猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培养基的制作方法

猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培养基。本发明提供了专用培养基，包括EpiLC诱导培养基、PGCLC诱导培养基和SSCLC诱导培养基；本发明的实验证明，本发明提供了在体外将猪多能干细胞向原始生殖细胞样细胞(PGCLC)定向诱导分化的方法，PGCLC可以进一步诱导分化形成精原干细胞样细胞(SSCLC)；在体内，将诱导的细胞注射到去除内源精子的小鼠曲细精管中，PGCLC和SSCLC可以存活并进一步发育。因此，本发明为猪多能干细胞向生殖细胞的定向分化提供了可行有用的方案，为探索生殖细胞发育机制等奠定了基础。
【专利说明】
猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培 养基
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖 细胞的方法及专用培养基。
【背景技术】
[0002] 2003年，￥日7〇;11'〇7〇〇4日等通过将小鼠胚胎干细胞(血131'〇]1；[。8161110611,650培 养形成拟胚体巧mbryoid body,EB)的方式，可W检测到相当于体内发育过程中胎儿性腺中 集聚的生殖细胞;在体内实验中，研究人员检测到外源细胞分化得到的精子，通过聚合酶链 式反应(PCR)进行了验证。该文章未检测诱导分化的精子激活卵细胞的能力。2004年，Niels Geijsen等从视黄酸(RA)培养的邸中分离出来原始生殖细胞(PGC)，并继续培养得到胚胎生 殖细胞系;EB中的PGC可W发育成单倍体精子，将得到的单倍体精子注射到卵母细胞中，可 W激活卵母细胞形成囊胚样结构，但是该文章未检测后续胚胎发育情况。2006年，Karim Nayernia等首次报道了体外分化小鼠 ESC形成雄性配子，并且能产生小鼠后代。但是小鼠生 长异常，出生出现死亡现象。2007年，Alexan化e Kerkis等通过RA将小鼠 ESC形成的邸分化 形成雄性和雌性两种生殖细胞。2009年，Zhuo化等过表达化zl基因，可W促进ESC形成卵泡 样结构和曲细精管样的结构;将得到的单倍体细胞进行胞质注射后，卵母细胞发育至化细胞 阶段。2010年，Masanori Imamura等将诱导多能干细胞（iPSC)与表达BMP4蛋白的细胞进行 共培养进行分化，但是分化效率不高;为提高诱导效率，研究者将表达BMP4的细胞进行了改 造，即通过逆转录病毒转入S个基因 GDNF/SCF/EGF，再将iPSC与此改造的细胞进行共培养， 可^更快地出现乂454阳性的细胞。2011年，5曰;[1:011实验室1(曰131111化0化7曰311；[等研究人员在 将小鼠 ESC和iPSC先分化成上胚层干细胞样细胞化piLC)，再进一步分化成PGC样的细胞 (PGCLC)。由过渡态化iLC分化成PG化C的过程中，使用的培养体系主要含有细胞因子BMP4/ BMP8a/SCF/EGF/LIF等。通过曲细精管注射，将得到的PG化C移植到白消安处理的小鼠曲细 精管中，两个月后，可W分离得到精子;通过胞质注射，可W得到ESC/iPSC来源的小鼠后代。 2012年，Yong Zhu等结合体外诱导分化和体内曲细精管注射的方法将小鼠 iPSC分化成精原 干细胞(SSC)及其分化后期的雄性生殖细胞，但是该文献没有进行功能等方面的实验研究。 2013年，5曰11011实验室化11110化1?1^等在小鼠65(：中过表达转录因子口1?011/口1?0114/ TFAP2C。先将ESC分化形成化iLC;不需要外源细胞因子进行刺激，直接将化iLC快速有效地 分化成PG化C，运些转录因子诱导的PG化C能够完成生精过程，将得到的精子注射到卵母细 胞中，通过胞质注射，可W得到小鼠后代。2014年，化ng化ng Li等将iPSC诱导成PG化C，运些 PG化C能够表达生殖细胞标记基因，体内移植到不育小鼠的曲细精管中也能够恢复生精过 程。同年，Tohru Kimura等通过抑制E服信号通路可W有效地将小鼠 ESC诱导形成PG化C。在 中胚层分化体系中，通过MEK抑制剂可W抑审化服信号通路，可W激活生殖细胞的分化。2016 年，Kazuhir0 Murakami等发现NAN0G可W不依赖BMP4而直接将EpiLC诱导成PG化C。同年， Quan Zhou等不依赖于体内分化实验，直接在体外完成小鼠 ESC的减数分裂，得到单倍体精 子，通过胞质注射等得到可育的小鼠后代。该文章首次报道了完全在体外，可W将ESC分化 成有功能的单倍体精子细胞。
[0003] 小鼠多能细胞分化成生殖细胞已取得很大的研究进展，在人多能干细胞向生殖细 胞分化的研究上也取得了突破的进展。2004年，Amander T.Clark等在体外将人ESC培养形 成EB，在运些邸中可检测到未成熟的生殖细胞向成熟生殖细胞的转变。2008年，Katarzyna Tilgner等提供了一个从人ESC中分离PGC的方法。先将人ESC分化形成邸，再通过流式细胞 仪分选出来SSEA1阳性的细胞，该细胞高表达VASA基因，并且在表观遗传学方面，与体内发 育的PGC类似，运些体外诱导的细胞能够合成联会复合体的成分，但不能进入减数分裂阶 段。2009年，Kehkooi Kee等通过过表达或者沉默DA化，可W调控人类生殖细胞的形成和发 育。除了通过转基因的方式进行诱导分化，Tae Sub化rk等通过与人胎儿性腺细胞共培养 的方式，将人的ESC和iPSC分化为PGCeNathan Bucay等通过减少人ESC克隆的大小W及控制 其饲养周期，加快诱导的PGC出现。2010年，Sarita化nula等比较了人ESC和iPSC分化为PGC 及其进行减数分裂的能力。2011年，C.Eguizabal等第一次在没有进行过表达生殖细胞相关 的转录因子前提下，将人iPSC体外分化成减数分裂后期的生殖细胞。2012年，Charles A.Easley IV等仅通过使用精原干细胞培养体系对人ESC/iPSC直接进行分化，形成不同阶 段的雄性生殖细胞。2013年，口曰1:〇111口〇]1胖〇]1邑付曰1?)〇雌曰16等发现51'化1^\基因有利于人65〔向 生殖细胞和内胚层细胞系的分化。Peng Li等通过体外培养iPSC形成邸，再通过RA或者睾酬 的诱导，形成雄性生殖细胞。2014年，Renee A.Reijo化ra研究组将人的iPSC移植到不育小 鼠的曲细精管内进行研究。使用因子0CT4/S0X2/KLF4/MYC/VASA进行重编程得到的iPSC移 植到曲细精管中，他们会与支持细胞相连，定向分化成PGC，表达不同阶段生殖细胞特定的 标记蛋白；而使用传统四因子0CT4/S0X2/KLF4/MYC进行重编程得到的iPSC在曲细精管中， 更倾向于形成像癌样组织的细胞团块。2015年，化oko Irie等发现内胚层标记基因 S0X17是 人PG化Cs最早的一个标记基因，是人PG化C命运的关键调控者，运和小鼠有着很大的不同。 同年，Fumihiro Sugawa等通过无血清培养体系将人ESC/iPSC分化形成迁移前的PG化C。 Ko化ro Sasaki等将人iPSC分化形成中间过渡态细胞--中胚层样的细胞，再进一步分化 形成PG化C。
[0004] 作为家畜大动物，猪是重要的农业经济动物，在形态学、生理学、解剖学W及代谢 等方面与人有着很大的相似性，因此，猪多能干细胞在遗传育种上、再生医学W及建立疾病 模型等方面具有广阔的应用前景。尽管小鼠和人多能干细胞向生殖细胞的定向诱导分化已 经取得突破，但是猪多能干细胞向生殖细胞的诱导分化仍具有很大的挑战性。作为遗传物 质的传递者，生殖细胞是物种进化及生命延续所必需的细胞群，在生命循环中占有着重要 的地位。如果猪多能干细胞可W向生殖细胞分化，不仅可W作为优良的种质资源，在育种等 方面有着更为重要的作用。

