一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，本发明还提供了该疫苗的制备方法；利用卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫佐剂作用的特点，而且能高效表达外源蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防弓形虫病的目的。重组BCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种，可获得强而持久的特异性免疫。而且重组BCG稳定且安全性高，运输和保存较为容易。
【专利说明】-种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗及制备方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于疫苗技术领域，公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，本发 明还提供了该疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0003] 弓形虫为世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可入侵多种动物(如:猪、牛、羊等） 和人的有核细胞，导致弓形虫感染或弓形虫病。动物感染弓形虫后易引起动物生长、生产性 能下降，免疫力降低，繁殖力下降，严重者造成动物死亡。猪感染弓形虫病后可引起大批死 亡，怀孕母畜感染弓形虫病后导致流产。由于弓形虫生活史复杂，传播途径多样，对弓形虫 病的预防和控制尚未有理想的药物。因此，研制安全、有效、廉价的弓形虫疫苗对于防治弓 形虫病有重要意义。
[0004] 弓形虫病疫苗的研究从最早的全虫疫苗发展到核酸疫苗，由于弓形虫生活史复 杂，传播途径多样等特点，各种疫苗的免疫效果不理想。因此，在弓形虫疫苗的研究工作中， 应着重于对弓形虫保护性抗原的深入研究。化omboid蛋白是一类膜内丝氨酸蛋白酶，它是 参与EGF和EGFR信号转导过程的调节器。近年来，研究者们在许多原核和真核生物体内都发 现了该蛋白，在寄生虫领域，恶性追原虫、柔嫩艾美尔球虫、微小隐抱子虫和弓形虫中均发 现了该蛋白。研究证实化omboid蛋白在顶器口原虫侵入宿主细胞过程中发挥重要的作用。 因此，本研究使用化omboid基因作为保护性抗原基因进行重组卡介苗的构建。 白细胞介素2 ( interleukine-2, IL-2)主要是由T淋己细胞或T淋己细胞系产生的 一类重要的淋己因子，可作用于多种效应细胞，包括T、B淋己细胞、巨隧细胞和NK细胞，对免 疫应答具有广泛的上调作用。化-2是目前研究较多的细胞因子佐剂，其良好的免疫增强作 用在一些基因疫苗的研究中均得到了证实。
[0005] 卡介苗是目前唯一用于预防结核病的疫苗，在世界卫生组织全球性扩展免疫计划 中正广泛使用。卡介苗具有接种安全、热稳定性好、显著的佐剂效应等特点。近年来，BCG已 被作为载体大量用于表达外源性蛋白，且均可诱导特异性免疫应答。WBCG为载体的重组疫 苗研发日益受到国内外研究学者的关注和重视，针对的病原体设及病毒、细菌、寄生虫、月中 瘤等。有研究表明弓形虫的R〇P2(棒状体分泌蛋白）、GRA(颗粒分泌抗原）、化omboid蛋白都 可W在巧CG中表达并诱导机体的免疫反应，因此，将BCG作为载体表达弓形虫蛋白的巧CG的 研制为弓形虫疫苗的发展提供了一个新的思路，也为弓形虫病的预防提供了新的手段，具 有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗。卡介苗由于其较 好的免疫效果，W及毒副作用小、安全性高等特点被广泛的应用。构建的重组卡介苗热稳定 性强，适用于工业化生产。本发明还公开了用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法。
[0007]本发明公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，其技术解决方案如下： 一、穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备： 1、根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因（66116曰114:4￥587210)和猪化-2基因 (Genbank:X58428)的序列及穿梭载体PMV261载体图谱，分别设计引物： 猪白介素2(比-2)上游引物化-F:5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5'端的酶 切位点为&?〇RI。
[000引下游引物比-R: 5 ' CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3 '，其中 5 ' 端的酶切位点 为丑3血1。
[0009] 弓形虫化omboid基因上游引物为R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其 中5 '端的酶切位点为公amHI。
