一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用
【专利摘要】本发明公开了一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用。该sgRNA选自DNA序列如下的FTOsgRNAsp2或FTOsgRNAsp3。该sgRNA对FTO基因的切割效率高。将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染SV?HUC?1，得到的细胞株FTO蛋白表达水平显著降低。因此，本发明提供的sgRNA能有效靶向敲除FTO基因，将其构建入CRISPR/Cas9慢病毒系统，该系统能敲除FTO基因，得到敲除FTO基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中的FTO的作用机制。
【专利说明】
-种卽向敲除FTO基因的巧RNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与 应用
技术领域
[0001 ]本发明设及生物技术领域，特别设及一种祀向敲除FT0基因的sgRNA及CRISPR/ 化s9慢病毒系统与应用。
【背景技术】
[0002] FT0基因是一种与肥胖相关的等位基因，也称肥胖基因。FT0基因位于第16号染色 体（16ql2.2)，含有9个外显子，基因长度为410.50化，广泛表达于人体组织的各发育阶段， 且在下丘脑、骨骼肌及脂肪等组织中高表达。FT0基因参与细胞的能量代谢。由于肿瘤是细 胞过度增殖造成的，其能量代谢异于正常细胞，因此，有必要研究FT0在不同细胞中的作用 机制。
[0003] 膀脫癌是我国泌尿外科最常见的尿路上皮肿瘤，绝大多数源于上皮组织，其中移 行上皮细胞癌占90% W上。目前，研究人员在膀脫癌的发生机制上做了大量研究，发现了众 多参与膀脫癌进展的途径和机制，如原癌基因激活、抑癌基因失活（点突变、重排、缺失)及 染色体异常等。但目前膀脫癌发生与进展中所设及的分子机制仍有许多尚未明确。
[0004] CRISPR/Cas9是近几年发现的由RNA向导的化s9核酸酶祀向目的基因进行编辑的 新兴技术。CRISPR/tas9是最先在古细菌中发现的，是研究者发现古细菌对外来生物信息不 断攻击而演化来的一种获得性防御机制。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过DNA碱基配对原理与1:racrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，指导 化s9蛋白在crRNA向导的DNA序列祀定目的位点切断双链DM。CRI SPR/tas9技术的的优点是 操作简便，工作效率高。
[0005] 目前，CRISPR/tas9基因敲除技术已经广泛使用于果蛹、大鼠、小鼠、斑马鱼等实验 模型。但是，在研究膀脫癌的相关基因仍然均使用RNA干扰技术，其主要缺点是在RNA水平的 干扰，只能敲低，不能彻底敲除，效率低下，不适用于长期抑制研究。在研究膀脫癌发生与进 展中所设及的分子机制中仍有很大缺陷。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种祀向敲除FT0基因 的S曲NA。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述一种祀向敲除FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒系 统的应用。
[000引本发明的再一目的在于提供祀向敲除FT0基因的人膀脫上皮SV-册C-1细胞的应 用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种祀向敲除FT0基因的SgRNA,选自DNA序 列如下的FT0sgRNAsp2 或 FT0sgRNAsp3:
[0010] FT0sgRNAsp2 的序列如下：
[0011] 尸1'03曲臟3口2〇11邑〇1:5'-。日。。邑〇：4416466416〔646414(：-3'；
[0012] FT0sgRNAsp2oligo2:5'-aaacGTATCTCGCATCCTCATTGGc-3'；
[0013] FT0sgRNAsp3 的序列如下：
[0014] FT0sgRNAsp3oligol:5'-caccgCCGGTATCTCGCATCCTCAT-3'；
[0015] FT0sgRNAsp3oligo2:5'-aaacATGAGGATGCGAGATACCGGc-3'。
[0016] 一种祀向敲除FTO基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，含有上述祀向敲除FTO基因的 sgRNA的DNA序列。
[0017] 所述的祀向敲除FT0基因的CRISPR/tas9慢病毒系统的构建，包括如下步骤：
[0018] (1)使用化si酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2,得到酶切后的CRISPR/ 化s9慢病毒载体；
[0019] (2)将上述祀向敲除FT0基因的SgRNA的DNA序列憐酸化后与酶切后的CRISPR/化s9 慢病毒载体连接，得到祀向敲除FTO基因的CRISPR/tas9慢病毒系统。
