Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法。本发明将Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3CD在杆状病毒表达系统中共表达，制备并鉴定了鸭肝炎病毒样颗粒，为鸭肝炎病毒新型疫苗的研制奠定了基础。IFA结果显示重组蛋白在昆虫细胞中成功表达；以P3代病毒(MOI＝5)感染悬浮生长的昆虫细胞，收集细胞裂解液上清，可见直径约20～25nm的球形病毒样颗粒，与DHV天然病毒高度相似；Western blotting分析病毒样颗粒的结构组成，以Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒鸭多抗血清作为一抗，可见特异性结构蛋白条带，与理论值相符。本发明操作程序简便，易进行大规模生产，具有广阔的应用前景。
【专利说明】
I型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及I型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备，属于生物制品领域，本发明设及I 型鸭甲型肝炎病毒，W及该病毒样颗粒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)属于小RNA病毒科禽肝炎病毒 属鸭甲型肝炎病毒种，临床上主要引起21日龄W下的维鸭发生急性肝炎，该病W传播迅速、 高致死性、引起维鸭出现肝炎及出血为主要特征，病死率高达100%，是一种急性高度致死 性传染病，是严重危害养鸭业的疫病之一。DHAV包括经典型（即我国原I型鸭肝炎病毒）、台 湾新型、韩国新型S种亚型，名称分别为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，3个型之间存在明显的差 异，无交叉抗原性，其中DHAV-1呈世界性分布，也是中国DHAV流行的主要血清型。
[0003] 鸭肝炎病毒粒子呈二十面体对称，直径为20~40nm，无囊膜，核屯、为单股正链的 RNA。由于在国外鸭病毒性肝炎的发病率较低，未引起足够的重视，因此关于运种病毒的研 究，特别是在分子生物学方面的研究起步较晚，直到2006年，该病毒的全基因组序列才被首 次报道。整个基因组为约7690个核巧酸组成的单股正链RNA(+ssRNA)，编码2249个氨基酸， 不含5'帽子结构，3'端有poly(A)尾己，只有一个较大的开放读码框(0RF)，即RNA5'末端只 含有一个翻译起始位点，病毒的RNA指导合成一条完整蛋白，称为多聚蛋白。多聚蛋白在翻 译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，分解成P1、P2和P3产物，P1、P2和P3又进一步分别 分解为小片段蛋白。P1区是结构蛋白前体，编码S个结构蛋白VP0、VP1和VP3，VP1为主要宿 主保护蛋白。P2和P3区编码非结构蛋白，P3区的蛋白水解酶3C和它的前体3CD在多聚蛋白的 水解中发挥主要作用。
[0004] 目前对鸭病毒性肝炎的预防主要W鸡胚化弱毒疫苗为主，但普遍存在安全性低、 免疫效果不够理想等缺点，加之异毒株的出现，其预防效果有逐渐下降趋势，因此迫切需要 开展DHV预防新策略研究。
[0005] 病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)是由某种病毒的一个或多个结构蛋白 自行装配而成的高度结构化的空屯、蛋白颗粒，相比单独的多肤或蛋白，VLPs具有与天然病 毒更为相近的构象表位，能更有效地刺激机体的细胞免疫和体液免疫，且化Ps无复制和感 染能力，是很有发展前景的新型疫苗。
[0006] VLPs是由一个或多个病毒的衣壳蛋白自行组装而成，但是并不是所有病毒都适合 进行VLPs的研制，因为不是所有病毒的衣壳蛋白都可W自行包装成病毒粒子。有些病毒结 构简单，只需要一个主要保护性结构蛋白就可自行组装成病毒样粒子，有些病毒结构复杂， 则需要多个结构蛋白甚至其他蛋白的参与和辅助。如流感病毒样颗粒的制备，有报道用血 凝素化A)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白（Ml)、基质蛋白（M2)中任何一种制备的化Ps，也有报 道HA-MlVLPs、HA-NA-M2VLPs，其免疫效果当然也不尽相同。