[0010] 下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5'端的酶切位点 为化。dm。
[00川 2、PCR分别扩增弓形虫化omboid基因及猪比-2基因，PCR回收后连入T载体，转入大 肠杆菌D册a感受态中，测序分析鉴定正确后，用于后续试验。分别对测序正确的质粒PMD18- T-化o、pMD18-T-IL2和PMV261进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体大片段，将回收的 PMV261、IL2及化omboid按照1:3: 3的比例进行16°C过夜连接，次日转化大肠杆菌D册a感受 态细胞中，培养菌液后提取质粒(参照试剂盒说明书），分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴 定，重组质粒命名为pMV261-IL2-Rho。
[001 ^ 3、将重组质粒pMV261-IL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并 进行传代培养。45°C热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹 鉴定，命名为巧CG pMV261-IL2-Rho。
[0013] 4、疫苗免疫效果检测：将制备好的重组卡介苗PMV261-IL2-化〇W108CFU/只的剂 量通过颈部肌肉注射途径免疫猪，并同时设BCG组和空白对照组，S免后二周腹腔注射的方 式接种弓形虫化ina I株速殖子进行攻虫试验，通过检测体溫变化，存活率，体液免疫水平， 细胞因子水平和卡介苗残留等指标进行综合评价。
[0014] 用于猪弓形虫病预防的pMV261-IL2-Rho疫苗可对抗一定剂量刚地弓形虫对猪的 攻击，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且与对照组相比差异极显著(P<〇.01); IL-2JFN-丫和IL-12细胞因子浓度均明显升高，且与对照组差异显著(P<0.05)，具有较好 的抗弓形虫效果。
[0015] 二、整合表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备： 1、根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因（66116曰114:4￥587210)和猪化-2基因 (Genbank:X58428)的序列及整合载体PMV361载体图谱，分别设计引物： 猪白介素2 (IL-2)引物：IkF: 5 ' CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3 '，其中 5 ' 端的酶切位 点为仿oRI。化-R: 5 ' CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3 '，其中 5 ' 端的酶切位点为 BamHI〇
[0016] 弓形虫化omboid引物：R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5'端的 酶切位点为姑ffiHKR-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5'端的酶切位点 为化。dm。
[0017] 2、PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪比-2基因，PCR回收后连入T载体，转入大 肠杆菌D册a感受态中，测序分析鉴定正确后，用于后续试验。分别对测序正确的质粒PMD18- T-化o、pMD18-T-IL2和PMV361进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体大片段，将回收的 PMV361、IL2及化omboid按照1:3: 3的比例进行16°C过夜连接，次日转化大肠杆菌D册a感受 态细胞中，培养菌液后提取质粒(参照试剂盒说明书），分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴 定，重组质粒命名为pMV361-IL2-Rho。
[001引 3、将重组质粒口1￥361-化2-化0电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并 进行传代培养。45°C热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹 鉴定，命名为巧CG pMV361-IL2-Rho。
[0019] 4、疫苗免疫效果检测：将制备好的重组卡介苗PMV361-IL2-化〇W108CFU/只的剂 量通过颈部肌肉注射途径免疫猪，并同时设BCG组和空白对照组，S免后二周腹腔注射的方 式接种弓形虫化ina I株速殖子进行攻虫试验，通过检测体溫变化，存活率，体液免疫水平， 细胞因子水平和卡介苗残留等指标进行综合评价。
[0020] 用于猪弓形虫病预防的pMV361-IL2-Rho疫苗其特异性抗体滴度随免疫次数增加 而逐渐升高，且与对照组相比差异极显著(p<0.01);但IL-2JFN-丫和IL-12细胞因子浓度 与对照组差异不显著。
