Car?t细胞及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种CAR?T细胞及其制备方法与应用，其中，所述CAR?T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞内信号传导区为CD28?X?ITAM，其中，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。本发明CAR?T细胞的chA21scFv能够表达抗HER2单克隆抗体，且以HER2蛋白为靶向直接识别并结合肿瘤细胞表面高表达的HER2蛋白，从而活化T细胞而分泌杀伤表达HER2蛋白的肿瘤细胞的细胞因子。
【专利说明】
CAR-T细胞及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明设及T淋己细胞技术领域，尤其设及一种CAR-T细胞及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] CAR-T细胞(Qiimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞）即是表达 嵌合抗原受体修饰的T细胞，而CAR-T细胞的嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor， CAR)包括胞膜外抗原结合区、较链区和胞内信号传导区S部分构成。其中，胞膜外抗原结合 区是一段单链可变区结构域(single chain Fv domain，scFv)，具有特异性识别并结合TAA (Uimor-associated antigen，肿瘤相关性抗原）的功能。scFv的构成是将单克隆抗体的重 链可变区（the variable region of heavy chain, VH)和轻链可变区（the variable region of li曲t chain,化）用一可弯曲的多肤接头化inker)将VH和化连接起来，构成￥护 Linker-VU^VkLinker-VH。较链区通常是由免疫球蛋白超家族组成，比如CD8、CD28和IgG。 胞内信号传导区包括共刺激分子kostimulatory molecule,CM)和免疫受体酪氨酸活化基 序（immunorec邱tor tyrosine-based activation motifs, ITAM)，其中，CM通常为CD28， ITAM通常为CD3C或化eRI 丫。表达CAR的T细胞可通过scFv直接识别并结合肿瘤细胞表面的 TAA，CA时尋信号传入T细胞内，激活T细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF- 丫、TNF-a 等，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。因此，CAR-T细胞是MHC非限制性的。CAR-T细胞将抗体-抗 原特异性结合能力W及T细胞介导的杀伤功能结合于一体，是免疫抗肿瘤治疗的重要方法。 嵌合性抗原受体方法应用的关键是确定一种肿瘤相关性抗原，在肿瘤细胞表面高表达，而 在正常组织中无表达或者低表达。
[0003] 原癌基因人上皮生长因子受体2化uman邱idermal growth factor receptor 2， 化r-2/neu)又称肥R2或c-erbB-2基因，在多种肿瘤的发病及临床进程中发挥重要作用，体 外与动物实验己明确显示化r-2/neu基因扩增、蛋白过度表达在致瘤转化和肿瘤发展中起 着关键作用。研究证实：30% W上的人类肿瘤组织中，如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵 管癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、头颈部鱗癌、非小细胞性肺癌等，均伴有 Her-2/neu基因的扩增及pl85蛋白的过度表达，而正常组织中pl85蛋白为阴性或微量表达。 而在乳腺癌中，大约有1/3的病人过表达肥R2蛋白。过表达皿R2蛋白使肿瘤的侵袭性更强， 是乳腺癌病人预后不良的独立的危险因素。尽管抗肥R2单克隆抗体(如曲妥株单抗)在临床 的应用使部分病人获益，但是其价格昂贵，很大程度上限制了其大规模临床应用。皿R2蛋白 位于细胞表面，容易被抗体识别，因此，皿R2蛋白可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想 祀点。
[0004] 然而，现有技术中并未提供表达抗皿R2单克隆抗体的CAR-T细胞，即现有的CAR-T 细胞并不能W皿R2蛋白为祀向而直接识别并结合肥R2蛋白，导致CAR无法将信号传入T细胞 内，而无法分泌杀伤高表达肥R2蛋白的肿瘤细胞的细胞因子。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于提供一种CAR-T细胞，旨在表达抗皿R2单克隆抗体，而W HER2蛋白为祀向直接识别并结合肿瘤细胞表面高表达的HER2蛋白。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗 原结合区、较链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的 cM21scFv;所述胞内信号传导区为CD28-X-ITAM，其中，所述X为10)5、〔0137、〔0134、〔080或 者CD86共刺激分子。
[0007] 优选地，所述X为IC0S共刺激分子。
[000引本发明还提供一种CAR-T细胞的制备方法，包括步骤如下：
[0009] 构建CAR表达载体，其中，所述CAR表达载体的CAR包括胞膜外抗原结合区、较链区 和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21scFv，所述胞内信 号传导区为CD28-X-ITAM，所述X为10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子；
[0010] 包装所述CAR表达载体，而制得感染混合物；
[0011] 将所述感染混合物感染T细胞，而制得CAR-T细胞。
[0012] 优选地，所述构建CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：
[0013] 获取所述chA21scFv的基因片段、所述较链区的基因片段、所述CD28的基因片段、 所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段；
