一种乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法
【专利摘要】本发明公开一种乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法：将乙二胺四乙酸二酸酐和草酸脱羧酶溶入磷酸盐缓冲液中，搅拌反应1h?24h；反应结束后，将反应产物进行透析，然后进行浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶。本发明直接采用乙二胺四乙酸二酸酐对草酸脱羧酶进行化学修饰，条件温和、操作简单、成本较低；修饰后的草酸脱羧酶的热稳定性、耐热性、pH适应性、对胰蛋白酶的耐受性都有所增强；特别是提高了草酸脱羧酶在草酸钙晶体上的吸附能力；解决了草酸脱羧酶在应用中存在受胃酸、胃蛋白酶影响，而容易失去活性的问题；还解决了在实际应用中酶制剂中酶蛋白面临易被稀释流失的现实问题。
【专利说明】
-种乙二胺四乙酸二酸野修饰草酸脱錢酶的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工领域，特别是提供了一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇 酶的方法及所获得的修饰草酸脱簇酶和应用。
【背景技术】
[0002] 草酸脱簇酶(Oxalate decarbo巧lase,0xdc,EC 4.1.1.2)催化裂解草酸的C-C键， 可W在没有辅因子的条件下催化草酸转化为甲酸和C02,是植物、微生物中草酸代谢降解的 主要催化酶。基于对底物的高度特异性W及酶促反应的高效性等特点，该酶已广泛的应用 于农业、食品、工业生产、医疗等领域中草酸盐的降解。针对草酸巧结石症方面，目前已有一 些使用草酸脱簇酶进行预防治疗的研究报道。Grujic等使用基因敲除小鼠为模型，通过口 服交联草酸脱簇酶晶体（OxDc-化EC)，发现小鼠体内尿草酸及粪草酸分别降低了 44%和 72%Jeong等模拟高草酸尿症模型，通过给小鼠口服来源于枯草芽抱杆菌(B.subtilis)的 重组草酸脱簇酶，有效的减少了尿液中草酸的水平。CowleyW大鼠及狗为实验动物，口服酶 制剂化azyme(0C4)连续饲喂14天，评价了运类用于降解动物消化道中草酸的酶制剂的可能 毒性，试验表明对鼠使用剂量为720.8mg/kg/d，对狗使用剂量为187.2mg/kg/d均无可见有 害作用水平。
[0003] 研究表明，采用草酸脱簇酶酶制剂降解消化道内的草酸盐W预防治疗草酸巧结石 症的方法是可行的。但是酶作为一种蛋白质，应用于消化道内时，存在受胃酸、蛋白酶等环 境因素作用，容易被消化而失去其活性。此外，草酸脱簇酶制剂在实际应用中，由于尿液处 于不断流动的状态，通过合理给药到达泌尿系统中的酶制剂面临酶蛋白易被稀释流失的现 实问题。运用无载体固定化方法制备交联草酸脱簇酶聚集体，对其酶学性质研究表明交联 聚集体的耐酸性、耐热性、耐膜蛋白酶降解能力较游离酶均有提高(梁跃等.交联草酸脱簇 酶聚集体的制备及其性质.食品科学，2013,34(01): 215-219.)。
[0004] 酶化学修饰是改进酶性能的有效方法。韦成畳等采用右旋糖酢、单甲氧基聚乙二 醇修饰草酸脱簇酶，结果表明，修饰后草酸脱簇酶的热稳定性、耐热性、pH适应性、抗膜蛋白 水解性都有所增强，提高了酶的应用性能。但是运些研究并未解决草酸脱簇酶制剂应用于 预防治疗草酸巧结石症时，存在酶蛋白易被稀释流失的现实问题。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法及所获得的改性 草酸脱簇酶和应用。草酸脱簇酶经修饰后，其热稳定性、耐热性、pH适应性、对膜蛋白酶的耐 受性及在草酸巧晶体上的吸附能力都有所增强。可用于制备预防治疗草酸巧结石病的酶制 剂。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] -种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢 (ethyl enedi aminetetraaceti C di anhydride，EDTAD)和草酸脱簇酶（Oxalate deca;rboxylase，Oxdc，EC 4.1.1.2)溶入憐酸盐缓冲液中，揽拌反应lh-24h;反应结束后，将 反应产物进行透析，然后进行浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶化DTAD- Oxdc)。
[000引 W上所述的草酸脱簇酶采用"林日辉，许丽莉，农勉，等.重组草酸脱簇酶的表达及 酶学性质研究[J].食品与发酵工业，2011，37(2):57-61"公开的方法制备而得。
[0009] 进一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，所述的乙二 胺四乙酸二酸酢和草酸脱簇酶按摩尔比0.5:1-100:1。
[0010] 进一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，所述的憐酸 盐缓冲液的浓度为20-500mmol/L，pH 3.0-9.0。
[0011] 进一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，所述的透析 选用截留分子量8000-14000的透析袋。
[0012] 进一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，所述的浓缩 选用超滤管，在2000-5000巧m、2-10 °C、10-50min条件下进行离屯、浓缩。
[0013] 进一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，所述的浓缩 选用透析袋进行浓缩，其条件为在2-l(TC条件下，将透析袋放置体积浓度为20-50%的聚乙 二醇20000溶液中进行浓缩2-4h。
[0014] W上方法所制备得到的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶，草酸脱簇酶和乙二 胺四乙酸二酸酢已共价结合，乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的位点位于草酸脱簇酶 侧链的自由氨基上或者肤链的N末端的a-氨基上。