【发明内容】

[0005] 本发明一个目的是提供一种猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的专用 培养基。
[0006] 本发明提供的专用培养基，包括化i LC诱导培养基、PGCLC诱导培养基和SS化C诱导 培养基；
[0007]所述化iLC诱导培养基中含有bFGF(成纤维细胞生长因子)和ActivinA(激活素 A)， 且所述bFGF在所述化iLC诱导培养基中的浓度为8-16ng/mL，所述ActivinA在所述化iLC诱 导培养基中的浓度为12-20ng/mL。
[000引所述PG化C诱导培养基中含有BMP4(骨形成蛋白4)、BMP8a(骨形成蛋白8a)、SCF(干 细胞因子）、EGF(表皮生长因子)和LIF(白血病抑制因子），且所述BMP4在所述PG化C诱导培 养基中的浓度为30-100ng/mL，所述BMP8a在所述PG化C诱导培养基中的浓度为30-100ng/ mL，所述SCF在所述诱导PG化幻秀导培养基中的浓度为30-100ng/mL，所述EGF在所述PG化幻秀 导培养基中的浓度为30-100ng/mL，所述LIF在所述诱导PG化C诱导培养基中的浓度为500- 1500U/mL0
[0009] 所述SS化C诱导培养基中含有睾酬、RA(视黄酸)和GDNF(神经胶质细胞源性的神经 营养因子），且所述的睾酬在所述SS化C诱导培养基中的浓度为0.5-lOiiM，所述RA在所述 SS化幻秀导培养基中的浓度为0.5-10測，所述GDNF在所述诱导SS化幻秀导培养基中的浓度为 2-20ng/mL〇
[0010] 上述培养基中，所述EpiLC诱导培养基中，所述bFGF在所述化iLC诱导培养基中的 浓度为12ng/mL，所述ActivinA在所述化iLC诱导培养基中的浓度为20ng/mL。
[0011] 所述PG化C诱导培养基中，所述BMP4在所述PG化幻秀导培养基中的浓度为50ng/mL， 所述BMP8a在所述PG化C诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述SCF在所述PG化C诱导培养基 中的浓度为50ng/mL，所述EGF在所述PG化C诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述LIF在所述 PG化幻秀导培养基中的浓度为1 OOOU/mL。
[0012] 所述SS化C诱导培养基中，且所述的睾酬在所述SS化C诱导培养基中的浓度为化M， 所述RA在所述SS化C诱导培养基中的浓度为化M，所述GDNF在所述SS化C诱导培养基中的浓 度为 4ng/mL。
[0013] 上述培养基中，所述EpiLC诱导培养基由KSC血清替代物（Knockout? Serum Replacement)、N2、B27、GlutaMAX(谷氨酷胺）、Nonessentialaminoacids(非必需氨基 酸）、2-Me;rcaptoethanol(0琉基乙醇）、DMEM、bFGF和ActivinA组成。
[0014] 所述KSC血清替代物在所述化iLC诱导培养基中的体积百分含量为1 %-5%。
[0015] 所述N2在所述化iLC诱导培养基中的体积百分含量为1%。
[0016] 所述B27在所述化iLC诱导培养基中的体积百分含量为2%。
[0017] 所述GlutaMAX在所述化iLC诱导培养基中的体积百分含量为1 %。
[0018] 所述Nonessential amino acids在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为 1%。
[0019] 所述2-Me;rcaptoethanol在所述化iLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1%。
[0020] 所述DMEM在所述化iLC诱导培养基中的体积百分含量为93.9-89.9%。
[0021 ] 所述?6化幻秀导培养基由KSC血清替代物、GlutaMAX、Nonessential amino acids、 2-]?6'。日口1〇6地日11〇1、6161、81口4、61口8日、5〔尸、66尸和1^尸组成。
[0022] 所述KSC血清替代物在所述PG化C诱导培养基中的体积百分含量为15%。
[0023] 所述GlutaMAX在所述PG化C诱导培养基中的体积百分含量为1 %。
[0024] 所述Nonessential amino acids在所述PG化C诱导培养基中的体积百分含量为 1%。
[00巧]所述2-Mercaptoethanol在所述PG化C诱导培养基中的体积百分含量为0.1%。 [00%] 所述GMEM在所述PG化C诱导培养基中的体积百分含量为82.9%。
[0027]所述SSCLC诱导培养基由FBS、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2- Mercaptoethanol、DMEM、睾酬、RA 和 GDNF 组成。
[00%]所述FBS在所述SS化C诱导培养基中的体积百分含量为15%。
[0029] 所述GlutaMAX在所述SS化C诱导培养基中的体积百分含量为1 %。
[0030] 所述Nonessential amino acids在所述SS化C诱导培养基中的体积百分含量为 1%。
[0031] 所述2-Mercaptoethanol在所述SS化C诱导培养基中的体积百分含量为0.1 %。
[0032] 所述DMEM在所述SS化C诱导培养基中的体积百分含量为82.89%。
[0033] 上述培养基还包括iPSCs细胞培养基，
[0034] 所述 iPSCs 细胞培养基含有 LIF、PD0325901 和 CHIR99021。
[0035] 所述UF在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为0.01%。
[0036] 所述PD0325901在所述iPSCs细胞培养基中的浓度为1-3測。
[0037] 所述CHIR99021在所述iPSCs细胞培养基中的浓度为1-3測。
[003引和/或，
[0039] 所述PD0325901在所述iPSCs细胞培养基中的具体浓度为1測。
[0040] 所述CHIR99021在所述iPSCs细胞培养基中的具体浓度为3iiM。
[0041 ] 上述培养基中，所述iPSCs细胞培养基由FBS、GlutaMAX、Nonessential amino 曰。1(13、2-]\16'。日91〇6地日11〇1、016]\1、1^、？00325901和邸11?99021组成。
[0042] 所述FBS在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为15%。
[0043] 所述GlutaMAX在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为1 %。
[0044] 所述Nonessential amino acids在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为 1%。
[0045] 所述2-Mercaptoethanol在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为0.1%。