[0014] 提供引导链，基因融合所述引导链与所述chA21scFv的基因片段，而形成引导链- chA21scFv；
[0015] 基因融合所述较链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述 ITAM的基因片段，而形成较链区-CD28-X-ITAM;
[0016] 基因融合所述引导链-chA21scFv和所述较链区-CD28-X-ITAM，而形成引导链- cM21S cFv-较链区-CD28-X-ITAM;
[0017] 将所述引导链-cM21scFv-较链区-CD28-X-ITAM接入载体，而获得CAR表达载体。
[0018] 优选地，所述获取所述chA21scFv的基因片段、所述较链区的基因片段、所述CD28 的基因片段、所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段的过程中，包括步骤如下：
[0019] 获取并激活PMBCs;
[0020] 提取所述PMBCs的mRNA并反转录为cDNA;
[0021] 分别提供所述较链区的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物， 且均W所述PMBCs的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，而获得所述较链区的基因片段、所述 CD28的基因片段、所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段；
[0022] 提供所述chA21scFv的模板DNA和所述chA21scFv的引物，并进行PCR扩增，而获得 所述cM21scFv的基因片段。
[0023] 优选地，所述CAR表达载体为CAR表达病毒质粒。
[0024] 优选地，所述包装所述CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：
[0025] 将12~20yg的包装质粒与12~20yg的所述CAR表达病毒质粒通过培养基共混，而 获得质粒混合物；
[0026] 将所述质粒混合物与35~45iU的脂质体通过培养基共混，而获得混合液；
[0027] 将所述混合液转染真核细胞，而获得所述真核细胞的上清液；
[00%]浓缩所述上清液，而制得感染混合物。
[0029] 优选地，所述将所述感染混合物感染T细胞的过程中，包括步骤如下：
[0030] 将0.8~2ml的感染混合物加入(6~10) X105个T细胞中而进行感染；
[0031 ]将凝聚胺加入所述T细胞中，使所述凝聚胺的终浓度为10~20μg/ml;
[0032] 培养扩增感染后的T细胞，而获得CAR-T细胞。
[0033] 优选地，所述X为IC0S共刺激分子。
[0034] 本发明还提供一种如上所述的CAR-T细胞在治疗乳腺癌的药物上的应用。
[0035] 本发明技术方案，通过表达chA21scFv而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的皿R2 蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而活化T细胞，促进T细胞分泌细胞因子， 该细胞因子进而可W杀伤高表达皿R2蛋白的肿瘤细胞。而且，胞内信号传导区整合了CD28 共刺激分子W及X共刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤 细胞作用。
【附图说明】
[0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W 根据运些附图示出的内容获得其他的附图。
[0037] 图1为本发明实施例1制备的CAR表达载体的基因结构图；
[003引图2为化ISA法检测本发明实施例1制备的CAR-T细胞及现有的NT-T细胞分别与 肥R2+/-肿瘤细胞的共培养后的IFN- 丫分泌量的柱状图；
[0039] 图3为化ISA法检测本发明实施例1制备的CAR-T细胞及现有的NT-T细胞分别与 肥R2+/-肿瘤细胞的共培养后的IL-2分泌量的柱状图；
[0040] 图4为ELISA法检测本发明实施例1制备的CAR-T细胞的肥R2特异性的统计图；
[0041] 图5为siCr释放试验检测本发明实施例1制备的CAR-T细胞对乳腺癌细胞的特异性 杀伤作用的统计图。
【具体实施方式】
[0042] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[00创本发明提供一种CAR-T细胞，其中，该CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、较 链区和胞内信号传导区，胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21scFv;胞内信号传 导区为 CD28-X-ITAM，其中，X为 10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子。
[0044] 本发明CAR-T细胞通过表达chA21scFv而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的皿R2 蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而活化T细胞，促进T细胞分泌细胞因子， 该细胞因子进而可W杀伤高表达皿R2蛋白的肿瘤细胞。而且，胞内信号传导区整合了CD28 共刺激分子W及X共刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤 细胞作用。
[0045] 需要说明的是，在该CAR的结构中，chA21为采用表面包埋法（surface epitope masking method，SEM)生产的人源化单克隆抗体A21，是一种抗化bB2抗体，其具有很强的结 合特异性和抑瘤活性，chA21可特异性识别肥R2胞外区C-端的第I结构域，远离皿R2受体二 聚化功能位，因此，本发明W抗肥R2的chA21为基础构建CAR-T细胞;chA21S cFv由cM21单克 隆抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域通过多肤接头连接形成，由于不少供应商或科 研机构已经成功合成chA21scFv，且合成方法也为现有技术，故该chA21scFv可W直接由供 应商或科研机构提供。较链区可W是CD3、CD4、CD8、或者CD28，具体视实际情况而定。胞内信 号传导区的共刺激分子X可为10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子，均可起到传导 信号的作用，实现T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞的目的;胞内 信号传导区的ITAM通常为CD3C或者化eRI 丫。