[0015] W上所述乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的应用，所述的乙二胺四乙酸二酸 酢修饰草酸脱簇酶在草酸巧晶体吸附上的应用。乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶在草 酸巧晶体吸附上的应用是利用和发挥乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶催化草酸盐降 解活性。
[0016] 本发明的优点：
[0017] 1.本发明直接采用乙二胺四乙酸二酸酢对草酸脱簇酶进行化学修饰，条件溫和、 操作简单、成本较低。
[0018] 2.经乙二胺四乙酸二酸酢修饰后，草酸脱簇酶的热稳定性、耐热性、pH适应性、对 膜蛋白酶的耐受性都有所增强;特别是提高了草酸脱簇酶在草酸巧晶体上的吸附能力。
[0019] 3.本发明解决了草酸脱簇酶在应用中存在受胃酸、胃蛋白酶影响，而容易失去活 性的问题。
[0020] 4.本发明还解决了在实际应用中酶制剂中酶蛋白面临易被稀释流失的现实问题。
【附图说明】
[0021] 图1为草酸脱簇酶(Oxdc)与乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶化DTAD-Oxdc)在 不同pH值条件下的酶活力对比图，即pH适应性对比图。
[0022] 图2为草酸脱簇酶(Oxdc)与乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶化DTAD-Oxdc)在 不同溫度条件下分别热处理30min的酶活力对比图，即耐热性对比图。
[0023] 图3为草酸脱簇酶(Oxdc)与乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶化DTAD-Oxdc)的 热稳定性对比图。
[0024] 图4为草酸脱簇酶(Oxdc)与乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶化DTAD-Oxdc)对 膜蛋白酶的耐受性对比图。
【具体实施方式】
[0025] 为了更好的理解本发明，下面结合实施例子对本发明做进一步的描述。应理解，运 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲 授的内容之后，本领域的技术人员对本发明做各种改动或修改，运些等价形式同样落于本 申请所附权利要求所限定的范围。
[0026] 草酸脱簇酶的制备:采用"林日辉，许丽莉，农勉，等.重组草酸脱簇酶的表达及酶 学性质研究[J].食品与发酵工业，2011，37(2):57-61"公开的方法制备而得。具体为:培养 发酵产草酸脱簇酶基因工程菌E. coli化21 (DE3)/祀T32a/YvrK，添加异丙基-0-D-硫代化 喃半乳糖巧（IPTG)至终浓度0.4mmol/L，MnCl2至6mmol/L，诱导表达草酸脱簇酶，离屯、收集 菌体，W50mmol/L pH 8.0的憐酸盐缓冲液重悬菌体，超声破碎，离屯、收集上清即为粗酶液， 用AKTAprim帥lus快速低压液相色谱系统对粗酶液进行纯化，所得纯化酶液转入预先处理 好的透析袋(截留分子量8000-14000)中，于50mmol/L pH 8.0的憐酸盐缓冲液中4°C下透析 过夜，然后用超滤浓缩管浓缩至一定浓度，所得酶液为草酸脱簇酶液。
[0027] 修饰率的测定:采用2,4,6-立硝基苯横酸(TNBS)法测定，根据TNBS与蛋白质分子 上的游离氨基发生显色反应，生成S硝基苯衍生物，在420皿处有特征光吸收。取ImL待测蛋 白溶液（0-lmg/mL)，加入ImL 4%化HC〇3(pH 8.5)，lmL 10%SDS,静置20min后添加 ImL 0.1 %TNBS并将混合溶液置于40°C水浴化。反应完成后加0.5ml Imol/L的HCl终止反应，在 420nm波长下测定其吸收值。修饰前原酶在420nm的光吸收值记为Ao,修饰酶的光吸收值记 为Ai，按下式计算修饰率:MR=[l-(AlXCo)/(AoXCl)]X100%。其中Co、Cl分别为修饰前原 酶的浓度及修饰后经透析浓缩所得酶的浓度。
[002引草酸脱簇酶的酶活力检测:反应液含67mmol/L草酸钟，50mmol/L pH 4.0巧樣酸盐 缓冲液，37 °C水浴2min，加入草酸脱簇酶液开始反应，lOmin后加入等体积的0.2mol/L憐酸 氨二钟使体系pH上升至中性终止反应。终止反应液体系加入辅酶甲酸脱氨酶W及NAD+，紫 外分光光度法测定340nm的吸收值，分析甲酸的生成量。酶活力单位定义为:每分钟催化转 化草酸产生Iwnol甲酸的酶量。修饰草酸脱簇酶的酶活力检测同上。蛋白浓度采用考马斯亮 蓝法测定。
[0029] 一、乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的制备
[0030] 实例 1
[0031] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比0.5:1溶入抑3.0、浓度为20mmol/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应化;反应 结束后，将反应产物选用截留分子量8000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在2000rpm、2 °C、10min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0032] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在2°C条件下，将透析袋放置20% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中进行浓缩化。
[0033] 实施例2