[0046] 所述DMEM在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为82.89%。
[0047] 本发明另一个目的提供一种猪多能干细胞定向诱导分化为精原干细胞样细胞的 方法。
[004引本发明提供的方法，为如下A或B，
[0049] A所示的方法包括如下步骤：
[0050] 1)将离体的猪多能干细胞在上述中的所述EpiLC诱导培养基中诱导培养，得到上 胚层干细胞样细胞；
[0051] 2)将所述上胚层干细胞样细胞在上述中的所述PG化C诱导培养基中诱导培养，得 到原始生殖细胞样细胞；
[0052] 3)将所述原始生殖细胞样细胞在上述中的所述SSCLC诱导培养基中诱导培养，得 到精原干细胞样细胞。
[0053] B所示的方法包括如下步骤：
[0054] a)将离体的猪多能干细胞在上述中的所述EpiLC诱导培养基中诱导培养，得到上 胚层干细胞样细胞；
[0055] b)将所述上胚层干细胞样细胞在上述中的所述SS化C诱导培养基中诱导培养，得 到精原干细胞样细胞。
[0056] 上述方法中，步骤1)中，所述诱导培养的时间为1-3天，
[0057] 步骤2)中，所述诱导培养的时间为1-3天，
[0058] 步骤3)中，所述诱导培养的时间为2-20天，
[0059] 步骤a)中，所述诱导培养的时间为1-3天，
[0060] 步骤b)中，所述诱导培养的时间为2-20天。
[0061] 和/或，步骤1)中，所述诱导培养的时间具体为2天，
[0062] 步骤2)中，所述诱导培养的时间具体为2天，
[0063] 步骤3)中，所述诱导培养的时间具体为5-20天或7-15天，
[0064] 步骤a)中，所述诱导培养的时间具体为2天，
[0065] 步骤b)中，所述诱导培养的时间具体为5-20天或7-15天。
[0066] 本发明第=个目的是提供一种猪多能干细胞定向诱导分化为原始生殖细胞样细 胞的方法，包括如下步骤：
[0067] 1)将离体的猪多能干细胞在上述中的所述EpiLC诱导培养基中诱导培养，得到上 胚层干细胞样细胞；
[0068] 2)将所述上胚层干细胞样细胞在上述中的所述PG化C诱导培养基中诱导培养，得 到原始生殖细胞样细胞。
[0069] 上述方法中，
[0070] 步骤1)中，所述诱导培养的时间为1-3天，
[0071] 步骤2)中，所述诱导培养的时间为1-3天，
[0072] 和/或，步骤1)中，所述诱导培养的时间具体为2天，
[0073] 步骤2)中，所述诱导培养的时间具体为2天。
[0074] 上述的方法制备的精原干细胞样细胞也是本发明保护的范围；
[0075] 或上述的方法制备的原始生殖细胞样细胞也是本发明保护的范围；
[0076] 或上述的方法或上述的方法或所述精原干细胞样细胞或所述原始生殖细胞样细 胞在精子发育研究中的应用也是本发明保护的范围。
[0077] EpiLC诱导培养基为将多能干细胞诱导培养成化iLC的培养基；
[0078] PG化C诱导培养基为将化iLC诱导培养成PG化C的培养基；
[00巧]SS化C诱导培养基为将PG化C/化iLC诱导培养成SS化C的培养基。
[0080] 步骤1)中，所述诱导培养的时间为2天，每天换一次培养基；
[0081] 步骤2)中，所述诱导培养的时间为2天，两天换一次培养基；
[0082] 步骤3)中，所述诱导培养的时间为7-15天，两天换一次培养基；
[0083] 步骤a)中，所述诱导培养的时间为2天，每天换一次培养基；
[0084] 步骤b)中，所述诱导培养的时间为7-15天;两天换一次培养基。
[0085] 本发明的实验证明，本发明提供了在体外将猪多能干细胞向原始生殖细胞样细胞 (PG化C)定向诱导分化的方法，PG化C可W进一步诱导分化形成精原干细胞样细胞(SS化C); 在体内，将诱导的细胞注射到去除内源精子的小鼠曲细精管中，PG化C和SS化C可W存活并 进一步发育。因此，本发明为猪多能干细胞向生殖细胞的定向分化提供了可行有用的方案， 为探索生殖细胞发育机制等奠定了基础。
【附图说明】
[0086] 图1为猪iPSC具有多能性及分化潜能；
[0087] (a)猪iPSC克隆形态，标尺=100皿；（b)碱性憐酸酶(AP)染色，标尺=10皿；（C)免 疫巧光染色检测多能性基因，细胞核用DAPI染色(呈蓝色），标尺=50皿；（d)体外形成拟胚 体(Emkryoid body,邸），标尺=100]im; (e)免疫巧光染色检测邸分化的S胚层标记蛋白，细 胞核用DAPI染色（呈蓝色），标尺=sown; (f)免疫巧光染色检测iPSC分化为神经细胞， 肥STIN、TUJ巧日GFAP分别是神经祖细胞、神经元和星形胶质细胞的标记蛋白，细胞核用DAPI 染色(呈蓝色），标尺= 25wii;(g)油红0和尼罗红染色检测iPSC向脂类分化，标尺= 50wii。
[008引图2为猪iPSC向PG化C的诱导；
[0089] (a)将猪iPSC诱导分化为雄性生殖细胞的流程图；（b化piles的形态图，标尺= 50y m;(c化piLC诱导过程中基因表达情况分析，iPSC作为对照，两次生物学重复，*0.001《p《 0.05;**p<0.001;(d) PGCLC的形态图，标尺=50皿；（e) PG化C诱导过程中基因表达情况分 析，iPSC作为对照，两次生物学重复，d0、dl、d3、d5和d7分别是第0、1、3、5和7天的缩写，* 0.001《口《0.05;(門免疫巧光染色检测口6化(：中口6(：标记蛋白，细胞核用04口1染色（呈蓝 色），标尺=50皿。
[0090] 图3为猪PG化C的表观遗传学特征；
[0091] (a和C)免疫巧光染色检测PG化C中的册K9me2(a)和册K27me3(c)，细胞核用DAPI染 色（呈蓝色），标尺= 100皿；（b和d)使用ImageJ软件定量分册K9me2(b)和H3K27me3(d)的巧 光密度，iPSC作为对照，*p《0.05001; (e)亚硫酸盐分析印记基因甲基化，白色和 黑色圆圈分别代表CpG岛去甲基化和甲基化。
[0092] 图4为猪PG化C诱导过程中的转录组概况；
[0093] (a)基因表达的层次聚类分析图；（b)RNA-seq数据的主成分分析图；（c)iPSC和 EpiLC中E：piSC标记基因的heatmap图；（d)与生殖细胞相关基因的heatmap图，D3/D5/D7,指 PGCLC诱导分化的第3/5/7天；（e)q-PCR分析heatmap中选择的基因，两次生物学重复，* 0.001《p《0.05;**p<0.001; (f)基因本体图（Gene ontology,GO)。
[0094] 图5为猪iPSC向SS化C的诱导；
[00M] (a)SS化C的形态图（i和ii)，标尺=200皿。。和ii);(b)SS化C诱导过程中基因表 达情况分析，iPSC作为对照，两次生物学重复，d0、d3、d7和d9分别是第0、3、7和9天的缩写，* 0.001《p《0.05;(c)免疫巧光染色检测SSC标记蛋白，细胞核用DAPI染色（呈蓝色），（d)免 疫巧光染色检测SS化C中的H3K9me2(a)和H3K27me3(c)，细胞核用DAPI染色（呈蓝色），标尺 = 100]im〇(ii和iv)Quantification of relative H3K9me2(ii)和H3K27me3(iv)使用 Image J软件定量分册K9me2 (b)和册K27me3 (d)的巧光密度，iPSC作为对照，*p《0.05;(e)亚 硫酸盐分析印记基因甲基化，白色和黑色圆圈分别代表CpG岛去甲基化和甲基化；SSCIX指 从第0天PG化C诱导的SS化Cs;P化巧旨从第3天PG化C诱导的SS化C。；（f)流式分析DNA含量， 1口5(：、口51(：和55化(：中单倍体细胞比例分别是0.31%，1.23%和3.22%;(邑)从猪睾丸中分离 的精原细胞中SSC标记基因的表达，iPSC作为对照，两次技术重复。