[0021] 将本发明的两种用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗通过颈部肌肉注射途径免疫 猪，W腹腔注射的方式接种弓形虫化ina I株速殖子进行攻虫试验，通过检测体溫变化，存 活率，体液免疫水平，细胞因子水平和卡介苗残留等指标进行综合评价。结果显示，用于猪 弓形虫病预防的重组卡介苗巧CG pMV261-IL2-Rho具有明显的免疫促进作用，其体液免疫 水平，细胞因子水平指标均强于阴性对照组，且无卡介苗残留，具有较好的抗刚地弓形虫效 果。
[0022] 本发明的积极效果在于:利用卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液 免疫佐剂作用的特点，而且能高效表达外源蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用， 两者优势组合，达到更好的预防弓形虫病的目的。重组BCG集佐剂和载体于一身、兼多种外 源基因与活疫苗于一体，一次接种，可获得强而持久的特异性免疫。而且重组BCG稳定且安 全性高，运输和保存较为容易。
[0023]
【附图说明】： 图1为本发明pMV2(3)61-IL2-I?ho在卡介苗表达SDS-PAGE结果； 图2为本发明pMV2(3)61-Ik^o在卡介苗中表达Western blotting鉴定结果； 图3为本发明卡介苗残留检测结果。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 一、穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备及评价效果： (一)预防猪弓形虫病的PMV261-IL2-化0重组卡介苗的制备步骤： 1、引物设计 参照猪白介素2 (I心2 )基因 DNA序列和刚地弓形虫Rhombo i d基因 DNA序列及穿梭载体 PMV261载体图谱设计2对引物并引进酶切位点。
[0025] 猪白介素2(I)上游引物化-F:5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5'端 的酶切位点为
[0026] 下游引物比-R: 5 ' CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3 '，其中 5 ' 端的酶切位点 为丑3血1。
[0027] 弓形虫化omboid基因上游引物为R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其 中5 '端的酶切位点为公amHI。
[002引下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5'端的酶切位点 为化。dm。
[0029] 2、pMV261-IL2-Rho 质粒的构建 PCR分别扩增猪白介素2(比-2)和化omboid基因，纯化PCR产物并分别克隆至PMD18-T载 体并进行菌液PCR、测序鉴定并分别命名为PMD18-T-IL2和PMD18-T-I化0。分别将PMD18-T- IL2用优oRI酶切，pMD18-T-I?ho用姑細1、化ndllI酶切并回收目的片段，与用怎coRI、 化打dm酶切的PMV261载体连接，连接产物转化至反DH5a感受态细胞后筛选重组质 粒，测序，酶切鉴定正确后将重组质粒命名为pMV261-IL2-Rho。
[0030] 3、BCG感受态的制备 将纯培养的卡介苗长到对数生长期，从37°C培养箱中取出BCG菌液，无菌条件下，离屯、 收集菌体，加4°C预冷的10%的甘油30mL洗涂沉淀，再次离屯、，重复洗涂两次后用10%甘油将 沉淀吹起混匀，用1.5mL离屯、管进行分装，每管约10化L，分装好后直接用于电转或放于-80 °(：冰箱储存备用。
[0031] 4、电穿孔转化卡介苗 取20ul重组质粒PMV261-IL2-化0加入到BCG感受态中，轻轻吹打使二者充分混匀，放入 冰水混合物中30min后，将混合液转移置0.1cm的电转杯中（电转杯要提前预冷），进行电转， 电穿参数为：电压1350V，电容30uF。电转后迅速向电转杯中加入0.5mL卡介苗完全培养基， 混匀后移入到1.5mL灭菌离屯、管中，37°C恒溫培养。4化后，取15化1在添加卡那霉素（2化g/ mL)的卡介苗固体培养皿上用接种环均匀涂布，放置15min左右，待培养基充分吸收后用封 口膜密封好，37°C恒溫培养，大约4周后即可看到有菜花样的菌落生成。
[0032] 5、表达产物SDS-PAGE及Western blotting检测 从平板上挑取菌落，接种于含Kan抗性的液体培养基中，37°C培养至对数生长期后，45 °C水浴中诱导4h，离屯、收集菌体，加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中煮5min。取 12uL 上述菌液进行 SDS-PAGE 分析（见附图 1; 1，3 : BCG ; 2 : pMV261 -化-Rho)及 Wes tern blotting 鉴定(见附图2;2:pMV261-IL-Rho)。