[0034] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比20:1溶入抑4.0、浓度为lOOmmo 1/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应化;反应 结束后，将反应产物选用截留分子量9000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在3000rpm、4 °C、20min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0035] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在4°C条件下，将透析袋放置25% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中进行浓缩2.化。
[0036] 实施例3
[0037] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比40:1溶入抑6.0、浓度为200mmol/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应化;反应结 束后，将反应产物选用截留分子量10000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在4000rpm、6 °C、30min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0038] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在fTC条件下，将透析袋放置30% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中进行浓缩化。
[0039] 实施例4
[0040] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比60:1溶入抑8.0、浓度为300mmol/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应13h;反应 结束后，将反应产物选用截留分子量11000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在5000rpm、 8°C、40min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0041] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在6°C条件下，将透析袋放置35% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中进行浓缩3.化。
[0042] 实施例5
[0043] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比80:1溶入抑9.0、浓度为400mmol/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应17h;反应 结束后，将反应产物选用截留分子量12000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在3500rpm、 10°C、50min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0044] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在rC条件下，将透析袋放置40% (w/v)的聚乙二醇(PEG) 20000溶液中进行浓缩4h。
[0045] 实施例6
[0046] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比80:1溶入抑5.0、浓度为500mmol/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应2化;反应 结束后，将反应产物选用截留分子量13000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在2500rpm、 5°C、15min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0047] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在9°C条件下，将透析袋放置45% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中进行浓缩化。
[004引实施例7
[0049] 一种乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方法，将乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脱簇酶按摩尔比50:1溶入抑7.0、浓度为80mmol/L的憐酸盐缓冲液中，揽拌反应24h;反应 结束后，将反应产物选用截留分子量14000的透析袋进行透析，然后选用超滤管在3500rpm、 7°C、25min条件下进行离屯、浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶。
[0050] 上述的浓缩步骤也可采取使用透析袋进行浓缩，在l〇°C条件下，将透析袋放置 50%(w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中进行浓缩化。
[0051] 二、乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶结构的分析
[0052] 通过对实施例1-7所制备得到的乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶，采用超高 效液相色谱一质谱联用技术分析，结果表明：草酸脱簇酶和乙二胺四乙酸二酸酢已共价结 合，乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的位点位于草酸脱簇酶侧链的自由氨基上或者肤 链的N末端的a-氨基上。
[0053] 具体分析实验为:实施例8
[0054] 实施例8