[0007] 鸭甲型肝炎病毒的基因组结构较为复杂，对其编码蛋白的功能还未完全清楚。目 前，国内外还没有关于鸭肝炎病毒样颗粒研制的相关报道。如何同时表达=个结构蛋白？= 个结构蛋白能否自行组装成VLPs?都不可预测，有待进一步研究。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种I型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，将I型鸭甲型肝 炎病毒的结构蛋白前体基因 P1和蛋白水解酶基因3CD在杆状病毒表达系统中共表达，在昆 虫细胞Sf9中制备并鉴定了 I型鸭肝炎病毒样颗粒，为I型鸭甲型肝炎病毒新型疫苗的研制 奠定了基础。本发明I型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备包括W下步骤：
[0009] (1))含I型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因 P1和蛋白水解酶基因3CD克隆到杆 状病毒转移载体P化stBacDual中，得到杆状病毒转移载体pF抓-P13CD;
[0010] (2)pF抓-P13CD重组质粒的转座；
[0011] (3)重组Bacmid DNA的获得与鉴定；
[0012] (4)重组杆状病毒巧ac-P13CD的制备及扩增；
[0013] (5)重组杆状病毒巧ac-P13CD共感染宿主细胞制备病毒样颗粒；
[0014] (6)病毒样颗粒的纯化。
[0015] 其中，步骤（1)中所述重组质粒载体的构建用到的载体为Invihogen公司Bac-to- Bac系统中的杆状病毒转移载体pI^stBacDual。
[0016] 步骤(1)中I型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因 P1的扩增引物为：
[0017] P1-F/R : 5^ -GTAGCGGCCGCACCATGGATACTCTTACTAAAAC- / 3/5 / - GTACTGCAGTTATTCAATTTCCAGATTGAGTTC-^。
[0018] I型鸭甲型肝炎病毒蛋白水解酶基因3CD的扩增引物为：
[0019] 3CD-F/R : / -GTACTCGAGACCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAG- / 3/V - GTAGCTAGCTCAGATCATCATGCAAGCTGTG-' 3。
[0020] 步骤(2)(3)(4)中所述质粒的重组、重组Bacmid DNA的获得与鉴定、重组杆状病毒 的制备及扩增均参照Invitrogen公司Bac-to-Bac说明书进行。
[0021] 步骤（5)具体可W是：重组杆状病毒rBac-P13CD的M0I为5,感染生长密度为2X 106cells/ml的悬浮培养的昆虫细胞Sf9,72h后收集细胞沉淀，反复冻融3-5次，离屯、收集上 清即为病毒样颗粒溶液。所述昆虫细胞Sf9为Invitrogen公司产品。
[0022] 步骤(6)中所述病毒样颗粒的纯化采用氯仿抽提和超速离屯、法。
[0023] 本发明首先扩增出I型鸭甲型肝炎病毒P1基因，克隆入杆状病毒转移载体 pFas巧acDual获得重组转移载体pF抓-P1;将扩增的3CD基因亚克隆入pF抓-P1，获得的重组 质粒命名为pF抓-P13CD;将pF抓-P13CD重组质粒转化DHlOBac感受态细胞，涂板培养，直至 蓝白斑出现;挑取蓝白斑中的白色单菌落，W碱裂法提取重组Bacmid DNA，进行PCR鉴定;将 重组Bacmid DNA转染生长昆虫细胞Sf9,待细胞出现明显病变时收集上清，即为重组杆状病 毒；IFA结果显示重组蛋白在昆虫细胞中成功表达；WP3代病毒(M0I = 5)感染悬浮生长的昆 虫细胞，收集细胞裂解液上清，经滤膜过滤、氯仿抽提、超速离屯、纯化后，憐鹤酸负染电镜观 察，可见直径约20~25nm的球形病毒样颗粒，与DHV天然病毒高度相似;Western blotting 分析病毒样颗粒的结构组成，WI型鸭甲型肝炎病毒鸭多抗血清作为一抗，可见特异性结构 蛋白条带，与理论值相符。本发明操作程序简便，易进行大规模生产，昆虫细胞Sf9是一种悬 浮培养细胞，培养要求较低，非常适合生产实践中大规模生产，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图 1 重组Bacmid PCR鉴定