[0046] 本发明还提供一种CAR-T细胞的制备方法，包括步骤如下：
[0047] S1、构建CAR表达载体，其中，CAR表达载体的CAR包括胞膜外抗原结合区、较链区和 胞内信号传导区，胞膜外抗原结合区为用于结合皿R2蛋白的chA21scFv，胞内信号传导区为 CD28-X-口AM，X为 IC0S、CD137、CD134、CD80 或者 CD86 共刺激分子；
[004引 S2、包装CAR表达载体，而制得感染混合物；
[0049 ] S3、将感染混合物感染T细胞，而制得CAR-T细胞。
[0050]本发明CAR-T细胞的制备方法通过构建CAR表达载体，并通过包装、转染的方式将 CAR表达载体接入T细胞中，由于该CAR表达载体表达抗皿R2单克隆chA21，从而可W识别和 结合肿瘤细胞表面高表达的肥R2蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而T细 胞激活，促进T细胞分泌细胞因子，该细胞因子进而可W杀伤高表达皿R2蛋白的肿瘤细胞。 该制备方法高效、简单、成本低。
[0051 ] 进一步地，在步骤S1中，构建CAR表达载体的过程中，具体包括步骤如下：
[0052] S10、获取chA21scFv的基因片段、较链区的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片 段W及ITAM的基因片段；
[0053] S11、提供引导链，基因融合引导链与chA21scFv的基因片段，而形成引导链- chA21scFv；
[0054] S12、基因融合较链区的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段和ITAM的基因片 段，而形成较链区-CD28-X-ITAM;
[005引 S13、基因融合引导链-chA21scFv和较链区-CD28-X-ITAM，而形成引导链- cM21S cFv-较链区-CD28-X-ITAM;
[0056 ] S14、将引导链-cM21S cF V-较链区-CD28-X-1TAM接入载体，而获得CAR表达载体。
[0057] 通过PCR扩增技术和重叠 PCR技术，将chA21scFv的基因片段、较链区的基因片段、 CD28的基因片段、X的基因片段W及ITAM的基因片段进行基因融合，而构建CAR表达载体，其 构建方式高效、简单。需要说明的是，该引导链优选为人CD8a引导链，人CD8a引导链可W从 人CD8a细胞中提取，也可W从相应的供应商中获取，而人CD8a引导链的引物可由相应的供 应商提供。
[005引进一步地，步骤S10具体包括步骤如下：
[0059] S100、获取并激活PMBCs(pe;ripheral blood mononuclear cells,外周血单核细 胞)；
[0060] SlOl、提取 PMBCs 的 mRNA 并反转录为 cDNA;
[00川 S10 2、分别提供较链区的引物、CD28的引物、X的引物和I TAM的引物，且均w PMBCs 的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，而获得较链区的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片 段W及ITAM的基因片段；
[0062] S103、提供chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物，并进行PCR扩增，而获得 cM21scFv的基因片段。
[0063] 通过PMBCs获得T细胞的mRNA,然后将mRNA反转录为cDNA，从而为不同种类的T细胞 的基因片段的扩增提供了模板，同时通过现有的chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物 对cM21scFv进行PCR扩增，显然，上述PCR扩增高效、简便，有利于提供CAR表达载体的构建。
[0064] 进一步地，CAR表达载体为CAR表达病毒质粒，换而言之，步骤S14中，将引导链- chA21scFv-较链区-CD28-X-ITAM接入了病毒载体，而形成了CAR表达病毒质粒，其中，该病 毒载体可W是逆转录病毒或者慢病毒，并通过质粒的形式存在。
[0065] 进一步地，在步骤S2中，包装CAR表达载体的过程中，具体包括步骤如下：
[0066] S20、将12~20yg的包装质粒与12~20yg的CAR表达病毒质粒通过培养基共混，而 获得质粒混合物；
[0067] S21、将质粒混合物与35~45iil的脂质体通过培养基共混，而获得混合液；
[0068] S22、将混合液转染真核细胞，而获得真核细胞的上清液；
[0069] S23、浓缩上清液，而制得感染混合物。
[0070] 通过对CAR表达载体的包装，可W提高为CAR表达病毒质粒的感染效率，从而提高 CAR-T细胞的制备效率。
[0071 ] 进一步地，步骤S3中，将感染混合物感染T细胞的过程中，包括步骤如下：
[0072] S30、将0.8~2ml的感染混合物加入(6~10)X105个T细胞中而进行感染；
[0073] S31、将凝聚胺加入T细胞中，使凝聚胺的终浓度为10~20iig/ml;
[0074] S32、培养扩增感染后的T细胞，而获得CAR-T细胞。
[0075] 该凝聚胺转染剂可W提高T细胞的感染效率，实现对T细胞的修饰。
[0076] 本发明还提供一种如上所述的CAR-T细胞在治疗乳腺癌的药物上的应用。
[0077] 由于CAR-T细胞通过表达chA21scFv而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的皿R2蛋 白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而活化T细胞，促进T细胞分泌细胞因子，该 细胞因子进而可W杀伤高表达皿R2蛋白的肿瘤细胞，因此，该CAR-T细胞应用于治疗乳腺癌 时，由于乳腺癌细胞的表面高度表达肥R2蛋白，可W高效杀伤乳腺癌细胞。