[0096]图6为曲细精管注射PG化C;
[0097] (a)注射细胞后的小鼠睾丸，标尺=1mm; (b)移植PG化C后小鼠睾丸的肥染色，黑色 箭头指每个小管，标尺=50皿；（C)正常小鼠睾丸的皿染色，标尺=50皿;（d)白消安处理后 缺失内源精子的小鼠睾丸肥染色，标尺=50皿；（e)移植PG化C后的曲细精管，红色箭头指供 体细胞形成的细胞链，澄色箭头指供体细胞形成的细胞簇，标尺= 500]im; (f )PCR检测供体 细胞；（g)免疫组化检测PG化C移植后睾丸中的生殖细胞标记蛋白，细胞核用DAPI染色(呈蓝 色），标尺= 500皿。
[0098] 图7为曲细精管注射SS化C;
[0099] (a)移植SS化C后的曲细精管，白色箭头指供体细胞形成的细胞簇，黑色箭头指单 个的小管，标尺=500曲1; (b)移植SS化C后小鼠睾丸的皿染色，标尺=50皿；（C)免疫组化检 ^USSCLC移植后睾丸中的生殖细胞标记蛋白，细胞核用DAPI染色(呈蓝色），标尺= 500wii。
[0100] 图8为免疫组化检测不含有绿色供体细胞的曲细精管；
[0101] (a)皿染色检测移植后不含供体细胞睾丸中的生殖细胞标记蛋白标尺=50化m; (b)免疫组化检测移植后不含供体细胞睾丸中的生殖细胞标记蛋白，细胞核用DAPI染色(呈 蓝色），标尺=500皿。
【具体实施方式】
[0102] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0103] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0104] 实施例1、猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞
[0105] -、定向诱导分化培养基的配置
[0106] 表1为iPSCs细胞培养基（iPSC培养基)配方
[0107]
[0108] 表2为化iLC培养基配方
[0109]
「ni 1/11
[0115] 二、定向诱导分化
[0116] 在本研究中，为了在体内试验中追踪外源细胞，使用含有ZsGreen(绿色）的猪 iPSC，该细胞具有多能性及分化潜能，并且能初步定向分化形成神经及脂类细胞，见图1。
[0117] 在小鼠和人多能干细胞定向诱导分化成生殖细胞的基础上，优化培养体系，形成 猪iPSC诱导为生殖细胞的方法及流程，见图2曰。
[011引猪成纤维细胞的分离及iPSC的制备:取胚胎期35天的猪胎儿，放于细胞培养皿中， 用含有双抗DPBS洗S遍后，去除头部、四肢W及内脏，将剩余部分转移到新的细胞培养皿 中；用含有双抗的DPBS洗S遍，用灭菌后的剪刀将组织剪碎，然后将其转移到50mL离屯、管 中，加入膜酶，37 °C水浴锅中振荡消化15min;加入含有血清的培养基W终止消化，并吹散团 块;离屯、1500巧m，5min，弃去上清，用新鲜的培养液重悬，将重悬液转移到10cm细胞培养皿 中，再补充培养基至lOmL，放入37 °C细胞培养箱培养，此时细胞为第0代，即P0 ;培养3-4天 后，细胞长满，进行传代W及冻存，该细胞称为猪胚胎成纤维细胞(PEF);
[0119] 含有ZsGreen(绿色）的猪iPSC为将0ct4基因、Sox2基因、Klf4基因、c-Myc基因、 Nanog基因、Tbx3基因和Lin28基因导入离体猪胚胎成纤维细胞(PE巧中，得到的细胞。
[0120] 上述基因相关信息如下：
[0121] 0ct4(NM_001113060.1,18-0CT-2015),
[0122] Sox2(NM_001123197.1,25-MAY-2014),
[0123] Klf4(NM_001031782.2,18-0CT-2015),
[0124] c-Myc(NM_001005154.1,24-DEC-2015),
[01 巧]Nanog(NM_001129971，05-APR-2015),
[01 %] Tbx3(XM_001928002.3，11-沈P-2015)，
[0127] Lin28(NM_001123133.1,18-0CT-2015)
[0128] 上述基因通过逆转如病毒导入PEF细胞中，培养阳F，阳F随后会发生形变，待转入 外源因子30天后，挑取单克隆，将单克隆消化成单细胞，铺到饲养层细胞上，待细胞长大长 满，即可传代，此细胞成为iPSC。
[0129] 1、猪诱导多能干细胞iPSC向原始生殖细胞样细胞PG化C的体外诱导分化
[0130] 1)用Tryple将生长于饲养层细胞上的离体iPSC消化成单细胞，离屯、1000巧m， 5min，弃去上清，得到iPSC细胞沉淀；
[0131] 2)加2mL EpiLC诱导培养基重悬步骤1)处理得到的iPSC细胞，混合均匀，将细胞悬 液转移到铺有明胶板的六孔板培养皿中，细胞密度约为4X 105细胞/孔，每天换一次EpiLC 诱导培养基，诱导培养两天，用化yple将细胞消化成单细胞，离屯、lOOOrpm，5min，弃去上清， 用新鲜化iLC诱导培养基重悬细胞，得到化iLC细胞(图化）；
[0132] 3)将步骤3)应为步骤2)处理得到的化iLC细胞在PG化C诱导培养基中诱导培养，两 天换一次培养基，得到PG化C细胞。
[0133] 上述诱导培养时间为2-15天。
[0134] 若在9抓型底培养皿中，细胞密度约为1000细胞/孔;若在六孔板培养皿中，细胞密 度约为2X105细胞/孔。
[0135] 2、原始生殖细胞样细胞PG化C定向诱导分化为猪精原干细胞样细胞SS化C
[0136] 用Tryple消化上述1的步骤3)中诱导培养3天（开始诱导时记为第0天）得到的 PG化C细胞，离屯、lOOOrpm，5min，弃去上清收集细胞沉淀;将细胞沉淀在SS化C诱导培养基混 合均匀，得到细胞悬液，进行细胞计数，并将细胞悬液转移到铺有明胶板的12孔板细胞培养 皿中，细胞密度约为2 X 105细胞/孔，两天换一次培养基，诱导培养，得到SS化C细胞。
[0137] 上述诱导培养时间为2-15天。
[0138] 3、将上胚层干细胞样细胞化iLC定向诱导分化为猪精原干细胞样细胞SS化C
[0139] 用Tryple消化上述1的步骤2)中诱导培养2天（开始诱导时记为第0天）得到的 EpiLC细胞，离屯、lOOOrpm，5min，弃去上清收集细胞沉淀;将细胞沉淀在SS化C诱导培养基混 合均匀，得到细胞悬液，进行细胞计数，并将细胞悬液转移到铺有明胶板的12孔板细胞培养 皿中，细胞密度约为2 X 105细胞/孔，两天换一次培养基，诱导培养，得到SS化C细胞。
[0140] 上述诱导培养时间为2-15天。
[0141] 实施例2、检测
[0142] I、PG化C与SS化C分子水平和表观遗传检测
[0143] 一、PG化C与SS化C标志基因及标志蛋白的检测方法
[0144] 1、细胞样品的收集
[0145] iPSC样品的收集：因为iPSC生长再饲养层细胞上，因此收集样品提取RNA的时候， 需要先去除饲养层细胞。利用两种细胞贴壁时间差异，将其分离开。首先，将iPSC消化成单 细胞，离屯、后用新鲜的培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液混合均匀后移到细胞培养皿中，放 入细胞培养箱中，30minW后，大多数的饲养层细胞已经贴壁，而iPSC仍悬浮在培养液中，将 培养皿中的细胞悬液移到离屯、管中，离屯、1000巧m，5min，弃去上清，即可。
[0146] EpiLC/PGCUySSCLC样品的收集：将细胞用化yple消化成单细胞，离屯、1000巧m， 5min，弃去上清，即可。EpiLC,诱导两天的细胞;PGCLC，诱导第1/3/5/7天的细胞;SSCLC，诱 导第3/7/9天的细胞。