[0025] M:化b DNA Ladder;
[0026] 1:重组Bacmid DNAWM13-F/P1-R为引物对的PCR产物；
[0027] 2:重组Bacmid DNAWM13-F/R为引物对的PCR产物；
[002引 3:重组Bacmid DNAWM13-R/P1-F为引物对的PCR产物。
[00巧]图2重组蛋白的IFA检测
[0030] A: WVP0多抗为一抗;B: WVP1多抗为一抗;C: WVP3多抗为一抗；
[0031] D: W3C多抗为一抗;E: W3D多抗为一抗;F:空白对照。
[0032] 图31型鸭甲型肝炎病毒样颗粒投射电镜图（97000X)。
[0033] 图41型鸭甲型肝炎病毒样颗粒Western blot分析图
[0034] 1:正常Sf 9细胞裂解液;2:1型鸭甲型肝炎病毒样颗粒纯化产物。
【具体实施方式】
[0(X3日]实施例1转移载体pF抓-P13CD的构建与鉴定
[0036] 根据已发表的I型鸭甲型肝炎病毒-SH株全基因的序列（GeneBank登录号： 册232302)，设计两对引物P1-F/R和3CD-F/R，
[0037] P1-F:5'-GTAGCGGCCGCACCATGGATACTCTTACTAAAAC-'3(SEQ ID No.l)
[0038] P1-R:5'-GTACTGCAGTTATTCAATTTCCAGATTGAGTTC-'3(SEQ ID No.2)
[0039] 3CD-F:5^GTACTCGAGACCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAG-^(沈Q ID No.3)
[0040] 3CD-R:5'-GTAGCTAGCTCAGATCATCATGCAAGCTGTG-'3(SEQ ID No.4)，W提取的I型 鸭甲型肝炎病毒-SH株RNA为模板，分别扩增出结构蛋白前体基因 PI和蛋白水解酶基因3CD。 扩增出的P1产物经Not I和Pst I双酶切后插入经同样酶切的杆状病毒转移载体 P化stBacDual，获得重组质粒pF抓-P1，将3CD扩增产物经趾0巧日Nhe I酶切后插入pF抓- P1，获得的重组质粒命名为pF抓-P13CD。
[0041 ] 实施例化F抓-P13CD重组质粒的转座
[0042] 将pF抓-P13CD重组质粒转化DHlOBac感受态细胞，涂板培养，直至蓝白斑出现。
[0043] 实施例3重组Bacmid DNA的获得与鉴定
[0044] 挑取白色单菌落，W碱裂法提取重组Bacmid DNA，并对其进行PCR鉴定。如图1所 示，分别 WM13-F/P1-R、M13-F/R、M13-R/P1-F(M13-F/R 是公知序列，在 Invitrogen 公司 Bac- to-Bac说明书)为S对引物进行PCR，结果分别出现特异性条带，与理论值相符，说明目的基 因同源重组成功，获得的重组杆粒正确。
[0045] 实施例4重组杆状病毒巧ac-P13CD的制备及扩增
[0046] 将重组Bacmid DNA转染生长良好的昆虫细胞Sf9,待细胞出现明显病变时收集上 清，即为P1代重组杆状病毒。WP1代病毒进行扩增得到P2代，P2代扩增得到P3代病毒。空斑 实验测得P3代重组杆状病毒的滴度为1.0 X 108p化/ml。
[0047] 实施例5重组蛋白在昆虫细胞Sf9中的表达及鉴定
[004引将P3代重组病毒感染6孔板上的Sf9细胞，感染后4她，用细胞免疫巧光试验鉴定其 表达情况，W制备的VPO多抗、VPl多抗、VP3多抗、3C多抗、3D多抗为一抗，结果如图2所示，均 出现了特异性巧光，而未感染重组病毒的Sf9细胞对照组没有出现巧光，说明结构蛋白前体 P1和蛋白水解酶前体3CD获得了成功表达，且P1在3CD的作用下成功水解为VP0、VP1、VP3。
[0049] 实施例6病毒样颗粒的大量制备
[0050] 将昆虫细胞Sf9W不低于5X105cells/ml的密度接种于摇瓶中，27°C11化pm振荡 培养至密度约2X106cells/ml。将重组杆状病毒巧ac-P13CDW感染复数5感染摇瓶中培养 好的昆虫细胞Sf 9，27 °C 11化pm继续振荡培养72h，离屯、收集细胞沉淀，用适量PBS溶解细胞 沉淀，于-80°C和37 °C反复冻融3-5次，100(K)rpm离屯、5min收集上清，即为初始病毒样颗粒溶 液。