[0020] 步骤(2)中所述祀向敲除FT0基因的SgRNA的DNA序列优选为FT0sgRNAsp2。
[0021] 步骤(2)中所述的DNA序列是将寡核巧酸链l(oligol)和寡核巧酸链2(oligo2)退 火得到双链序列。
[0022] 所述的祀向敲除FT0基因的CRISPR/化s9慢病毒系统在制备敲除FT0基因的细胞株 中的应用。
[0023] 一种敲除FT0基因的细胞株，是将所述的祀向敲除FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒 系统转染目的细胞株得到的。
[0024] 所述的敲除FT0基因的细胞株，具体是通过如下步骤构建得到：
[0025] 1)将所述的祀向敲除FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装， 得到慢病毒颗粒；
[0026] 2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，得到敲除FT0基因的细胞株。
[0027] 所述的目的细胞株优选为肿瘤细胞株。
[0028] 所述的肿瘤细胞株优选为膀脫癌细胞株。
[0029] 所述的膀脫癌细胞株优选为人膀脫上皮永生化细胞SV-HUC-1。
[0030] 所述的敲除FT0基因的细胞株，是SV-皿C-1细胞中的FT0基因缺失或插入核巧酸得 到的细胞株，为如下的细胞株1-4中的任一株：
[0031] 细胞株1是在野生型FT0基因的祀向敲除位点上插入1个碱基;细胞株2是在野生型 FT0基因的祀向敲除位点上有6个碱基缺失;细胞株3是在野生型FT0基因的祀向敲除位点上 有40个碱基缺失;细胞株2是在野生型FT0基因的祀向敲除位点上有6个碱基缺失;FT0基因 的具体祀向敲除位点如下，W下序列依次对应:野生型、细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞 株4:
[0032]
「nnqf；1
[0037] 其中，划横线部分为祀向位点。
[0038] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0039] 本发明提供FT0基因的sgRNA能有效祀向FT0基因，将其构建入CRISPR/化s9慢病毒 系统，该系统能敲除FT0基因，得到敲除FT0基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中的FT0 的作用机制。
【附图说明】
[0040] 图1是检测。1'0的^个祀向敲除效率的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA Marker,泳道 spl、sp2 和 sp3 分别代表 FT0 的祀向敲除序列 sgRNAspl、sgRNAsp2 和 sgRNAsp3， 无酶代表未加入T7E1酶，空载代表未敲除FT0的对照组。
[0041 ]图2是敲除FT0的SV-HUC-1单细胞克隆株的显微照片图。
[0042] 图3是野生型SV-HUC-1细胞株中FT0基因的测序图。
[0043] 图4是敲除FT0基因的单克隆SV-HUC-1细胞株1中FT0基因的测序图。
[0044] 图5是敲除FT0基因的单克隆SV-HUC-1细胞株2中FT0基因的测序图。
[0045] 图6是敲除FT0基因的单克隆SV-HUC-1细胞株3中FT0基因的测序图。
[0046] 图7是敲除FT0基因的单克隆SV-HUC-1细胞株4中FT0基因的测序图。
[0047] 图8是野生型SV-HUC-1细胞株和敲除FT0基因的单克隆SV-册C-1细胞株1-4中FT0 基因的比对结果图；其中，WT代表野生型SV-册C-1细胞株，1、2、3和4代表敲除FT0的单克隆 SV-HUC-1细胞株，虚线代表缺失片段，下划线代表插入碱基，+代表插入，-代表缺失。
[004引图9是稳定细胞株中FT0蛋白的表达检测图；其中，SV-册C-1-WT代表野生型膀脫上 皮细胞株，SV-皿C-1-V2代表感染慢病毒lentiCRISPRV2病毒液的膀脫上皮细胞株，SV-HUC- 1-V2-FT0代表感染敲除FT0病毒液的膀脫上皮细胞株。
【具体实施方式】
[0049]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[(K)加]实施例1
[0化1 ] 1.使用CRISPRA：as9技术构建敲除FT0质粒 [0化2] l.lsgRNA寡核巧酸链合成
[0053] 使用CRISPR在线设计工具化ttp: //crispr .mit. edu/)根据评分系统，分别在FT0 的外显子3上设计3个20bp的sgRNA(spl、sp2和sp3)，并通过BLAST验证无非特异性基因。根 据运两条标准找到外显子上的核屯、序列:。1'〇3旨1?酷391^1'〇3旨1?酷392和。1'〇3旨1?酷393。编码 链模板5/端添加 CACC，非编码链模板y端添加 AAAC，与抓si酶切后形成的粘性末端互补，设 计3对CRISPR寡核巧酸链，见表1。
[0054] 表1FTO祀向位点及sgRNA寡核巧酸序列
[0化5]
[0化6] 1.2载体构建[0化7] 1.21使用抓si酶切化g PX458质粒(购于Addgene公司），30min，37°C :
[0化引
[0059] 产物，按说明书进行操作。