[0033] (二)用于猪弓形虫病预防的pMV261-IL2-Rho重组卡介苗的效果评价 1、试验动物分组与免疫 试验动物采用1月龄断奶仔猪，6.0~10 kg，随机分为3组，每组2只。将PMV261-IL2-化0 W10化即的剂量通过颈部肌肉注射途径免疫猪，并同时设BCG免疫组和阴性对照组。分为S 次免疫，每次间隔时间为二周。
[0034] 2、免疫保护评价指标 2.1体液免疫水平的检测 分别于每次免疫前对猪进行前腔静脉采血，4°C静置离屯、分离血清，将血清-20°C保存 备用。W重组蛋白作为包被抗原，（lOyg/mL)，通过间接化ISA方法检测猪血清中IgG的变化 情况。结果一免后pMV261-IL2-Rho与对照组相比IgG滴度变化不大，随着免疫次数的增加 IgG滴度逐渐升高。S免后pMV261-IL2-Rho组血清抗体达到较高水平，与对照组相比差异极 显著(P<0.01)(见表1)。运表明用于猪弓形虫病预防的PMV261-IL2-化0疫苗，能够引起较高 的体液免疫。
[0035] 亲1么巧巧rfn猜特异忡坑化1祐磕底巧化信瓶 细腿巧于氷干的粒测
采用化ISA方法检测细胞因子比-2、IFN-丫、比-12,具体步骤参照各自试剂盒说明书进 行。用Ducan's多重比较方差分析评价免疫PMV261-IL2-化0疫苗组与对照组猪血清中比-2、 IFN-丫、IL12变化的显著性差异。其结果如表2、3、4所示，表中结果表示为平均数(Mean)± 平均标准误（Sl:andard error, SE)(p<0.05)，表不差异显著。
[0036] 对猪血清中IL-2JFN-丫和IL-12变化情况的检测结果为，随着免疫次数增加， pMV261-IL2-Rho组血清IL-2JFN-丫、比-12水平呈上升趋势，在S免后，pMV261-IL2-I?ho组 与对照组比差异显著(P<〇.05)。运证明本发明所提供的用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗 pMV261-IL2-Rho,能够引起较高的化1型细胞免疫应答。
[0037] 夫2各纽巧佈清n,-2磕底巧化信細（ne/mU 2.3攻虫试验
第S次免疫后二周通过腹腔注射的方式接种弓形虫化ina I株速殖子IX 108个/只进 行攻虫试验。攻虫后每隔2天测量一次体溫并记录。攻虫后20天对所有猪进行剖杀。
[0038] 攻虫后观察并记录各组猪的体溫计死亡情况。结果显示各组猪在免疫期间，未见 体溫明显变化和反应异常，当用弓形虫化ina I株速殖子感染后，91￥261-比2-化〇组和对照 组猪体溫有差异(见表5)，对照组体溫在第6-12天体溫都高于正常体溫范围（38-39.5°C)， PMV261-IL2-化0组在第6-10天体溫高于正常范围，各组猪在第6-10天均出现精神沉郁，食 欲下降等症状。其中pMV261-IL2-Rho组猪体溫在第12天就开始下降恢复至正常范围，对照 组在第14天体溫恢复至正常范围。各组在试验期间无死亡情况出现。
[0039] 表5攻虫后不同时间的体温变化情况rC ) 2.4卡介苗残留检测
攻虫后20天剖杀猪，采集屯、、肝、脾、肺、肾、脑部位组织，然后提取各组织中的总RNA，设 计特异引物（R-F: 5' ATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'及R-R: 5' AATGTAGGACAAATCCCTGTGG)利 用RT-PCR技术扩增化omboid基因，检测卡介苗的残留情况。
[0040] 结果(见附图3; B: PMV261-比-化0; 1-6分别为:屯、，肝，脾，肺，肾，脑），表明在免疫 后的20天，采集的免疫器官组织中都未检测到Rhomboid基因的表达。运说明卡介苗在免疫 后的20天后无残留。
[0041 ] 实施例2 二、整合表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备及评价效果： (一)预防猪弓形虫病的PMV361-IL2-化0重组卡介苗的制备步骤： 1、引物设计 参照猪白介素2 (I心2 )基因 DNA序列和刚地弓形虫Rhombo i d基因 DNA序列及穿梭载体 PMV361载体图谱设计2对引物并引进酶切位点。
[0042] 猪白介素2(I)上游引物化-F:5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5'端 的酶切位点为
[0043] 下游引物比-R: 5 ' CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3 '，其中 5 ' 端的酶切位点 为丑3血1。
[0044] 弓形虫化omboid基因上游引物为R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其 中5 '端的酶切位点为公amHI。
[0045] 下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5'端的酶切位点 为化。dm。
[0046] 2、pMV361-IL2-Rho 质粒的构建 将猪白介素2(比-2)和化omboid基因 PCR纯化产物分别克隆至pMDlS-T载体并进行菌液 PCR、测序鉴定并分别命名为PMD18-T-IL2和pMD18-T-Rho。分别将PMD18-T-IL2用怎coRI、 公amHI酶切，pMD 18-T-Rho用姑fflHI、化ndllI酶切并回收目的片段，与用优oRI、化ndllI酶切 的PMV361载体连接，连接产物转化至^ 0册〇感受态细胞后筛选重组质粒，测序，酶切 鉴定正确后将重组质粒命名为pMV361-IL2-Rho。