[0051] 实施例7病毒样颗粒的纯化
[0052] 初始病毒样颗粒溶液先用0.22um的滤膜过滤，再加入1/2体积的氯仿在摇床上室 溫剧烈振摇化，12000g离屯、10分钟，取上层水相aOOOOOg离屯、2小时，PBS溶解沉淀，即为纯 化的病毒样颗粒。
[0053] 实施例8病毒样颗粒的鉴定
[0054] 纯化的病毒样颗粒负染后进行透射电镜观察，结果如图3所示，可见大小约为25nm 左右的空屯、病毒粒子，与DHV病毒粒子大小和形态相似，说明S个结构蛋白可自行组装成病 毒样颗粒。
[0055] 为鉴定病毒样颗粒的结构组成，将纯化的样品进行Western blot分析，WI型鸭甲 型肝炎病毒鸭多抗血清作为一抗，结果如图4所示，可见大小约27kDa左右的条带，与VP1蛋 白大小相似。其原因有二，一是VP1是鸭甲型肝炎病毒的主要结构蛋白，鸭多抗中的成分主 要是抗VP1蛋白的，二是VP1和VP3大小基本相同，仅一个氨基酸的差距，电泳是无法分辨的， 所^Western blot分析中仅出现了一条印迹条带。
[0056] W上结果可W得出，我们成功构建了制备I型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的杆状病毒/ 昆虫细胞系统，通过在昆虫细胞内同时表达I型鸭甲型肝炎病毒的结构蛋白前体P1和蛋白 水解酶前体3CD，可成功组装出病毒样颗粒，该病毒样颗粒大小形态与野生病毒相似，且能 与病毒阳性血清发生反应，可W用于I型鸭甲型肝炎病毒病新型疫苗的进一步开发应用。
【主权项】
1. 一种I型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，特征在于包括以下步骤：（1)将I型鸭甲 型肝炎病毒结构蛋白前体基因 P1和蛋白水解酶基因3CD克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacDual中，得到杆状病毒转移载体pFK)-P13CD; (2)pFBD-P13CD重组质粒的转座；（3) 重组Bacmid DNA的获得与鉴定；（4)重组杆状病毒rBac-Pl3CD的制备及扩增；（5)重组杆状 病毒rBac-P13CD感染宿主细胞制备病毒样颗粒;（6)病毒样颗粒的纯化。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中I型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前 体基因 P1 的扩增引物为：P1-F/R: 5' -GTAGCGGCCGCACCATGGATACTCTTACTAAAAC」3/V -GTACTGCAGTTATTCAATTTCCAGATTGAGTTC-7 3。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，I型鸭甲型肝炎病毒蛋白水解酶基因3CD的 扩增引物为：3CD-F/R:5 7 -GTACTCGAGACCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAG-7 3/V -GTAGCTAGCTCAGATCATCATGCAAGCTGTG-7 3 〇4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)具体是:重组杆状病毒rBac-P13CD 的MOI为5,感染生长密度为2X106cellS/ml的悬浮培养的昆虫细胞Sf9,72h后收集细胞沉 淀，反复冻融3-5次，离心收集上清即为病毒样颗粒溶液。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)具体是:0.22μπι滤膜过滤除去杂蛋 白；1/2体积的氯仿抽提，取上层水相；lOOOOOg离心2小时，PBS溶解沉淀，即为纯化的病毒样 颗粒。
【文档编号】C12N15/866GK106047824SQ201610519642
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】王安平, 朱善元, 王永娟, 左伟勇, 吴双, 郭长明, 秦枫, 洪伟鸣
【申请人】王安平, 朱善元