[0060]
[0061]
[0062] PCR仪器退火程序：
[0063] 37°C30min
[0064] 95°C维持5min，每分钟降低5°C至25°C，4°C维持
[0065] 1.24将退火形成的oligo双链和酶切后的PX458载体直接连接，室溫下，lOmin。
[0066]
[0067] 1.25将连接后的质粒转化至感受态细胞STBL3(TaKaRa公司）中，均匀涂至LB
[0068] 固体培养基平板中，置于37°C培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。
[0069] 1.3挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。
[0070] 1.4测序鉴定质粒构建成功，并命名为PX458-sgRNAspl、PX458-sgRNAsp2和PX458- sgRNAspSo
[0071] 1.5敲除效率验证。
[0072] 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于5%C02,37°C恒溫培养293T细胞(购于美 国ATCC细胞库）。取对数期细胞W5 X 105/孔接种到六孔板培养，将其分组为:PX458(阴性对 照组）、？乂458-3旨1?魁391、？乂458-3排麻392和？乂458-3排麻393。待细胞融合度达到70%~ 80 %时更换新鲜培养基，1小时后将相应的敲除质粒及阴性对照质粒各2yg经 Lipo按ctam缸e獲2 0 0 0试剂，转染到2 9 3 T细胞中，转染4 8小时候，巧光显微镜下观察转染效 果，消化收集各组细胞，采用基因组DNA提取试剂盒提取各组细胞基因组DNA。
[0073] 采用T7E1实验进一步验证切割效率：W各组细胞基因组DNA为模板，利用表2的引 物PCR扩增3条祀向序列（表1)。取400ng PCR纯化产物加入10 X Buffer2(肥B)变性退火，95 °C，5min; W2°C/s下降至85°C ;再W0. rC/s下降至25°C，4°C保持。加入10单位T7核酸内切 酶1，37°C水浴15分钟，加入化1 0.5M抓TA终止反应。T7E1酶在不完全匹配的双链DNA处切 割产生了两条片段。用表2的引物进行PCR得到的产物，spl若有酶切，酶切片段应为12化P和 220bp; sp2若有酶切，酶切片段应为200bp和190bp ; sp3若有酶切，酶切片段应为310bp和 8化P。使用2 %的琼脂糖凝胶DNA电泳，检测切割效率发现FT0的祀向序列sgRNAsp2切割效率 最高（图1)。
[0074] 表 2
[0075]
[0076] 1.6 将 FT0 基因的 sgRNAsp2 连接到 lentiCRISPRV2 慢病毒敲除载体 LentiCRISPRV2 上(步骤同1.2)，并测序验证，得到LentiCRISPRV2-FT0。
[0077] 2.包装慢病毒
[0078] 预先将六孔板用多聚赖氨酸包被30min;种入293T细胞，培养24h(37°C，5%C〇2) 后，至六孔板中细胞融合度约为70 % ;转染包装细胞：
[0079] a.混匀W下3个质粒：（购于Addgene公司）
[0080] 包装质粒PAX2 1.化g
[0081 ]辅助质粒 VSV-G 600ng
[0082] 表达质粒 LentiCRISPRV2-FT0 1.化 g
[0083] 加入0PTI-MEM至总体积为50iil，室溫放置5min;
[0084] b.混匀W下试剂室溫放置5min:
[00化]Lipofectamine? 2000 9山
[0086] OPT I-MEM 仙 1
[0087] C.把a中50iilS质粒混合液加入b中，轻轻混匀，室溫下，放置25min;
[0088] d.小屯、的将C中混合液加入种有293T的六孔板中，补加无抗生素培养基至1ml;
[0089] 培养12h后移除感染液，每孔加入3ml高浓度血清培养基生产病毒液;培养4她后， 收获病毒液至5ml离屯、管中，并重新向六孔板中补加3ml高浓度血清培养基再次生产病毒； 培养24h后，再次收获病毒液，室溫离屯、，100化pm，lOmin;使用4.5皿的滤器过滤病毒上清 液;分装后，-80°C保存。
[0090] 3.病毒感染
[0091] 1)将要感染的SV-册C-1细胞(购于美国ATCC细胞库)接种到六孔板中，过夜，待细 胞融合度约为50 %时，移去培养基，更换50化1新鲜培养基；
[0092] 2)每孔加入1ml病毒液，再加入1.化1聚凝胺polybrene，至终浓度为祉g/ml;
[0093] 3) 37 °C培养1化后，移除培养液，更换新鲜培养液后继续培养4她；
[0094] 4)重复上述1)至3)步骤增加感染效率。
[00M] 4.筛选稳定细胞株
[0096] 感染结束4她后，向每孔加入嚷岭霉素（1. Oiig/ml)，隔天换液，并保持培养基的嚷 岭霉素浓度恒定，筛选阳性克隆细胞。所得细胞株分别命名为SV-册C-1-V2-FT0。并使用有 限稀释法挑选SV-HUC-1-V2-FT0单克隆敲除细胞株，并使用活细胞动态观察系统，确定单细 胞来源(图2)。
[0097] 5.稳定细胞株鉴定