[0047] 3、BCG感受态的制备 将纯培养的卡介苗长到对数生长期，从37°C培养箱中取出BCG菌液，无菌条件下，离屯、 收集菌体，加4°C预冷的10%的甘油30mL洗涂沉淀，再次离屯、，重复洗涂两次后用10%甘油将 沉淀吹起混匀，用1.5mL离屯、管进行分装，每管约10化L，分装好后直接用于电转或放于-80 °(：冰箱储存备用。
[004引4、电穿孔转化卡介苗 取20ul重组质粒PMV361-IL2-化0加入到BCG感受态中，轻轻吹打使二者充分混匀，放入 冰水混合物中30min后，将混合液转移置0.1cm的电转杯中（电转杯要提前预冷），进行电转， 电穿参数为：电压1350V，电容30uF。电转后迅速向电转杯中加入0.5mL卡介苗完全培养基， 混匀后移入到1.5mL灭菌离屯、管中，37°C恒溫培养。4化后，取15化L在添加卡那霉素（2化g/ mL)的卡介苗固体培养皿上用接种环均匀涂布，放置15min左右，待培养基充分吸收后用封 口膜密封好，37°C恒溫培养，大约4周后即可看到有菜花样的菌落生成。
[0049] 5、表达产物SDS-PAGE及Western blotting检测 从平板上挑取菌落，接种于含Kan抗性的液体培养基中，37°C培养至对数生长期后，45 °C水浴中诱导4h，离屯、收集菌体，加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中煮5min。取 12uL 上述菌液进行 SDS-PAGE 分析（见附图 1; 1，3 : BCG ; 4 : pMV361 -化-Rho)及 Wes tern blotting 鉴定(见附图2; 1 :pMV361-IL-Rho)。
[0050] (二）、用于猪弓形虫病预防的pMV361-IL2-Rho重组卡介苗的效果评价 1、试验动物分组与免疫 试验动物采用1月龄断奶仔猪，6.0~10 kg，随机分为3组，每组2只。将PMV361-IL2-化0 W10化即的剂量通过颈部肌肉注射途径免疫猪，并同时设BCG免疫组和阴性对照组。分为S 次免疫，每次间隔时间为二周。
[0051] 2、免疫保护评价指标 2.1体液免疫水平的检测 将本发明的疫苗PMV361-IL2-化0免疫猪，每次免疫之前前腔静脉采血，分离血清后-20 °C保存。W重组蛋白作为包被抗原，（lOiig/mL)，通过间接化ISA方法检测猪血清中IgG的变 化情况。结果一免后91￥361-化2-化〇组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免 之后IgG滴度逐渐上升。S免后测定结果PMV361-IL2-化0组血清抗体达到较高水平，与对照 组相比差异极显著(P<0.01)(见表1)。运表明本发明提供的用于猪弓形虫病预防的PMV361- IL2-Rho疫苗，能够引起较高的体液免疫。
[0052] 2.2细胞因子水平的检测 采用化ISA方法检测细胞因子比-2、IFN-丫、比-12,具体步骤参照各自试剂盒说明书进 行。用Ducan's多重比较方差分析评价免疫PMV361-IL2-化0疫苗组与对照组猪血清中比-2、 IFN-丫、IL12变化的显著性差异。其结果如表2、3、4所示，表中结果表示为平均数(Mean)± 平均标准误（Sl:andard error, SE)(p<0.05)，表示差异显著。
[0化3] 结果显示，在免疫期间PMV361-IL2-化0组血清IL-2JFN-丫和IL-12的水平虽然略 有升高，但与对照组相比差异不显著(P〉〇.〇5)(见表2、3、4)。
[0化4] 2.3攻虫试验 第S次免疫后二周通过腹腔注射的方式接种弓形虫化ina I株速殖子IX 108个/只进 行攻虫试验。攻虫后每隔2天测量一次体溫并记录。攻虫后20天对所有猪进行剖杀。
[0055]攻虫后观察并记录各组猪的体溫计死亡情况。结果显示各组猪在免疫期间，未见 体溫明显变化和反应异常，当用弓形虫化ina I株速殖子感染后，91￥361-比2-化〇组和对照 组猪体溫有差异(见表5)，对照组体溫在第6-12天体溫都高于正常体溫范围（38-39.5°C)， PMV361-IL2-化0组在第6-10天体溫高于正常范围，各组猪在第6-10天均出现精神沉郁，食 欲下降等症状。其中pMV361-IL2-Rho组猪体溫在第12天就开始下降恢复至正常范围，对照 组在第14天体溫恢复至正常范围。各组在试验期间无死亡情况出现。
[0化6] 2.4卡介苗残留检测 攻虫后20天剖杀猪，采集屯、、肝、脾、肺、肾、脑部位组织，然后提取各组织中的总RNA，设 计特异引物（R-F: 5' ATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'及R-R: 5' AATGTAGGACAAATCCCTGTGG)利 用RT-PCR技术扩增化omboid基因，检测卡介苗的残留情况。
[0057] 结果(见附图3; A: PMV361-比-化0; 1-6分别为:屯、，肝，脾，肺，肾，脑），表明在免疫 后的20天，采集的免疫器官组织中都未检测到Rhomboid基因的表达。运说明卡介苗在免疫 后的20天后无残留。