[0078] 现通过实施例1对本发明CAR-T细胞及其制备方法与应用做进一步解释和说明，在 该CAR-T细胞中，CAR的胞内信号传导区的X共刺激分子优选为IC0S共刺激分子，CAR-T细胞 具体构建方式参见如下详述的内容。同理，根据下述的构建方式，可W构建X共刺激分子为 其他共刺激分子时的CAR-T细胞，至于X共刺激分子的引物序列可W从NCBI的GenBank中查 找获得，X共刺激分子的引物可W相应的商家中购买获得，也可W自行设计。
[0079] 实施例1
[0080] -、本发明实施例所用到的材料及试剂
[0081] 1、人外周血单核细胞
[0082] =位健康志愿者的外周血单核细胞来源于北京大学深圳医院肿瘤介入科。
[0083] 2、细胞系
[0084] 人乳腺癌细胞株5邸1?3^470，]\?^-7，]\?^-]\?-231和卵巢癌细胞株51(0￥3,0￥〔4尺3， A1847和A2780, W及肥R2阴性的肿瘤细胞株MDA-MB-468(购买于ATCCKTC-1是HPV-16转染 的小鼠肺癌细胞，用来作为人肥R2阴性表达的对照，也购买于ATCCd293T细胞购买于ATCC。
[0085] 3、试剂
[0086] (1 )RPMI-1640培养基（Invitrogen 公司）
[0087] (2)灭活胎牛血清（Invitrogen公司）
[0088] (3)青一链霉素 lOOOOU/ml lOOOOIU/mKlnvitrogen公司）
[0089] (4)抗CD3/抗CD28磁珠 （Inv i trogen公司）
[0090] (5)重组人白介素-2(比-2)(Peprol'ech公司）
[0091 ] (6)DMS0(二甲基亚讽）（Invitrogen 公司）
[0092] (7)0.25% 膜酶（Invitrogen 公司）
[0093] (8化TS1077淋己细胞分层液(上海研谨生物科技有限公司）
[0094] (9 )mRNA 提取试剂盒（Invi trogen公司）
[00M] (10)反转录试剂盒（Invitrogen公司）
[0096] (11 )PCR 试剂盒（Invitrogen 公司）
[0097] (12)PCR产物纯化试剂盒(Qiagen公司）
[009引 （13)含有人源化抗肥R2的cM21 scFv的质粒阳E14-CM21 (中国科技大学提供）
[0099] (14)人CD8a 引导链（CDSaleader链）（hkara公司）
[0100] (15)人CD8a引导链的正向引物AF (Takara公司）
[0101] (16) CD8a较链区（CDSahinge)的正向引物CF和反向引物CR( Takara公司）
[0102] (17) CD28的正向引物DF和反向引物DR (Takara公司）
[0103] (18) I COS的正向引物GF和反向引物GR (Takara公司）
[0104] (19)CD3C的正向引物EF和反向引物邸(Takara公司）
[0105] (20)cM21scFv的正向引物BF和反向引物BR^akara公司）
[0106] (21)口10.6质粒、口101^邑/口质粒、1?6￥表达质粒(〇1曰邑6]1公司）
[0107] (22)F]；TC标记的山羊抗鼠 F(ab'）2抗体(Jackson ImmunoResearch公司）
[0108] (23)APC CY7标记的抗人-CD3,阳标记的抗人-CD45，FITC抗人-CD4,阳抗人-CD4， APC抗人-CD8，阳抗人CD45R0，APC抗人CD6化抗体(B i 01 egend公司）
[0109] (24) IFN- 丫化ISA试剂盒(Biolegend公司）
[0110] (25)比-沈 LISA 试剂盒(Biolegend 公司）
[0111] (26)肥R2-FC嵌合蛋白（R&D Systems公司）
[0112] (27)CD19-FC嵌合蛋白（S阳邸BioSystems公司）
[0113] (28)铭酸钢(Na25iCr〇4)(D证ont 肥N公司）
[0114] (29)FITC 兔抗人肥 R2 抗体(Clone24D2，Biolegend 公司）
[0115] (30)脂质体2000( Invi trogen公司）
[0116] (31)凝聚胺(Sigma 公司）
[0117] 4、引物序列表
[011引 表一
[0119]
[0120] 二、本实施例的技术方案
[0121] ( -）、外周血单核细胞的分离与激活
[0122] 1、人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分离
[0123] (1)抗凝血管抽取健康志愿者的外周血15ml;
[0124] (2)向该抗凝血管中加入等体积的PBS，轻轻吹打成细胞悬液30ml;
[01巧](3)另取两支50ml离屯、管，向一离屯、管加入15ml的LTS1077淋己细胞分层液;然后， 用吸管吸取15ml的细胞悬液，在距离LTS1077淋己细胞分层液上方1cm处将细胞悬液小屯、而 缓慢的加入，使细胞悬液重叠于LTS1077淋己细胞分层液上，200化pm离屯、20min;
[0126] (4)取出离屯、后的离屯、管，移液管吸去最上层的血浆，移液枪吸取血浆层下的单个 核细胞置入另一离屯、管中；然后，加入15ml的PBS洗涂，轻轻吹打均匀后再次离屯、，150化pm， lOmin，去掉上清;共洗涂3次；
[0127] (5)向去掉上清后的离屯、管内加入含10%灭活胎牛血清、lOOU/ml青一链霉素、 lOOU/ml IL-2的RPMI-1640培养基，放置于37°C，5%C02的细胞培养箱中培养，而分离获得 PBMC细胞制剂。
[0128] 2、人外周血单核细胞的激活
[0129] (1)取步骤1获得的PBMC细胞制剂，于24孔板中种植IxlO6个PBMC细胞（1 X lOVml);
[0130] (2)按照免疫磁珠分选试剂盒的说明书的方法，用PBS将包被抗CD3/CD28的磁珠洗 3遍；
[0131] (3)将磁珠按3:1 (磁珠:细胞)比例加入PBMC细胞中，放置37°C、5 %C化培养箱中培 养过夜；
[0132] (4)细胞激活12~24小时后，离屯、，收取被激活的人外周血单核细胞，用作提mRNA 并反转录为cDNA。
[0133] (二）、提取激活的外周血单核细胞的mRNA并反转录为cDNA
[0134] 1、外周血单核细胞的mRNA的提取
[013引（1)取出被激活后的人外周血单核细胞1.5 X106个，用PBS冲洗2遍；
[0136] (2)去掉上清后，向细胞沉淀中加入1.5ml的化izol，吹打成均匀细胞悬浮液；
[0137] (3)采用1ml注射器来回抽吸细胞悬浮液，W剪切基因组DNA，然后用注射器直接将 样品转移到一新的1.5ml的EP管中；