[009引提取各组敲除FT0的单克隆细胞株基因组DNA测序，鉴定出4株具有FT0基因缺失或 插入突变的稳定细胞株（图3-8)。并收集FT0基因缺失最多的细胞株蛋白质（即图8中的第3 株细胞），进行Western blot方法检测FT0蛋白在各组细胞中的表达情况（图9)。结果显示， 敲除FT0的膀脫上皮细胞SV-HUC-1-V2-FT0的FT0基因祀序列有缺失;稳定细胞株SV-皿C-1- V2-FT0比SV-HUC-1-V2对照组和SV-HUC-1-WT野生型FT0蛋白表达水平显著降低。
[0099]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种靶向敲除FTO基因的sgRNA，其特征在于：选自DNA序列如下的FT0sgRNAsp2或 FT0sgRNAsp3 ： FT0sgRNAsp2的序列如下： FT0sgRNAsp2oligol：5，-caccgCCAATGAGGATGCGAGATAC-3,； FT0sgRNAsp2oligo2:5 '-aaacGTATCTCGCATCCTCATTGGc-3 '； FT0sgRNAsp3的序列如下： FT0sgRNAsp3oligol：5，-caccgCCGGTATCTCGCATCCTCAT-3,； FT0sgRNAsp3oligo2:5 '-aaacATGAGGATGCGAGATACCGGc-3 ' 〇2. -种靶向敲除FTO基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，其特征在于:含有权利要求1所述 的靶向敲除FT0基因的sgRNA的DNA序列。3. 权利要求2所述靶向敲除FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建，其特征在于包 括如下步骤： (1)使用Bbsl酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2,得到酶切后的CRISPR/Cas9 慢病毒载体； (2 )将权利要求1所述靶向敲除F T 0基因的s g R N A的D N A序列磷酸化后与酶切后的 CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。4. 权利要求2所述的靶向敲除FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统在制备敲除FT0基因 的细胞株中的应用。5. -种敲除FT0基因的细胞株，其特征在于:是将权利要求2或3所述的靶向敲除FT0基 因的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。6. 根据权利要求5所述的敲除FT0基因的细胞株，其特征在于是通过如下步骤构建得 到： 1) 将权利要求2或3所述的靶向敲除FT0基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统通过包装细胞 进行包装，得到慢病毒颗粒； 2) 将慢病毒颗粒感染目的细胞株，得到敲除FT0基因的细胞株。7. 根据权利要求5或6所述的敲除FT0基因的细胞株，其特征在于:所述的目的细胞株为 肿瘤细胞株。8. 根据权利要求7所述的敲除FT0基因的细胞株，其特征在于:所述的肿瘤细胞株为膀 胱癌细胞株。9. 根据权利要求8所述的敲除FT0基因的细胞株，其特征在于:所述的膀胱癌细胞株为 人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1。10. 根据权利要求9所述的敲除FT0基因的细胞株，其特征在于：是SV-HUC-1细胞中的 FT0基因缺失或插入核苷酸得到的细胞株，为如下的细胞株1-4中的任一株： 细胞株1是在野生型FT0基因的靶向敲除位点上插入1个碱基;细胞株2是在野生型FT0 基因的革G向敲除位点上有6个碱基缺失;细胞株3是在野生型FT0基因的祀向敲除位点上有 40个碱基缺失;细胞株2是在野生型FT0基因的靶向敲除位点上有6个碱基缺失； FT0基因的具体靶向敲除位点如下，以下序列依次对应:野生型、细胞株1、细胞株2、细 胞株3和细胞株4: CTCACTCCGGTATCTCGCATCCTCATTGGTAATCCAGGCTGCACCTACAAGTACCTGAACACCAGGCTCTTT； CTCACTCCGGTATCTCGCATCCTTCATTGGTAATCCAGGCTGCACCTACAAGTACCTGAACACCAGGCTCTTT ， C T C A C T CCGGTATCTCGCA----------- TTGGTAATCCAGGCTGCACCTACAAGTACCTGAACACCAGGCTCTTT； CTCACTCCGGTATCTCGCA------------------------------------------------------ -------------------------CACCAGGCTCTTT； C T C A C T CCGGTATCTCGCAT --- -- ------ TGGTAATCCAGGCTGCACCTACAAGTACCTGAACACCAGGCTCTTT〇
【文档编号】C12N15/66GK106047877SQ201610487032
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】纪卫东, 苏甲林, 阙彪, 张海青, 王敏
【申请人】中山大学附属第医院, 中山大学附属第一医院