一种电压门控钠离子通道Nav1.9异源表达系统及应用
【专利摘要】一种电压门控钠离子通道Nav1.9异源表达系统及应用。基于蛋白融合表达策略，成功构建一种在异源细胞（ND7/23细胞和CHO?K1细胞）功能性表达的Nav1.9异源表达系统，其表达的电流幅度较大且稳定、具有DRG细胞上野生型Nav1.9电流相似的电生理和药理学特征，用于研究Nav1.9药理学及作用于Nav1.9的药物分子筛选。
【专利说明】
一种电压门控钠离子通道Nav1.9异源表达系统及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学中一种表达系统及应用，具体涉及一种疼痛相关钠离子通道Nav1.9异源表达系统及应用。
【背景技术】
[0002]Navl.9电流在小直径的DRG细胞和三叉神经等外周伤害感觉神经元中高表达，对比另外8个钠离子通道，Navl.9具有独特的电生理特性使得其在神经元中扮演着一个“阈值通道”，能放大细微的阈下刺激而介导动作电位的产生从而引起神经元的兴奋。近年来大量的研究证明Navl.9在炎性、神经性疼痛以及冷觉感知中扮演重要的角色。特别是随着高通量测序技术的发展，鉴定到多个Navl.9通道编码基因突变引起神经性疼痛和家族性的神经性疾病。因此Navl.9与疼痛相关的研究是研究者聚焦的一个热点。再者，目前Navl.9几乎不能异源表达的问题是世界公认的，并且在低温(28°C)培养转入ND7/23细胞也只有300pA左右的电流产生，且电流不稳定，无论是对Navl.9的药理学研究和药物筛选都存在很大的限制，这实际上也是导致对Navl.9研究进展相对较为缓慢的原因之一。因此，构建一个能稳定表达Navl.9电流的异源表达系统是急待解决的关键技术。
【发明内容】
[0003]本发明旨在于提供一种Nav1.9的异源表达系统及应用，该表达系统能够稳定表达电流幅度大的Nav1.9电流，以解决Nav1.9疼痛相关研究中电流表达的关键问题。
[0004]下面结合附图对本研究作进一步的说明说明书附图
图1 Nav1.9-GFP蛋白框架图；
图2 Nav1.9-GFP在ND7/23细胞中表达的电生理特征图谱；
图3 Nav1.9-GFP在CHO-Kl细胞中表达的电流图。
[0005]跨膜蛋白的功能性表达与翻译修饰后内质网转运相关，而内质网转运主要是由于跨膜蛋白的胞内段所影响(N-端、C-端和三个胞内连接区)。以CDSa为模式分子研究内质网滞留情况，我们将五个胞内区分别嵌入⑶8α的C-端，发现Nav1.9的C-端存在显著的内质网滞留信号。由于通道的C-端自身柔性大，存在多个调控位点，可能C-端是影响Nav1.9异源表达的一个重要原因。据这一点，我们经过数年探索，基于蛋白融合表达策略，成功构建了一个在异源细胞(ND7/23细胞和CHO-Kl细胞)功能性表达的Nav1.9异源表达体系，其表达的电流幅度较大且稳定、具有DRG细胞上野生型Nav1.9电流相似的电生理和药理学特征；
本发明构建的Nav1.9表达系统具有易操作，电流幅度大且稳定，背景干扰小，可对Nav1.9的动力学进行研究等优势，是一个研究Nav1.9药理学及作用于Nav1.9的药物分子筛选的理想工具。
[0006]【具体实施方式】:
ND7/23细胞是大鼠DRG细胞与神经胶质瘤细胞的杂交细胞，CHO-Kl细胞是中国仓鼠卵母细胞，这两种细胞易于培养且相对稳定，在电生理研究中常被用来各种离子通道的表达。我们设计了一个Nav1.9的融合蛋白(称为Nav1.9-GFP)，表达于ND7/23细胞中，培养36h后进行全细胞膜片钳实验。
[0007]1.本发明关键技术
1.1以pEGFP-ΝΙ表达载体为模板，构建hNavl.9(p.V165I )-linker_GFP融合蛋白，简称Nav1.9-GFP。如图1所示，人类Nav1.9(p.V165I)蛋白和通过短的I inker (ARDPPAA)连接绿色荧光蛋白GFP;
1.2异源细胞表达:根据转染试剂的要求，将4yg Nav1.9-GFP质粒转入密度约90%的ND7/23或CHO-Kl细胞中，6小时后用胰酶消化更换成正常培养基放入37°C、5% CO2培养箱中培养20小时，然后再将细胞转入29 °C、5% CO2培养箱中培养，待培养20小时后即可进行电生理分析和其他Nav1.9相关研究。
[0008]
2.实验结果
2.1 Nav1.9-GFP在ND7/23细胞中表达的电生理特征
如图2所示，转染Nav1.9通道后通过膜片钳全细胞记录模式记录的最大电流只有200pA左右(图2A左)，而转染Nav1.9-GFP通道的最大激活电流近1.5nA(图2A右)，电流密度显著增大(图28，20。表明似￥1.9-6??能在仰7/23细胞中表达幅度大且稳定的似￥1.9电流。并且Nav1.9-GFP表达的电流在记录的十分钟内保持稳定(图2D);
Nav1.9-GFP的激活曲线和稳态失活曲线，两者有较大重叠区，这与文献报道类似(图
2E)；
2.2图3所示，Nav1.9-GFP在CHO-Kl细胞中表达也能产生大的电流。
[0009]上述实验结果表明通过蛋白融合表达策略构建的Nav1.9异源表达体系在ND7/23细胞以及CHO-Kl细胞中均能表达幅度较大且稳定的电流，具有DRG细胞上野生型Nav1.9电流相似的电生理和药理学特征。并且利用该系统验证了已报道的致病突变的电生理特点，跟报道的结果一致。因此，本发明构建的钠离子通道Nav1.9异源表达系统，是研究Nav1.9与疼痛疾病相关的分子机制以及作用于Nav1.9的药物分子筛选的理想工具。
【主权项】
1.一种钠离子通道Navl.9异源表达系统，其特征在于，基于蛋白融合表达策略构建一种在异源细胞功能性表达的Nav1.9异源表达系统。2.根据权利要求书I所述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白框架为图1所示。3.根据权利要求书I所述表达系统，其特征在于，表达的电流幅度较大且稳定、具有DRG细胞上野生型Nav1.9电流相似的电生理和药理学特征。4.一种如权利要求1?3中所述Navl.9异源表达系统在Nav1.9药理学研究及Nav1.9的药物分子筛选中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106047929SQ201610460598
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】刘中华, 梁宋平, 周熙
【申请人】湖南师范大学