[0138] (4)向EP管中加入25化1的氯仿，剧烈震荡30sec，12000巧m离屯、5min;
[0139] (5)将离屯、后产生的上清移至另一新的1.5ml的Ep管中，并加入等体积的异丙醇， 室溫放置5min;
[0140] (6) 12000巧m离屯、5min，吸走上清液；
[0141] (7)向吸走上清液后的Ep管中加入70 %的乙醇750iil，不需吹打，12000巧m离屯、 2min;
[0142] (8)尽可能彻底吸走离屯、后产生的上清，室溫干燥使乙醇挥发，而形成沉淀；
[0143] (9)向该沉淀加入60]il的DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙醋）水，而溶 解该沉淀，即溶解外周血单核细胞的mRNA;
[0144] (10)取溶解的mRNA化1，加至1ml的DEPC水中，采用紫外分光光度计测量260nm和 280nm 的吸光度值:00260/280 = 1.9~2.0;按10D = 40yg的 mRNA 计算 mRNA 的产率，0D260/280 在1.9~2.0视为提取的mRNA纯度很高；
[0145] (11)用提取的RNA产物来进行下一步的RT反应。
[0146] 2、RT(Reverse Transcription,反转录）反应
[0147] (1)将步骤1提取的mRNA与其他试剂构成如下的反应体系：
[0149」 （2)RT反应余件：室溫，lOmin ; 42"C，Ih ; 99"C，5min火巧AMV Reverse Transcriptase;进而反转录获得PMBCs的cDNA;
[0150] (3)将反转录得到的PMBCs的cDNA置于-80°C冰箱保存，备用。
[0151] (;)、祀向肥R2的嵌合性抗原受体(CAR)载体的构建
[0152] 1、PCR 扩增。114213。尸￥、〔08地111邑6、〔028、10)5和〔03(
[0153] 1.UPCR 扩增 cM21scFv
[0154] a、提供cM21scFv的DM模板及cM21scFv的引物：
[0155] cM21scFv的DNA模板由中国科技大学提供的质粒阳E14-CM21获得；chA21scFv的 正向引物BF和反向引物BR由化kara公司提供，其引物系列具体见上表一）；
[0156] b、按照如下的PCR反应体系和PCR反应条件获得PCR产物；
[0157] PCR反应体系： 「015只 1
[0161] C、电泳
[0162] 配制琼脂糖凝胶(20g/L):称取0.6g的琼脂糖凝胶粉，加入30ml的TAE电泳缓冲液， 混匀后放入微波炉中加热45s，加入lul的邸液，混匀后灌注，室溫冷却；向电泳槽中加入适 量TAE电泳缓冲液，用化2000作为DNA Marker，向样本孔中加入加1的上述PCR产物，调节电 泳仪电压为90mV，电泳半小时；
[0163] d、结果观察
[0164] 利用数码凝胶图像采集与分析系统进行扫描分析可知：上述PCR产物为chA21scFv 基因片段；
[01化]e、PCR产物回收
[0166] (1)将电泳后余下的PCR产物转移至2ml的EP管中，加入300ul的PB缓冲液，充分混 匀；
[0167] (2)吸附：QIAquick柱子链接2ml的EP管，将含PCR产物的PB缓冲液缓慢加入 QIAquick柱子，13000转/分离屯、30秒；
[016引（3)洗涂:弃去EP管中的液体，向QIAquick柱子中加入800ul的阳缓冲液，13000转/ 分离屯、30秒；
[0169] (4)弃去EP管中的液体，13000转/分离屯、1分钟；
[0170] (5)洗脱:将QIAquick柱子置于新的1.5ml的EP管中，向柱子中加入60ul的邸缓冲 液，13000转/分离屯、1分钟，弃去EP管中的液体而回收PCR产物；
[0171] (6)将回收后的PCR产物置于-20°C冰箱保存。
[0172] 1.2、PCR 扩增 CDSahinge、CD28 和 CD3C
[0173] a、提供引物W及步骤(二)制得的PBMCs的cDNA:
[0174] CDSahinge的正向引物CF和反向引物CR由化kara公司提供，其引物系列见上表一；
[0175] CD28的正向引物DF和反向引物DR由化kara公司提供，其引物系列见上表一；
[0176] IC0S的正向引物DF和反向引物DR由化kara公司提供，其引物系列见上表一；
[0177] CD3C的正向引物EF和反向引物邸由化kara公司提供，其引物系列见上表一；
[017引b、按照如下的PCR反应体系和PCR反应条件获得PCR产物；
[0179] PCR反应体系： QAl
[i
0182 0183 0184 0185 0186 0187 123456 PCR反应条件:与PCR扩增cM21scFv的PCR反应条件相同； 2 c、PCR产物回收(与PCR扩增chA21scFv的PCR产物回收的步骤相同），进而获得CD8a hinge/CD28/lC0S/CD3C 的 PCR 产物。 3 2、重叠 PCR而进行基因融合 4 2.1、提供 CDSaleader 链（CD8a 引导链），将 CDSaleader 链与 PCR 扩增后的 cM21scFv 进行基因融合，而形成CD8aleade;r-cM21scFv: 5 a、第一步PCR反应，其反应体系和反应时间如下； 6 第一步PCR反应体系：
[018 引
[0191] b、第二步PCR反应，其反应体系和反应时间如下；
[0192] 第二步PCR反应体系：向第一步PCR反应完成后的体系中加入CDSaleader链的正向 引物AF (其引物系列如表一所示）W及cM21S cFv的反向引物BR (其引物序列如表一所示)各 2ul；
[0193] 第二步PCR反应条件：
[0194]
[01M] e、将第二步PCR反应的PCR产物进行电泳，数码凝胶图像采集与分析系统进行扫描 分析，而证明第二步PCR反应的PCR产物为CD8aleader-cM21scFv;
[0196] f、第二步PCR反应的PCR产物回收(与PCR扩增chA21scFv的PCR产物回收的步骤相 同），而获得CD8aleade;r-cM21scFv;
[0197] 2.2、将扩增后的〔08地1雌6与扩增后的〔028进行基因融合，获得〔08地1雌6-〔028;
[0198] 将 CD8ahinge-CD28 与扩增后的 IC0S 进行基因融合，获得 CD8ahinge-CD28-IC0S;
[0199] 将 CD8ahinge-CD28-IC0S 与扩增后的 CD3C 进行基因融合，获得 CD8ahinge-CD28- IC0S-CD3C;