[0147] 2、RNA的提取W及mRNA反转录成cDNA
[014引使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒(货号931636)，流程如下：
[0149] (1)用化yple将细胞消化成单细胞，离屯、1000巧m，5min，弃去上清。
[01加](2)加入35化L RLT buffer裂解细胞，充分裂解后，加入等体积的70%乙醇，混合 均匀。
[0151] (3)将混合液体转移到RNeasy spin column中，再放于2mL收集管中，离屯、 10000巧m，30s，弃去废液。
[0152] (4)加入80化DNase去除基因组，室溫解育15min。
[0153] (5)加入700化RW化uffer，离屯、10000巧m，30s，弃去废液。
[0154] (6)加入500化RPE buffer,离屯、10000巧m，30s，弃去废液，重复一次。
[01巧](7)空管离屯、1000化pm，30s，弃去废液，弃去收集管。
[0156] (8)将RNeasy spin column转移到新的1.5mL离屯、管中，加入50化R化se-free water，室溫静置Imin，离屯、10000巧m，30s。测浓度。
[0157] 3、使用Promega公司的M-MLV反转录酶(货号M1701)进行反转录，体系及条件见下。 (1)配制液体：
(4)将液体混匀，瞬离，置于PCR仪中进行反转录。
[015引 击G
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0170] 表7
[0171]
[0172] 反应程序为95°C，5min;95°C，20s，60°C，20s，72°C，20s(45个循环）；72°C aOmin。
[0173] 本研究Q-PCR中所用的引物如下表8:
[0174] 表8 Q-PCR中所用的引物
[0175]
[0177] 5、PG化C与SS化C的标志蛋白表达分析
[0178] 将iPSC，诱导第屯天的PG化C，诱导第屯天的SS化C进行免疫巧光染色，来检测生殖 细胞标记蛋白的表达情况。免疫巧光染色的流程，
[0179] a)弃去细胞培养基，用DPBS(Gibco，14190250)洗两次，加入固定液（碧云天， P0098)，室溫固定化。
[0180] b)弃去固定液，加入DPBS洗3次，每次3-5min。
[0181] C)加0.2 % Tri tonX-100进行细胞膜的通透，室溫解育20min，用DPBS洗3次(膜蛋白 的免疫巧光染色省去此步骤）。
[0182] d)加入封闭液(碧云天，P0102，），室溫解育化。
[0183] e)弃去封闭液，加入一抗，室溫解育地。
[0184] f)弃去一抗，DPBS 洗 3 次。
[01化]g)加入二抗，室溫避光解育化。
[0186] h)弃去二抗，DPBS 洗 3 次。
[0187] i)加入DAPI染色Imin，DPBS洗3次，在培养皿中加入DPBS，进行观察拍照。
[018 引所选择的蛋白抗体(一抗)是 PRDM1、PRDM14、S0X17、STCLLA、DAZL、VASA、STRA8W 及 GFRal，一抗稀释比例均为1 :300dST化LA(货号abl9878,公司Abeam)，DAZL(ab：34139， Abeam)，VASA(abl3840，Abcam)，STRA8(ab49602，Abcam)，GFRal(ab84106，Abcam)，P畑Ml (9115，〔51')，口畑亂4(日628638,46。日111)，50乂17(81778，〔51')。二抗是1醇1付0邑611公司的邑0日1 anti-rabbit Alexa Fluor 594(货号A11037)。
[0189] 二、表观遗传学检测方法
[0190] 1、PGCLC与SSCLC的印记基因甲基化水平检测
[0191] 使用QIAGEN公司的基因组提取试剂盒(货号69504)?及幻moresearch公司的试剂 盒EZ DNA Methylation-Gold kit(货号D5005)进行甲基化水平检测，流程如下：
[0192] (1)基因组的提取：
[0193] a)用化yple将生长于饲养层细胞上的iPSC消化成单细胞，离屯、1000巧m，5min，弃 去上清。
[0194] b)用DPBS洗两次，离屯、1000巧m，5min，弃去上清。
[01巧]C)加18化L A化buffer重悬细胞沉淀，加2化L蛋白酶K，混合均匀，56°C金属浴解 育lOmin。
[0196] d)幹旋15s，加入200化AL buffer,幹旋混合均匀。
[0197] e)加入20化L无水乙醇，幹旋混合均匀。
[0198] f)将混合液体转移到DNeasy Mini spin column中，放到2mL接收管中，离屯、 8000巧m，Imin，弃去废液。
[0199] g)加入500化AW化uffer，离屯、8000巧m，lmin，弃去废液。
[0200] h)加入500化 AW2buffer，离屯、14000巧m，3min，弃去废液
[0201] i)将DNeasy Mini spin colu皿放到新的 1.5mL离屯、管中，加入60化 AE buffer， 室溫解育Imin。
[0202] j)离屯、，离屯、8000巧m，Imin，测浓度。
[0203] (2)在PCR管中加入基因组20化(质量200-500ng)，再加入Li曲tning Conversion Reagent 13化L，混合均匀，将15化L液体均分到3个PCR管中。
[0204] (3)将PCR管放到PCR仪中，程序为98°C，8min;54°C，60min;4°C，保存。
[0205] (4)加入600化 M-Binding Buffer到Zymo-Spin? IC Column中，再一起放到 Collection Tube上。
[0206] (5)将3个PCR管中的液体全部转移到上一步的巧mo-Spin? 1C Column中，将其与 M-Binding Buffer混合均匀。
[0207] (6)离屯、aOOOOx g，30s，弃去离屯、后的废液。
[020引 （7)在柱中加入100化M-Wash Buffer,离屯、，10000巧m，30s，弃去离屯、后的废液。
[0209] (8)在柱中加入200化 kDesul地onation Buffer,室溫静置20min，离屯、，:LOOOOx g，30s，弃去离屯、后的废液。
[0210] (9)在柱中加入200化M-Wash Buffer,离屯、，10000巧m，30s，弃去离屯、后的废液。
[0211] (10)将柱子放至1]1.5mL离屯、管中，加入 10化 M-Elution Buffer，离屯、，:L0000;rpm， 30 s，洗涂DM。样品放于-20°C冰箱保存。
[0212] (11)巢式 PCR:
[0213] 两轮PCR反应体系均如下表所示：
[0214] 表9
[0215]
[0216]
[0217]巢式PCR所用引物如下表所示：
[021引表10
[0219]
[0220] 反应程序如下表所示：
[0221] 表11
[09991
[0223] (12)将巢式PCR产物克隆到PMD-19T载体上，转化，挑取单菌落进行测序。
[0224] 2、PG化C与SS化C的组蛋白甲基化水平检测
[0225] 弃去iPSC和诱导第屯天的PG化C/SS化C培养液，DPBS洗3次，进行免疫巧光染色，流 程同上所述。所使用的抗体是H3K27me3和H2K9me2。H3K9me2(货号ab71604，公司Abcam)， 册K27me3(货号ab6002,公司Abeam).