[0055] 超高效液相色谱一质谱联用技术分析乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的方 法:在50mmol/L pH 8.5的化is-HCl缓冲液中，按50: l(w/w)的比例添加乙二胺四乙酸二酸 酢修饰草酸脱簇酶液与膜蛋白酶液(经甲苯横酷苯丙氨酷氯甲酬处理的），混匀后，37°C水 浴保溫酶解12h，取出，100°C水浴加热15min终止反应，在4°C，12000巧m下离屯、5min，收集上 清液，然后用0.45WI1的针头过滤器去除上清液中的不溶物，采用超高效液相色谱一四极杆 飞行时间质谱联用仪对其进行分析，得到的总离子流图经waters公司的BiopharmaLynx软 件分析对比，得出被乙二胺四乙酸二酸酢修饰的草酸脱簇酶肤段如下表。
[0056] 表1 UPLC-MS分析结果 [0化7]
[005引上述实验结果表明：草酸脱簇酶和乙二胺四乙酸二酸酢已共价结合，乙二胺四乙 酸二酸酢修饰草酸脱簇酶的位点位于草酸脱簇酶侧链的自由氨基上或者肤链的N末端的a- 氨基上。
[0059] =、修饰前后草酸脱簇酶的酶学性质比较
[0060] 1、酶最适反应抑值的测定:在50mmol/L pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 的不同巧樣酸盐缓冲体系中分别测定相同蛋白浓度的原酶和修饰酶的酶活力。结果如图1。 原酶的最适pH值为3.5,而修饰的最适抑值为5.0;说明经乙二胺四乙酸二酸酢修饰的草酸 脱簇酶的pH适应范围有所增加。
[0061] 2、溫度对酶活力的影响：在各自最适反应pH值下，分别测定相同蛋白浓度的原酶 和修饰酶在45、50、55、60、65、70、75 °C条件下热处理30min的残余酶活力；分别将相同蛋白 浓度的原酶和修饰酶在65°C条件下水浴处理，不同时间测定残余酶活力。原酶和修饰酶的 耐热性结果如图2。原酶和修饰酶都在45 °C时酶活力达到最高;但在45-75 °C范围内修饰酶 的酶活均高于原酶的，表现出较好的耐高溫能力。原酶和修饰酶的热稳定性结果如图3。65 °(：水浴处理3.化时，原酶的相对酶活为24.80%，而修饰酶的相对酶活较原酶高约9.36% ; 说明经乙二胺四乙酸二酸酢修饰的草酸脱簇酶的热稳定性增加。
[0062] 3、对膜蛋白酶的耐受性
[0063] 分别取2.25mL相同蛋白浓度的原酶和修饰酶，加入2.5mg/mL的膜蛋白酶溶液 0.25mL，37°C水浴，不同时间分别在各自最适反应抑值下测定残余酶活力。结果如图4。经膜 蛋白酶处理24h后，修饰酶较原酶保留了高约5 %的相对酶活;说明修饰酶具有较好的耐膜 蛋白酶水解的能力。
[0064] W上结果说明：经乙二胺四乙酸二酸酢修饰的草酸脱簇酶的pH适应性、耐热性、热 稳定性、对膜蛋白耐受性都有所增强。
[0065] 四、乙二胺四乙酸二酸酢修饰草酸脱簇酶在草酸巧晶体吸附上的应用
[0066] 实施9修饰前后草酸脱簇酶在草酸巧晶体上的吸附比较
[0067] 准确称取l.Og-水草酸巧晶体于50mL的具塞磨口锥形瓶中，分别加入一定体积的 pH 7.0的一水草酸巧饱和溶液，再分别加入已灭活的原酶液和修饰酶液至终浓度均为2mg/ mL，使吸附体系总体积为20mL后在37.0±0.5°C下恒溫振荡进行吸附反应，于不同时间取 出，离屯、分离，测定上清液中的蛋白浓度，计算吸附量。结果如下表所示。
[0068] 表2化dc和邸TAD-Oxdc在COM晶体上的吸附
[0069]
[0070] 可知，原酶和修饰酶在一水草酸巧晶体上的吸附量随时间变化的趋势相同，但修 饰酶的吸附量明显高于原酶的。吸附进行地，原酶在一水草酸巧晶体上的吸附量为7.26mg/ m2,而经乙二胺四乙酸二酸酢修饰后的草酸脱簇酶比未修饰的吸附量增加了约42.42%。提 高了草酸脱簇酶制剂在实际应用中针对酶蛋白易被稀释流失问题的应用性能，可用于制备 预防治疗草酸巧结石病的酶制剂。
【主权项】
1. 一种乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法，其特征在于：将乙二胺四乙酸二 酸酐和草酸脱羧酶溶入磷酸盐缓冲液中，搅拌反应lh-24h;反应结束后，将反应产物进行透 析，然后进行浓缩，获得乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶。2. 根据权利要求1所述的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法，其特征在于:所 述的乙二胺四乙酸二酸酐和草酸脱羧酶按摩尔比0.5:1-100:1。3. 根据权利要求1或2所述的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法，其特征在 于:所述的磷酸盐缓冲液的浓度为20-500mmol/L，pH 3.0-9.0。4. 根据权利要求1或2所述的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法，其特征在 于:所述的透析选用截留分子量8000-14000的透析袋。5. 根据权利要求4所述的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法，其特征在于:所 述的浓缩选用超滤管，在2000-5000rpm、2-10°C、10-50min条件下进行离心浓缩。6. 根据权利要求4所述的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的方法，其特征在于:所 述的浓缩选用透析袋进行浓缩，其条件为在2-10°C条件下，将透析袋放置体积浓度为20-50 %的聚乙二醇20000溶液中进行浓缩2-4h。7. -种如权利要求1-6所制备得到的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶，其特征在 于:草酸脱羧酶和乙二胺四乙酸二酸酐已共价结合，乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶 的位点位于草酸脱羧酶侧链的自由氨基上或者肽链的N末端的α-氨基上。8. -种如权利要求7所述乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶的应用，其特征在于:所 述的乙二胺四乙酸二酸酐修饰草酸脱羧酶在草酸钙晶体吸附上的应用。
【文档编号】C12N9/88GK106047847SQ201610377427
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】林日辉, 贺俊斌, 黄文勤
【申请人】南宁奕德环境科技有限公司