[0200] 将 CD8aleader-cM21scFv 与 CDS 址 inge-CD28-IC0S-CD3C 进行基因融合，获得 CD8a leader-cM21scFv-CD8ahinge-CD28-IC0S-CD3C，其基因结构如图 1 所示；
[0201] 具体方法同上，其中，CDSahinge与CD28融合过程中所添加的引物为CF，DR;CD8a hinge-CD28与IC0S融合过程中所添加的引物为CF，GR;CD8址inge-CD28-IC0S与CD3C融合过 程中所添加的引物为〔。，63;〔08日16日(16'-证4213。。￥与〔08地1叫6-〔028-10)5-〔03(融合过 程中所添加的引物为AF，ER(引物序列如表一所示）。将PCR产物进行电泳，数码凝胶图像采 集与分析系统进行扫描分析，最终回收PCR产物CD8aleader-chA21scFv-CD8ahinge-CD28- IC0S-CD3C。
[0202] 3、将 CD8aleader-cM21scFv-CD8ahinge-CD28-IC0S-CD3C 交由美国剑桥加基因公 司(Addgene，Camb;ridge，MA，USA)接入 pSin(慢病毒)骨架形成 pSin-chA21-28C 质粒，即 CAR 表达载体。
[0203] (四）包装CAR表达载体(包装pSin-cM21-28。區病毒质粒），而制得感染混合物
[0204] U293T细胞传代培养及准备 [02化]a、293T细胞复苏及培养
[0206] (1)细胞培养基:配置含10%灭活胎牛血清、lOOU/ml青一链霉素的RPMI-1640培养 基；
[0207] (2)从液氮罐取出冻存的293T细胞，迅速放入37°C水浴锅，冻存的293T细胞融化 后，在超净台内将细胞悬液移入离屯、管中，加入4ml的RPMI-1640培养基，放入离屯、机中， 1000转/分离屯、3~4分钟；
[020引（3)弃去上清液，加入1ml配制的RPMI-1640培养基轻轻吹打成细胞悬液，移入 75cm2细胞培养瓶中，加入RPMI-1640培养基至10ml，放入37°C，5%C02的细胞培养箱中培养， 24小时后给予换液；
[0209] b、293T细胞传代
[0210] 培养皿中的细胞布满约80~90%时进行传代。将旧的培养基吸走，向培养皿中加 入2~3ml的PBS冲洗1遍，吸走PBS，向培养皿中加入0.25 %的膜蛋白酶2ml，消化3~5min，注 意在倒置显微镜下观察细胞形态的变化，当见到细胞回缩，形态变圆，细胞间连接间隙增大 时，向培养皿中加5ml的RPMI-1640培养基终止消化，吸管反复吹打使细胞脱落，制成细胞悬 液后，按大约1:化k例传代培养；
[0211] c、293T细胞冻存
[0212] (1)生长状态良好的细胞，布满培养瓶约80~90%时可W冻存。细胞消化后吹打成 细胞悬液，移入15ml离屯、管中，放入离屯、机中，1000转/分离屯、3~4分钟；
[0213] (2)弃去上清液，加入含10%二甲基亚讽的灭活胎牛血清1ml，轻轻吹打成细胞悬 液，移入细胞冻存管中，做好标记，置入冰上，并迅速投入液氮罐中保存。
[0214] 2、慢病毒质粒的包装
[0215] (1)取出冻存的293T细胞，并置于75cm2的细胞培养瓶培养;选取融合度60~70% 的293T细胞，换液后S小时后备用；
[0216] (2)将巧巾包装质粒9]\?).6、9]\?)1^9、1?6￥及95111-证421-2化质粒按下表比例于11111 无血清无双抗的37 °C预热的RPMI-1640中混合均匀，室溫解育5分钟，而获得质粒混合物； rn9i7i
[0218] (3)将26iig的上述质粒混合物与3化1脂质体2000(质粒与脂质体2000的比率为化 g: 1.扣1)逐滴加入1ml无血清无抗生素的RPMI-1640中轻轻混合均匀，室溫解育5分钟，而获 得混合液；
[0219] (4)将最终的脂质体2000及质粒共混物的混合液逐滴加到293T细胞培养皿中，轻 轻混合均匀，37 °C、5 % C0播养箱中培养；
[0220] (5川欠集转染24小时和48小时的293T细胞上清液；
[0221] (6)取收集的293T细胞上清液约35ml，收集于50ml离屯、管中，2000转，10分钟，去除 293T细胞碎片，而获得去碎片后的上清液；
[0222] (7)将步骤(6)获得的上清液置于冰上，用60ml注射器连接0.45皿针头滤器将离屯、 后的上清液过滤于35ml超速离屯、管中，25000转，3小时；
[0223] (8)将离屯、管轻轻取出，置于冰上；
[0224] (9)在病毒专用超净台中，打开金属离屯、管，吸去部分离屯、后的病毒上清，用綴子 取出超速离屯、管，吸去大部分上清，剩余约4ml;
[0225] (10)用5ml移液管反复吹打剩余的4ml病毒上清约10次，0.75ml/管进行分装，放 入-80°C冰箱中保存备用，而获得慢病毒颗粒，即感染混合物。
[0226] (五）、转染外周血单核细胞
[0227] 1、人外周血单核细胞的分离与激活 [022引与步骤(一)相同。
[0229] 2、人外周血单核细胞的转染
[0230] (1)人外周血单核细胞在24孔板中激活12~24小时后，离屯、24孔板，吸走80化1上 清培养液，加入新的培养液，调整每孔细胞数目约0.5 X 10^20化1;
[0231] (2)从人外周血单核细胞分选出T细胞并激活，取（7~9) X105激活的T细胞，用 CD45R0，CD6化抗体染色，流式细胞仪检测转染前激活的人外周血单核细胞的分型（方法同 上)；
[0232] (3)在室溫下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将1ml的慢病毒颗粒加入T细胞 中，向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培养基调整至终浓度为12μg/ml，将24孔板放入离 屯、机离屯、，25(K)r/min，离屯、1.5小时;离屯、后将24孔板放于37°C、5%C02培养箱中培养过夜；
[0233] (4)离屯、过夜培养的24孔板，去掉大部分含慢病毒颗粒的上清培养液，加入新鲜的 RPMI-1640培养液，扩增T细胞；
[0234] (5)每2天计数T细胞，向RPMI-1640培养基中加入化-250IU/ml，维持T细胞密度为 (0.5~l)Xl〇6/ml;
[0235] (6) 2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45R0，CD6化抗体W及FITC标记的羊抗 鼠 F(ab'）2抗体，进行流式细胞仪分析(方法同上）；
[0236] (7)转染成功的 cM21-28-IC0SCCAR-T 细胞备用。