[0。6] S、PG化C的转录组水平检测方法
[0227] (1)建库测序；
[022引（2)全基因组比对；
[0229] (3)基因表达水平分析:一个基因表达水平的直接体现就是其转录本的丰度情况， 转录本丰度越高，则基因表达水平越高。在RNA-seq分析中，可W通过定位到基因组区域或 基因外显子区的测序序列的计数来估计基因的表达水平。T0PHAT比对到参考基因组上的结 果，交给cuff 1 inks(v2.0.2)进行处理，W估计每个转录本的表达值。
[0230] (4)基因差异表达分析
[0231] a)基因表达水平对比
[0232] 通过所有基因的RPKM分布图W及盒形图对不同实验条件下的基因表达水平进行 比较。对于同一实验条件下的重复样品，最终的RPKM为所有重复数据的平均值。
[0233] b)差异表达分析
[0234] 基因差异表达的输入数据为基因表达水平分析中得到的readcount数据。对于有 生物学重复的样品，采用edgeR(v2.2.5)进行分析，采用Quantile的Normalization方法，选 取Pvalue小于0.05并且抑R小于0.01的基因作为差异表达的基因列出。
[0235] C)表达聚类分析
[0236] 聚类分析用于判断差异基因在不同实验条件下的表达模式;通过将表达模式相同 或相近的基因聚集成类，从而识别未知基因的功能或已知基因的未知功能；因为运些同类 的基因可能具有相似的功能，或是共同参与同一代谢过程或细胞通路。W不同实验条件下 的差异基因的RPKM值为表达水平，做层次聚类分析，不同颜色的区域代表不同的聚类分组 信息，同组内的基因表达模式相近，可能具有相似的功能或参与相同的生物学过程。所有样 品的表达量整理之后，交给地eatmap进行基因和样品的双向聚类。聚类的目的是基于物体 的相似性将物体分为不同的组，聚类图相当于某种意义上的分类图，在此分析中，W表达量 差异进行比较，作为衡量关系远近的标准。
[0237] (5)差异基因 GO富集分析
[023引 GO注释信息下载自Ensembl的610111日的数据库。GO的富集分析使用BiNG0(v2.44)进 行分。
[0239] 四、检测结果
[0240] A、猪诱导多能干细胞向原始生殖细胞样细胞PG化C的体外诱导分化
[0241 ] 1、PG化C的形成及其分子生物学水平检测
[0242] 1)上胚层干细胞化piblast stem cellJpiSC)的标记基因检测
[0243] 分别提取iPSC和EpiLC细胞的RNA反转录得到cDNA作为模板，结果如图2c，与iPSC 相比较，EpiLC高表达上胚层干细胞化piblast stem cell,化iSC)的标记基因 T皿S/0TX2/ RAB15。
[0244] EpiLC细胞在PG化C诱导培养基中诱导培养得到PG化C细胞，在此步骤诱导培养的 前4天，随着培养天数的增加，PGCLC会变紧实，细胞群体变大;然而，在培养第5天后，PGCLC 生长速率会下降，见图2d。
[0245] 2)PG化C的标记基因检测
[0246] 取在PG化C诱导培养基中诱导培养不同时间得到的PG化C细胞进行巧光实时定量 PCR(q-PCR)检测。
[0247] 结果如图2e，在第1/3/5/7天，多能性基因0CT4/S0X2会有一定程度的上升，而C- MYC会缓慢下降；在PG化C形成的过程中，P畑M1/P畑M14/S0X17有一定程度的上升;第1/3/5 天，STELLA会显著上调，随后便呈现下降趋势；与生殖细胞晚期发育相关的基因 DA化/VASA 则仅仅有少量上调，运与小鼠 PG化C上面的报道类似。
[0248] 3)PG化C细胞标志蛋白检测
[0249] 取在PG化幻秀导培养基中诱导培养7天得到的PG化C细胞进行免疫巧光染色。
[0250] 结果如图2f所示，可W看出，PGCLC中较多细胞表达ST化LA蛋白，少部分细胞表达 DA化/VASA蛋白，运与RNA水平上的检测相一致。
[0251] 运些结果表明，建立的诱导方法及流程能够有效并快速地将猪iPSC定向诱导分化 为PG化C。
[0252] 2、PG化C的表观遗传学检测
[0253] 在体内生殖细胞发育的过程中，PGC的表观遗传学会发生变化，包括DNA去甲基化 W及组蛋白修饰化3K27me3和册K9me2)。因此，检测了诱导的PG化C的印记基因甲基化水平 的表观特性。
[0巧4] PGCLC的组蛋白甲基化水平检测结果如图3a-3d所示，与iPSC相比，PGCLC的 册K27me3水平呈现上升趋势，册K9me2水平呈现下降趋势。运样的组蛋白甲基化动态变化与 体内猪胚胎期15天W后的PGC相一致。
[0巧5] 父源印记基因 IGF2/H19和母源印记基因 SNRPN的甲基化情况如下:PGCLC印记基因 甲基化水平检测结果如图3e所示，看出，PGCLC中两者的甲基化水平均呈现下降趋势。运表 明，在体外诱导的过程中，PGCLC已经启始了印记去除运一过程。该表观动态变化同体内迁 移的PGC W及到达性腺的PGC相一致。
[0256] 3、PG化C的转录组水平分析
[0巧7] 为了全面地了解PG化C的特征，通过RNA-seq技术进行PG化C转录组水平(mRNA)的 分析。
[0258] 诱导培养第0/3/5/7天得到的PG化C层次聚类分析结果如图4a所示，层次聚类分析 (Unsupervised hierarchical clustering analysis，UHC分析）将细胞分为两大群，一群 是iPSC，另一群是化iLC和PG化C。
[0259] 主成分分析(principal component analysis，PCA)也显示了一致的结果，掲示了 iPSC，EpiLC和PGCLC之间存在差异性，并且在诱导过程中细胞呈现有方向性的转化趋势，见 图4b。运些结果都表明，PG化C和iPSC有着不同的基因表达模式。
[0260] 在EpiLC的诱导第0/3/5/7天过程中，与化iSC相关的基因呈现上调趋势，见图4c。 运些结果与q-PCR结果相一致，见图2c。胎atmap结果显示，EpiLC与化iSC有相似的特征；与 iPSC相比，PGCLC会高表达一些与生殖细胞发育和迁移、精子发生、减数分裂W及配子产生 相关联的基因，见图4d。一旦细胞开始向生殖细胞分化，一些配子产生相关的基因，例如 TRIM27，TSSK3，D肥R24，DNAJA1和BRIX1会高表达;一些小鼠和人的生殖细胞减数分裂相关 的基因，例如ACTR2，PIM2和UBE2A也会高表达。随着诱导天数的增加，可W检测到与生精过 程和配子产生相关的基因，例如〇：^，4〇^1?18，]^1(，]?化5,5]\10,5服8。2和口刊61，见图4(1。9- PCR也验证了相关基因的表达，见图4e。通过基因本体分析(Gene ontology，G0)，发现第7天 PG化C与iPSC相比，最多富集的基因是和生精过程W及配子产生相关的基因，见图4f。
[0261] 总之，运些结果清楚地描述了体外PG化C定向诱导过程中，iPSC和PG化C两类细胞 的转录组水平的特性，表明PG化C呈现出与体内PGC相类似的基因表达模式和特征。
[0262] B、猪精原干细胞样细胞(SSCLC)检测
[0263] USSCLC的形成及其分子生物学水平检测
[0264] 精原干细胞(SSC)能够经过减数分裂形成精子，在生殖细胞发育过程中有重要的 作用。进一步将PG化C诱导分化形成SS化C。
[0265] 将不同天数的PG化C在SS化C诱导培养基中进行培养，发现EpiLC(即第0天PG化C) 和第3天PG化C可W发生形态变化。随着诱导天数的增加，出现SSC样的细胞集落，并会增大， 见图5曰。
[0266] SS化C标志基因 q-PCR检测，结果显示，生殖细胞标记基因 DA化会上调；一旦SSC样 的集落形成，SSC标记基因 STRA8也会上调，见图化；
[0267] SSCLC标志蛋白通过免疫巧光染色可W观察到，SSCLC中会有部分细胞表达生殖细 胞标记蛋白DA化/STRA8/GFRa 1，见图5c。
[0268] 单倍体细胞的标记基因 GSG2/TNP2/PRM2会有一定程度的上调，见图5曰。
[0269] 生殖细胞标记基因的表达趋势和从猪睾丸分离出来的SSC表达趋势相类似，见图 化和5g。
[0270] 2、流式细胞术分析单倍体细胞
[0271] (1)用Tryple将iPSC和第10天SS化C和第10天PSLC消化成单个细胞，离屯、lOOOrpm， 5min，弃去上清。
[0272] (2)用ImL培养基重悬细胞沉淀，加入Hoechst 33342染料进行染色，Hoechst 33342染料终浓度是10mg/mL，37°C水浴锅中解育50min，期间摇晃3-5次，此步及之后的步骤 中要在避光条件下进行操作。
[0273] (3)将染色后的细胞离屯、，100化pm，5min，弃去上清。
[0274] (4)用ImL DPBS洗3次细胞，每次离屯、，1000巧m，5min。
[0275] (5)用40皿的滤网过滤细胞，最终用50化L DPBS重悬细胞，置于冰上，准备流式细 胞分析单倍体细胞比例。
