱分析用数据库来源于化51'053丄(4邑116111公司）。结合 质谱图与保留时间物质定性，并通过各种物质的特征离子进行准确定量。
[0062] 结果如表2所示。
[0063] 表2风味物质含量(单位mg/L)
[0064]
[0065] 上述S种低产/不产PC的鲁泥功能微生物可产生较丰富的香气物质，其中包括9种 酸类化合物、6种醇类化合物、2种酬类化合物和4种醒类化合物。其中，酸类和醇类化合物最 丰富，两者约占总种类的45 %。其中，产鲁泥臭味物质PC较少的Lactobacillus acidipiscis JGn2可产较高浓度的乙酸和癸酸。Clostridium butyricum JGn6可产较高含 量的下酸。下酸是己酸合成的前体。上述酸类对应的下酸乙醋和己酸乙醋是浓香型白酒风 味中主体呈香物质。Clostridium sporogenes JGn4还贡献较为丰富的化嗦类物质，该类物 质赋予白酒类似赔烤香气。此外，运=株功能微生物共同代谢花香/水果香类的醇类、醋类 物质，W及青草香气的醒类物质。为丰富白酒的香气及提升感官品质提供物质基础。
[0066] 实施例3:鲁泥功能微生物的生理生化特性
[0067] 比较了鲁泥功能微生物的生理生化特性，结果如表3所示。
[0068] 表3菌株的生理生化特性
[0069]
[0070] 注:a芽抱位置端生(T)或近端生（ST) ;ND:不确定;+ :表示微生物能利用该碳源或 能产生该代谢物;表示微生物不能利用该碳源或能产生该代谢物。
[0071] 实施例4:菌株的应用
[0072] 将CGMCC N0.12432XGMCC N0.12433、CGMCC N0.124：M活化后，各按照0.1%的接 种量与鲁泥混菌悬浮液接种于己酸菌培养基中，培养鲁泥1天，并每隔3天再次强化接种不 产/低产PC菌液（即CGMCC N0.12432XGMCC N0.12433XGMCC N0.124：34的混合菌液，各 0.1%)接两次，得到强化后鲁泥混菌微生物。随后，在新的己酸菌培养基中发酵培养强化后 鲁泥混菌微生物9天，得到强化后的样品。
[0073] 发酵后样品分别进行GC-MS检测和MiSeq基因组16S rDNA测序，W观察强化后鲁泥 微生物风味代谢W及菌群结构变化情况。对照样品（改造前样品）即为不添加本发明的 〔610：顯.12432、〔610：^.12433、〔610：^.12434的按照上述方法得到的样品。表4为功 能菌株强化前后PC含量W及微生物结构变化。结果显示，利用本发明的运些不产/低产PC的 功能菌株对鲁泥进行强化，PC含量降低了 73.3%，显著降低了鲁泥臭。利用得到的不产PC微 生物构建鲁泥微生物自稳态系统，从根本上解决鲁泥臭。同时，如图1所示，采用上述方法对 鲁泥强化后，构建的=大鲁泥稳态菌群(水解菌群发酵菌群，互营养产醋酸菌群和产甲烧菌 群)可W利用多种碳源，最后生成中性产物甲烧，该系统同时可W输出多种风味物质(包括 C2-C10短链脂肪酸），具有一定的鲁棒性(抗干扰能力）。
[0074] 表4功能菌株强化前后PC含量W及微生物结构变化
[0075]
[0076] 对强化前后的鲁泥的主要酸类进行检测，结果如表5所示。结果显示，强化后的鲁 泥的主要有机酸己酸提高到了 4倍，下酸含量提高到了 3.42倍。
[0077] 表5改造前后鲁泥主要有机酸浓度比较
[007引
[0079] 将本方法得到的鲁泥用于白酒酿造，并比较了鲁泥改造前后的鲁池产酒的主要风 味物质，如表6所示，醋含量增加了 50 %左右，酸含量增加了44倍左右。
[0080] 表6改造前后鲁池中产酒主要风味物质浓度比较
[0081]
[0082] 经〔610：^.12432、〔610：^.12433和〔610：^.124：34强化的鲁泥，？(：含量降低 了73.3%，主要有机酸浓度得到显著提高。利用得到的不产PC微生物构建鲁泥微生物自稳 态系统，从根本上解决鲁泥臭。得到的鲁泥用于白酒的酿造，不仅有效降低了 PC的含量，而 且稳定性好、各批次间差异小，能够维持白酒发酵的正常进行，得到的白酒的风味和口感明 显得到改善。
[0083] 可W理解的是，对本领域普通技术人员来说，可W根据本发明的技术方案及其发 明构思加 W等同替换或改变，而所有运些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保 护范围。
【主权项】
1. 一种控制泥臭味物质PC的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂以Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clostridium sporogenes JGn4和Clostridium butyricum JGn6为主 要微生物； 其中，所述Lactobacillus acidipiscis JGn2,已于2016年5月10日保藏于中国普通微 生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 12432;所述Clostridium sporogenes JGn4,已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 12433;所述Clostridium butyricum JGn6,已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 12434。2. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clostridium sporogenes JGn4、Clostridium butyricum JGn6的活菌 数比例为(1~10) :(1~10) :(1~10)。3. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂，是先制备 Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clostridium sporogenes JGn4、Clostridium butyricum JGn6的种子液，然后按照体积比（1~2): (1~2): (1~2)的比例将种子液混合制 备得到的。4. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，Lactobacillus acidipiscis JGn2、Clostridium sporogenes JGn4、Clostridium butyricum JGn6的活菌 数比例为1:1:1。5. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中还含有任何能够应用 于发酵食品或者制备发酵食品的任意种属的菌株。6. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中还含有任意能用于发 酵食品的载体。7. -株低产窖泥臭味物质PC的窖泥功能微生物，其特征在于，所述窖泥功能微生物为 Clostridium butyricum JGn6;其中，所述Clostridium butyricum JGn6,已于2016年5月 10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 12434。8. -种发酵食品中异味物质PC的控制方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1~6 任一所述的复合菌剂或者权利要求7所述的窖泥功能微生物接种到发酵食品的生产过程 中，通过不产或者低产PC的菌株竞争性替代原发酵食品生产体系中的产PC的菌株，进而控 制发酵食品中的异味物质PC。9. 一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求7的低产窖泥臭味物质 PC的窖泥功能微生物。10. 权利要求7所述的低产窖泥臭味物质PC的窖泥功能微生物在食品技术领域的应用。
【文档编号】C12R1/225GK106047777SQ201610678034
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月17日
【发明人】杜海, 徐岩
【申请人】江南大学