[0237] (六）、表达抗肥R2的CAR-T细胞体外功能的检测
[0238] 在检测前，先将实施例1制备的CAR-T细胞与表达肥R2的肿瘤细胞株(实施例1所设 及的材料中的细胞系)按如下步骤进行共培养，而获得共培养液：
[0239] (1)用0.25%膜酶消化肿瘤细胞后，加入RPMI1640培养基中和膜酶，离屯、后调整细 胞密度为IxloVml，取10化1 (IxlO5)肿瘤细胞接种于U型96孔板中，设置3个复孔；
[0240] (2)表达抗皿R2的chA21-28-IC0SCCAR-T细胞体外培养扩增14天后，离屯、去掉抗 CD3/CD28磁珠，在无 IL-2的RPMI1640培养液中培养过夜，使T淋己细胞静息；
[0241] (3)收取静息的T淋己细胞，离屯、去掉上清，将细胞重悬于RPMI1640培养液中，计 数，调整细胞密度为IxloVml，取1(K)山（IxlO5)T细胞接种于U型96孔板中已经接种肿瘤细胞 的相应的孔中，将96孔板放置于37°C、5%C02培养箱中培养过夜。只有T细胞的孔作为阴性 对照孔。
[0242] 1、ELISA法检测共培养液中IFN- 丫的含量
[0243] (1)包被:按说明书指导，将化Pture抗体稀释于IX包被缓冲液中，向试剂盒提供的 微孔板中的各反应孔中各加0.1ml，塑料贴纸覆盖微孔板，放置4°C过夜；
[0244] (2)封闭：将过夜后的微孔板用自动化ISA洗板机洗漆4次后，抛干，用IX分析缓冲 液10化1封闭1小时；
[0245] (3)加样:将微孔板再次洗漆4次后，抛干，向各反应孔加入待检测的T细胞与肿瘤 细胞共培养的上清液10化1，相应稀释倍数的上清液及IFN- 丫标准品（100化g/ml，倍比稀释 至15.6pg/ml)，室溫解育2小时；
[0246] (4)加检测抗体:微孔板洗涂4次后，抛干，按说明书指定将Detection抗体用IX分 析缓冲液稀释，取10化1加入各反应孔中，室溫解育1小时；
[0247] (5)加辣根过氧化物酶标记的二抗:微孔板洗漆4次后，抛干，将HRP标记的抗体用 IX分析缓冲液稀释，向各反应孔中各加10化1，室溫解育0.5小时；
[0248] (6)微孔板洗漆4次后，抛干，向各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液10化1，避 光解育15分钟；
[0249] (7)向各反应孔中加入1M硫酸10化1终止反应；
[0250] (8)结果判定：在化ISA检测仪上，W空白对照孔调零，检测各孔450nm吸光值(0D 值），计算IFN-丫浓度值。检测结果如图2所示。
[0251] 根据图2可知，chA21-28-IC0SCCAR-T细胞可W特异性的识别所有皿R化的肿瘤细 胞并大量分泌IFN-丫，针对乳腺癌细胞（S邸R3)分泌的IFN-丫高达190(K)pg/mlW上，但将 chA21-28-IC0SCCAR-T细胞与皿R2阴性的MDA-MB-468和TC-1细胞共培养时，细胞培养液上 清中只能检测到非常低剂量的IFN-丫。而NT-T细胞与皿R2阳性的肿瘤细胞共培养时，细胞 培养液上清中检测不到IFN-丫。因此，结果表明：肥R2-特异性的T细胞可W特异性的识别并 杀伤肥R2阳性的肿瘤细胞。
[0252] 2、ELI SA法检测共培养液中比-2的含量
[0253] 检测步骤与IFN- 丫的步骤相同，检测结果如图3所示。
[0254] 根据图3可知，chA21-28-IC0SCCAR-T细胞可W特异性的识别所有皿R化的肿瘤细 胞并大量分泌化-2，针对乳腺癌细胞（SKBR3)分泌的化-2高达2800pg/ml W上。但将chA21- 28-ICOSCCAR-T细胞与皿R2阴性的MDA-MB-468和TC-1细胞共培养时，细胞培养液上清中只 能检测到非常低剂量的IL-2。而NT-T细胞与皿R2阳性的肿瘤细胞共培养时，细胞培养液上 清中检测不到IL-2。因此，结果表明：肥R2-特异性的T细胞可W特异性的识别并杀伤肥R2阳 性的肿瘤细胞。
[0255] 3、CAR-T细胞的抗原特异性评价试验
[0256] (1)包被：用20化1化g/ml皿R2-FC嵌合蛋白或者CD19-FC嵌合蛋白的包被96孔 板，用塑料贴纸覆盖96孔板，4°C过夜；
[0257] (2)加入活化的T细胞：次日，PBS洗涂3次后，抛干，向96孔板中加入IX 105个 cM21-28-IC0SCCAR-T细胞或N1T细胞，37°C培养过夜；
[0258] (3)酶联免疫法检测IFN-丫的分泌，检测结果如图4所示。
[0259] 根据图4可知，NT-T细胞对皿R2-FC嵌合蛋白和CD19-FC嵌合蛋白均无特殊反应， chA21-28-IC0SCCAR-T细胞对CD19-FC嵌合蛋白也无特殊反应，但是在皿R2-FC嵌合蛋白封 闭的96孔板中，CM21-28-IC0SCCAR-T细胞释放了大量的INF-丫，且高达19000pg/mlW上。
[0260] 4、si化释放试验检测CM21-28-IC0SCCAR-T细胞杀伤乳腺癌细胞能力
[0%1] (1)收获处于对数生长期的乳腺癌细胞(S邸R3)，调整细胞浓度为2X106/ml;
[0%2] (2)取lX106细胞(0.5ml)，加 Na25lCr04100 uCi，37度解育2~3h，每15min轻轻振摇 一次；
[0263] (3)用 10%FCS RPMI 1640洗涂3次，每次800巧m、5min。
[0264] (4)重悬细胞浓度lXl〇5/ml;
[0265] (5)96孔U型培养板中，每孔加 lOOiiKlxlO4细胞），设3个复孔；
[0%6] (6)按照效应T细胞与祀细胞为1:1，3:1和10:1的比例，每孔加入10化1不同细胞浓 度的实施例1制备的CAR-T细胞;设置最大释放组，向乳腺癌细胞加 lOOiil l%Triton X- 100;设置自然释放组，向乳腺癌细胞中加10化1 RPMI1640培养基；
[0%7] (7) 200g离屯、Imin，放入37 °C、5 % C〇2解箱培养地。
[0268] (8) 200g 离屯、Imin，每孔取出 10化上清，用 Wi zard2gamma 计数(Perki 址 Imer)检测；
[0269] (9)计算:特异性杀伤率（％) = (实验组cpm-自然释放cpm)/(最大释放组-自然释 放cpm)，计算结果图5所示。
[0270] 根据图5可知，chA21-28-IC0SCCAR-T细胞特异性的裂解肥R2-阳性的SKBR3肿瘤细 胞，而NTT细胞对于肥R2阳性或者阴性的S邸R3肿瘤细胞均未有裂解作用。同时，将NT-T细胞 和chA21-28-IC0SCCAR-T细胞分别与表达肥R2的SK0V3细胞共培养24小时后，可W看到NT-T 细胞对SK0V3细胞的生长没有影响，而加入CM21-28-IC0SCCAR-T细胞的培养皿中可W看到 T细胞集落的形成，且S邸R3肿瘤细胞明显减少。