[0276] 结果如图5f，可W检测到单倍体细胞的存在，运显示，向SSC定向诱导分化后， SSCLC开启了减数分裂。W上结果表明，向SSC定向分化的体外培养体系，模拟了体内精子发 生事件，该体系有利于SS化C的产生。
[0277] 3、SSCLC的表观遗传学检测
[0278] 已有文章报道，在精子发生的过程中仍保留H3K27me3,而且在精原细胞中册K9me2 水平低，随后在精母细胞和精子中会高表达。
[0279] 对SS化C进行检测，结果显示SS化C中H3K27me3呈现上升趋势，H3脚me2呈现下降趋 势，见图5d。
[0280] 与iPSC相比较，IGF2A119的甲基化水平呈下降趋势；与PG化讨目比，甲基化水平会 略有升高，见图5e。运些表观特征的动态变化与体内SSC发育相类似。
[0281] n、PG化C和SS化C的体内分化实验及其检测
[0巧2] -、检测方法
[0283] 生殖细胞移植实验为供体细胞完成生精过程W及产生精子提供了良好的平台。由 于物种差异性，家畜大动物例如猪的细胞在小鼠曲细精管内无法完成完整的减数分裂W及 生精过程，但小鼠的曲细精管中的确可W为猪细胞的发育提供良好的微环境。
[0284] 1、曲细精管注射实验
[0285] (1)受体鼠的准备
[0286] 选用6周龄的小鼠（品系Nu/Nu、维通利华公司），按照40mg/kg的剂量，小鼠腹腔注 射白消安(Sigma B2935);-个月后，白消安处理的小鼠可W作为曲细精管注射的受体鼠进 行使用。
[0287] (2)曲细精管注射针的制备
[028引选择外径1.0mm，内径0.75mm，长度10cm的毛细玻璃管作为注射针;将毛细玻璃管 进行拉针和断针，注射针的尖端外径要求控制在50-60WI1范围内。注射时，需用ImL注射器连 接内径约1.0mm的塑料管，再连接注射针，进行细胞的注射。
[0289] (3)供体细胞的准备
[0290] 用化yple将诱导分化的第7-15天得到的PG化C和第7-15天得到的SS化C进行消化， 形成单细胞，然后1000巧m离屯、5min，弃去细胞上清液，用DPBS重悬细胞沉淀，然后用40皿的 滤网过滤细胞，最后进行细胞计数。每个睾丸组织需要取7-10X105个细胞，体积30-5化L， 置于冰上，进行注射。
[0291] (4)向曲细精管中注射细胞
[0292] a)腹腔注射麻醉剂，充分使小鼠麻醉。
[0293] b)将麻醉好的小鼠仰邸在操作台上，用酒精对腹部皮肤进行消毒，然后将腹部中 间进行切口，大小约为1cm，用綴子将其中一侧睾丸轻轻取出来。
[0294] C)将台吩蓝按照10%的比例加入到将要注射的细胞中，然后通过ImL注射器将细 胞吸入到注射针及其连接的塑料管中。
[0295] d)在睾丸和附睾之间的位置，有透明的输出小管，轻轻地移去输出小管周围的白 色脂肪。
[0296] e)将注射针针尖部分插入到透明输出小管中，沿着睾丸方向轻轻插入几毫米即 可。
[0297] f)轻轻地推动注射器的活塞，将细胞通过输出小管注射到睾丸曲细精管中，台吩 蓝作为指示。
[0298] g)当多数曲细精管中充满注射的细胞或者细胞即将注射完的时候，停止注射，将 注射针拨出。
[0299] h)用綴子轻轻地将睾丸放回腹腔。
[0300] i)用医用缝合针线缝合小鼠腹部皮肤。
[0301 ] j)将小鼠背部向上平放到37 °C恒溫台上，待其清醒恢复后，放回鼠笼，做好标记。
[0302] k)大于六周W后，检测注射细胞的小鼠睾丸组织。
[0303] (5)检测注射细胞的睾丸组织
[0304] (a)将小鼠通过脱颈的方法处死，用酒精消毒剪刀，綴子，W及小鼠腹部皮肤。剪刀 剪开小鼠部，取出注射过细胞的睾丸组织，放于含有少量DPBS的3.5cm培养皿中。
[0305] (b)转移至巧光显微镜下，观察完整睾丸是否有绿色巧光(注射的细胞为ZsGreen 绿色巧光）。
[0306] (C)剪破白膜，将曲细精管暴露在培养皿中，再仔细观察，曲细精管是否有绿色巧 光。
[0307] (d)将观察到含有绿色巧光细胞的曲细精管立即剥离出来，一部分冻存-20°C冰箱 用于后续基因组的提取;一部分放于4%多聚甲醒中固定，用于石蜡切片W及免疫组化的检 测。
[0308] (6)基因组的提取，方法同前所述。
[0309] 用于PCR的引物如下表12所示：
[0：310]表 12
[0311]
[0312] (7)对石蜡切片进行肥染色
[0313] a)脱蜡:切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3 次。无水乙醇洗5min，两次。90 %乙醇洗5min，两次，70 %乙醇洗5min，一次。蒸馈水洗5分钟， 两次。
[0314] b)用苏木精解育Imin，用蒸馈水洗10s; 1 %盐酸乙醇解育3s，用蒸馈水洗10s;促蓝 液反蓝10s，用蒸馈水洗30s。
[0315] c)用0.5%曙红液染色Imin，用蒸馈水洗10s ; 80%乙醇洗10s; 90%乙醇洗30s;无 水乙醇洗10s，两次;二甲苯中20s，两次。
[0316] d)用中性树胶进行封片。显微镜下观察拍照。
[0317] (8)对石蜡切片进行免疫巧光染色
[0318] a)脱蜡:流程同上所述。
[0319] b)抗原修复:将切片浸泡在抗原修复液（IX)中，微波炉低火加热约20分钟，室溫惊 凉切片。
[0320] C)接下来进行封闭等步骤，同前面所述。
[0321] 染色抗体为DA化（ab34139,Abeam)，VASA(abl3840,Abeam)，STRA8(ab49602, Abeam) ,GFRal (ab84106 , Abeam),。二抗是Invitrogen公司的goat anti-rabbit Alexa Fluor 594(货号A11037)。
[0；3剖二、检测结果
[0323] 1)PG化C的体内分化实验
[0324] 为了检测诱导的生殖细胞(PGCLC和SS化C)的发育能力，通过曲细精管注射，将诱 导培养7-15天的PG化C植入内源精子缺失的小鼠睾丸曲细精管中，见图6a。
[0325] 经检测，在曲细精管基底膜W及管腔中，可W检测到外源细胞(绿色阳性细胞），诱 导的PGCLC可W在小鼠的曲细精管中存活，并且可W形成细胞链W及细胞簇，见图6e。
[0326] 为了检测该绿色细胞为供体细胞，W含有绿色细胞的组织提取基因组作为模板， 通过PCR扩增外源pMXs-0ct4,见图6f，可W看出检测到的绿色细胞为注射进去的诱导的猪 PG 化C。
[0327] 通过免疫组化皿染色可W观察到，正常的、白消安处理过的W及供体细胞移植后 的睾丸结构存在差异性。正常的睾丸含有精原细胞W及成熟的精子，而白消安处理的睾丸 仅仅存在一个不含有精子的空腔，见图6c-6d;移植有PG化C的睾丸组织的形态类似于正常 睾丸组织的形态，见图6b，表明供体细胞在曲细精管中存活并有一定程度的发育。通过免疫 巧光染色，可W检测到生殖细胞标记蛋白DA化/VASA/STRA8/GFRa 1的表达，见图6g。
[032引2KSSCLC的体内分化实验
[0329] 将SS化C移植到小鼠曲细精管中，免疫巧光染色检测结果显示，运些SS化C可W形 成细胞链W及大的细胞簇，并能够表达生殖细胞标记蛋白DA化/VASA/STRA8/GFRa 1，见图7。
[0330] 移植后检测曲细精管中是否含有外源细胞时，对于含有绿色细胞的组织进行了下 一步的检测，对于不含有绿色细胞的曲细精管，做了免疫组化，肥结果显示曲细精管中呈空 腔;免疫巧光染色结果显示，生殖细胞标记蛋白染色呈阴性，见图8。
[0331] W上结果，可W看出诱导的猪生殖细胞PG化C/SS化C在体内有发育潜能，并呈现生 殖细胞的特性，说明小鼠曲细精管中可W为猪PG化C/SS化C的生长发育提供良好的微环境， 运一微环境可W提供必要的生长因子和激素等W促进外源供体细胞生长。
【主权项】