【主权项】
1. 穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法，包括以下步骤： 根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因（Genbank:AY587210)和猪IL-2基因（Genbank: X58428)的序列及穿梭载体pMV261载体图谱，分别设计引物： 猪白介素2(IL-2)上游引物IL-F: 5 'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5'端的酶 切位点为五coRI; 下游引物IL-R: 5 ' CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3 '，其中 5 ' 端的酶切位点为 BanMl ； 弓形虫Rhomboid基因上游引物R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5'端 的酶切位点为&ΜΠ ; 下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5 ' 端的酶切位点为 Η?η?ΙΙΙ-, PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL-2基因，PCR回收后连入Τ载体，转入大肠杆菌 DH5a感受态中，分别对测序正确的质粒pMD18-T-Rho、pMD18-T-IL2和pMV261进行双酶切，分 别回收两个目的片段和载体片段，将回收的PMV261、IL2及Rhomboid按照1:3 :3的比例进行 16°C过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，培养菌液后提取质粒，分别对重组质 粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV261-IL2-Rho; 将重组质粒pMV261-IL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传 代培养;45°C热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命 名为rBCG pMV261-IL2-Rho。2. 整合表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法，包括以下步骤： 根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因（Genbank:AY587210)和猪IL-2基因（Genbank: X58428)的序列及整合载体pMV361载体图谱，分别设计引物： 猪白介素 2 (IL-2)上游引物 I L-F: 5 ' CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5'端的酶 切位点为五coRI; 下游引物 I L-R: 5 ' CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3 '，其中 5 ' 端的酶切位点为 BanMl ； 弓形虫Rhombo id基因上游引物R-F: 5 ' CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中 5'端 的酶切位点为&ΜΠ ; 下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5 ' 端的酶切位点为 Η?η?ΙΙΙ-, PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL-2基因，PCR回收后连入Τ载体，转入大肠杆菌 DH5a感受态中；分别对测序正确的质粒pMD18-T-Rho、pMD18-T-IL2和pMV361进行双酶切，分 别回收两个目的片段和载体片段，将回收的PMV361、IL2及Rhomboid按照1:3 :3的比例进行 16°C过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，培养菌液后提取质粒，分别对重组质 粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV361-IL2-Rho; 将重组质粒pMV361-IL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传 代培养;45°C热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命 名为rBCG pMV361-IL2-Rho。
【文档编号】C12N15/74GK106047914SQ201610303085
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】宫鹏涛, 张西臣, 信彩岩, 于晓娜, 李建华, 王伟荣, 李显赫, 杨举, 李 赫, 李棕松
【申请人】吉林大学