[0271] 5、统计分析
[0272] 所有数据均为遂表示。利用Gra地Pad P;rism5.0(Gra地Pad Software，Inc.，San Diego，California USA)软件，T检验法分析细胞因子分泌的差异及特异性细胞裂解的差 异。P<0.05认为有统计学意义。
[0273] 综上所示，本发明CAR-T细胞对表达皿R2的肿瘤细胞具有良好的杀伤效果，且CAR- T细胞与乳腺癌细胞（SKBR3)共培养时分泌的INF-丫高达19000pg/mlW上，IL-2高达 2800pg/ml W上，远高于其他第S代CAR-T细胞分泌的INF- 丫和比-2。
[0274] W上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本 发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其 他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传 导区，其特征在于， 所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21 scFv; 所述胞内信号传导区为CD28-X-ITAM，其中，所述X为10)5、00137、00134、0)80或者0)86 共刺激分子。2. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述X为ICOS共刺激分子。3. -种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤如下： 构建CAR表达载体，其中，所述CAR表达载体的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞 内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21 scFv，所述胞内信号 传导区为CD28-X-ITAM，所述X为10)5、0)137、0)134、0)80或者0)86共刺激分子 ； 包装所述CAR表达载体，而制得感染混合物； 将所述感染混合物感染T细胞，而制得CAR-T细胞。4. 如权利要求3所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述构建CAR表达载体的过 程中，包括步骤如下： 获取所述chA21 scFv的基因片段、所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述 X的基因片段以及所述ITAM的基因片段； 提供引导链，基因融合所述引导链与所述chA21 scFv的基因片段，而形成引导链-chA21 scFv； 基因融合所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM 的基因片段，而形成铰链区-⑶28-X-ITAM; 基因融合所述引导链-chA21 scFv和所述铰链区-CD28-X-ITAM，而形成引导链-chA21 scFv-铰链区-CD28-X-ITAM; 将所述引导链_chA21 scFv-铰链区-⑶28-X-ITAM接入载体，而获得CAR表达载体。5. 如权利要求4所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，获取所述chA21 scFv的基 因片段、所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的 基因片段的过程中，包括步骤如下： 获取并激活PMBCs; 提取所述PMBCs的mRNA并反转录为cDNA; 分别提供所述铰链区的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物，且均 以所述PMBCs的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，而获得所述铰链区的基因片段、所述CD28的 基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段； 提供所述chA21 scFv的模板DNA和所述chA21 scFv的引物，并进行PCR扩增，而获得所 述chA21 scFv的基因片段。6. 如权利要求3所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR表达载体为CAR表 达病毒质粒。7. 如权利要求6所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述包装所述CAR表达载体 的过程中，包括步骤如下： 将12~20yg的包装质粒与12~20yg的所述CAR表达病毒质粒通过培养基共混，而获得 质粒混合物； 将所述质粒混合物与35~45μ1的脂质体通过培养基共混，而获得混合液； 将所述混合液转染真核细胞，而获得所述真核细胞的上清液； 浓缩所述上清液，而制得感染混合物。8. 如权利要求3所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述将所述感染混合物感 染Τ细胞的过程中，包括步骤如下： 将0.8~2ml的感染混合物加入(6~10) Χ105个Τ细胞中而进行感染； 将凝聚胺加入所述T细胞中，使所述凝聚胺的终浓度为10~20μg/ml; 培养扩增感染后的T细胞，而获得CAR-T细胞。9. 如权利要求3至8任意一项所述的CAR-Τ细胞的制备方法，其特征在于，所述X为ICOS 共刺激分子。10. -种如权利要求1或2所述的CAR-τ细胞在治疗乳腺癌的药物上的应用。
【文档编号】C12N15/867GK106047817SQ201610602458
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月28日 公开号201610602458.3, CN 106047817 A, CN 106047817A, CN 201610602458, CN-A-106047817, CN106047817 A, CN106047817A, CN201610602458, CN201610602458.3
【发明人】曾宪卓, 张翼
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司