1. 一种猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的专用培养基，包括EpiLC诱导培 养基、PGCLC诱导培养基和SSCLC诱导培养基； 所述EpiLC诱导培养基中含有bFGF和ActivinA，且所述bFGF在所述EpiLC诱导培养基中 的浓度为8_16ng/mL，所述ActivinA在所述EpiLC诱导培养基中的浓度为12-20ng/mL; 所述PGCLC诱导培养基中含有BMP4、BMP8a、SCF、EGF和LIF，且所述BMP4在所述PGCLC诱 导培养基中的浓度为30-100ng/mL，所述BMP8a在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为30-100ng/mL，所述SCF在所述诱导PGCLC诱导培养基中的浓度为30-100ng/mL，所述EGF在所述 PGCLC诱导培养基中的浓度为30-100ng/mL，所述LIF在所述诱导PGCLC诱导培养基中的浓度 为5〇〇-l 5〇OU/mL; 所述SSCLC诱导培养基中含有睾酮、RA和GDNF，且所述的睾酮在所述SSCLC诱导培养基 中的浓度为〇. 5-10μΜ，所述RA在所述SSCLC诱导培养基中的浓度为0.5-10μΜ，所述⑶NF在所 述诱导SSCLC诱导培养基中的浓度为2-20ng/mL。2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于： 所述EpiLC诱导培养基中，所述bFGF在所述EpiLC诱导培养基中的浓度为12ng/mL，所述 ActivinA在所述EpiLC诱导培养基中的浓度为20ng/mL; 所述PGCLC诱导培养基中，所述BMP4在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述 BMP8a在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述SCF在所述PGCLC诱导培养基中的 浓度为50ng/mL，所述EGF在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述LIF在所述 PGCLC诱导培养基中的浓度为1000U/mL; 所述SSCLC诱导培养基中，且所述的睾酮在所述SSCLC诱导培养基中的浓度为ΙμΜ，所述 RA在所述SSCLC诱导培养基中的浓度为2μΜ，所述GDNF在所述SSCLC诱导培养基中的浓度为 4ng/mL〇3. 根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于： 所述EpiLC诱导培养基由KSC血清替代物、N2、B27、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2-Mercaptoethanol、DMEM、bFGF和 ActivinA 组成； 所述KSC血清替代物在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1 %-5 % ; 所述N2在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1 % ; 所述B27在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为2 % ; 所述GlutaMAX在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1% ; 所述DMEM在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为93.9-89.9 % ; 所述PGCLC诱导培养基由KSC血清替代物、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2_ Mercaptoethanol、GMEM、BMP4、BMP8a、SCF、EGF 和 LIF 组成； 所述KSC血清替代物在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为15 % ; 所述GlutaMAX在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1 % ; 所述GMEM在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为82.9 % ; 所述 SSCLC诱导培养基由 FBS、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2-Mercaptoethanol、DMEM、睾酬、RA 和 GDNF 组成； 所述FBS在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为15 % ; 所述GlutaMAX在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1% ; 所述DMEM在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为82.89 %。4. 根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于:所述培养基还包括iPSCs细胞 培养基， 所述iPSCs细胞培养基含有LIF、PD0325901和CHIR99021， 所述LIF在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为0.01 % ; 所述PD0325901在所述iPSCs细胞培养基中的浓度为1-3μΜ; 所述CHIR99021在所述iPSCs细胞培养基中的浓度为1-3μΜ; 和/或， 所述PD0325901在所述iPSCs细胞培养基中的具体浓度为ΙμΜ; 所述CHIR99021在所述iPSCs细胞培养基中的具体浓度为3μΜ。5. 根据权利要求4所述的培养基，其特征在于： 所述 iPSCs 细胞培养基由？1^、6111七&]\^父、1^〇116886111:1&1&111；[11〇&(^(18、2-Mercaptoethanol、DMEM、LIF、PD0325901 和 CHIR99021 组成， 所述FBS在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为15 % ; 所述GlutaMAX在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为0.1% ; 所述DMEM在所述iPSCs细胞培养基中的体积百分含量为82.89 %。6. -种猪多能干细胞定向诱导分化为精原干细胞样细胞的方法，为如下A或B， A所示的方法包括如下步骤： 1) 将离体的猪多能干细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述EpiLC诱导培养基中诱 导培养，得到上胚层干细胞样细胞； 2) 将所述上胚层干细胞样细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述PGCLC诱导培养基 中诱导培养，得到原始生殖细胞样细胞； 3) 将所述原始生殖细胞样细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述SSCLC诱导培养基 中诱导培养，得到精原干细胞样细胞。 B所示的方法包括如下步骤： a) 将离体的猪多能干细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述EpiLC诱导培养基中诱 导培养，得到上胚层干细胞样细胞； b) 将所述上胚层干细胞样细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述SSCLC诱导培养基 中诱导培养，得到精原干细胞样细胞。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 步骤1)中，所述诱导培养的时间为1-3天， 步骤2)中，所述诱导培养的时间为1-3天， 步骤3)中，所述诱导培养的时间为2-20天， 步骤a)中，所述诱导培养的时间为1-3天， 步骤b)中，所述诱导培养的时间为2-20天； 和/或，步骤1)中，所述诱导培养的时间具体为2天， 步骤2)中，所述诱导培养的时间具体为2天， 步骤3)中，所述诱导培养的时间具体为5-20天或7-15天， 步骤a)中，所述诱导培养的时间具体为2天， 步骤b)中，所述诱导培养的时间具体为5-20天或7-15天。8. -种猪多能干细胞定向诱导分化为原始生殖细胞样细胞的方法，包括如下步骤： 1) 将离体的猪多能干细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述EpiLC诱导培养基中诱 导培养，得到上胚层干细胞样细胞； 2) 将所述上胚层干细胞样细胞在权利要求1-5中任一所述中的所述PGCLC诱导培养基 中诱导培养，得到原始生殖细胞样细胞。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于： 步骤1)中，所述诱导培养的时间为1-3天， 步骤2)中，所述诱导培养的时间为1-3天， 和/或，步骤1)中，所述诱导培养的时间具体为2天， 步骤2)中，所述诱导培养的时间具体为2天。10. 权利要求6或7所述的方法制备的精原干细胞样细胞； 或权利要求8或9所述的方法制备的原始生殖细胞样细胞； 或权利要求6或7所述的方法或权利要求8或9所述的方法或所述精原干细胞样细胞或 所述原始生殖细胞样细胞在精子发育研究中的应用。
【文档编号】C12N5/0735GK106047800SQ201610451277
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】韩建永, 王寒凝, 相金柱
【申请人】中国农业大学