一种用于实时检测nasba产物的高特异探针的制作方法
【专利摘要】本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针及检测NASBA产物的方法。本发明所述高特异探针由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1?4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。本发明所述高特异探针应用于NASBA扩增产物的检测，灵敏度高，特异性强，且缩短了检测时间，使得NASBA检测技术可更好的应用于病原微生物的核酸检测。
【专利说明】
-种用于实时检测NASBA产物的高特异探针
技术领域
[0001] 本发明属于核酸扩增技术领域，设及一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立 并广泛应用于分子诊断试剂中。恒溫扩增技术是继PCR技术后发展起来的一口新型的体外 核酸扩增技术。目前恒溫扩增技术主要有:滚环核酸扩增、环介导等溫扩增、链置换扩增、依 赖核酸序列扩增和解链酶扩增等。恒溫扩增具有快速、高效、特异性好等优点，且无需专用 设备。
[0003] 依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即 NASBA扩增技术，是在PCR基础上发展起来的一种扩增RNA的新技术。NASBA是由一对带有T7 启动子序列的引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒溫扩增的过程。在 4rC恒溫条件下，在反应速度方面，NASBA扩增化可将模板RNA扩增约109~1〇12倍，而通常的 PCR反应需要2~化。在检测灵敏度方面，NASBA可W检测到溶液中低于lOgene copies/化的 痕量祀标，而PCR的检测限在lOOgene copies/化左右。因此，NASBA技术无论是扩增效率还 是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅需要一个4rC的恒溫条件，水浴 锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降溫等常规PCR所依赖的溫控设备，因此NASBA技术 的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还具有操作简便、特异性强、灵敏度高 等诸多优点，已广泛应用于病原体、肿瘤诊断和监控、疾病易发性检测、兽疾诊断等领域。
[0004] 目前，NASBA扩增产物的检测主要包括直接检测、SBA电化学发光技术、寡核巧酸检 测和SBA分子信标检测。直接检测即采用电泳凝胶的方式进行检测，属于初步检测反应产 物;SBA电化学发光技术灵敏度高，但所需时间长。SBA分子信标检测灵敏度相对于SBA电化 学发光技术略低，但所需时间短。NASBA扩增产物在线检测最常用的为分子信标的方法，但 由于NASBA扩增反应由S酶联合共同作用，且S酶所用浓度相对较高，对体系中的核酸攻击 性强，随着反应时间的延长，使得体系中的分子信标易于引物发生非特异性反应，造成假阳 性信号的产生，导致结果误判，对后续诊断带来一定的困难。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的为了解决上述问题，本发明提供了一种用于实时检测NASBA产 物的高特异探针，采用邮邻探针代替分子信标，可有效的避免上述问题，提高了 NASBA扩增 产物在线检测的特异性。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
[0007] -种高特异探针，其特征在于，由两条邮邻的核巧酸序列组成，所述两条邮邻的核 巧酸序列3'端第1-4位碱基均为核糖核巧酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核巧酸碱基。
[000引本发明提供的NASBA产物检测的高特异探针由两条邮邻核巧酸序列组成，分别命 名为探针Probe F和探针Probe R，所述两条邮邻核巧酸序列的组成均为核糖核巧酸和脱氧 核糖核巧酸，核巧酸序列的3 '端第1-4位碱基均为核糖核巧酸碱基，5 '端均为脱氧核糖核巧 酸碱基。
[0009] 本发明所述高特异探针中的两条邮邻核巧酸序列的链长为8-18个碱基。在一些实 施方案中，所述高特异探针中的两条邮邻核巧酸序列的链长为10-13个碱基。
[0010] 本发明所述高特异探针中的两条邮邻核巧酸序列与NASBA扩增产物通过碱基互补 配对结合。所述探针Probe-F结合于单链RNA产物的上游，探针Probe-R结合在单链RNA产物 的下游。
[0011] 本发明所述高特异探针中的两条邮邻核巧酸序列与NASBA扩增产物结合后两条链 之间的距离为0-8个碱基之间。
[0012] 所述高特异探针中的两条邮邻核巧酸序列中处于上游的一条核酸序列Probe-F的 3'端标记有巧光报告基团，处于下游的一条核酸序列的5'端标记有巧光泽灭基团Probe-R。 当无 NASBA扩增产物时，两条邮邻核巧酸序列游离于体系中，发射巧光，可检测到强巧光信 号。当有NASBA扩增产物时，所述两条邮邻核巧酸序列与NASBA扩增产物结合后，Probe-F的 3'端的巧光报告基团与Probe-R的5'端的巧光泽灭基团非常接近，巧光分子发出的巧光被 泽灭分子吸收，并W热能形式散失，使体系中巧光信号降低，实时检测显示数据为倒S形曲 线。
[0013] 其中，所述Probe-F的3 '端标记的巧光报告基团可W为FAM，TET，皿X，JOE，CY3， CY5，R0X，Texas Red等。
[0014] 所述Probe-R的5 '端标记巧光泽灭基团可W为TAMRA，B册1，B册2，CY5等。
[0015] 本发明所述的高特异探针在阴性对照试验中扩增化仍有良好的特异性，无非特异 扩增，表明所述高特异探针在NASBA产物实时检测中有很强的特异性。因此本发明还提供了 上述高特异探针在NASBA扩增产物的实时在线检测中应用。
[0016] 本发明还提供了一种NASBA扩增产物的实时在线检测方法，取包含所述高特异探 针的恒溫扩增缓冲液与恒溫扩增酶溶液、RNA模板混合成反应体系，置于在实时巧光定量 PCR仪中，在4 rc反应1小时。
[0017] 其中，所述恒溫扩增缓冲液中高特异探针浓度优选为0.0化1-化1。在一些实施方 案中，所述高特异探针浓度为0.化M。
[0018] 优选的，所述反应体系中所述恒溫扩增缓冲液与恒溫扩增酶溶液、RNA模板的体积 比为7:1:2。
[0019] 在一些实施方案中，所述恒溫扩增缓冲液其组成如下：恒溫扩增缓冲液的溶剂为 水，溶质及浓度如下：200mM lYiS-H化(pH 8.0)，0.5咖上游引物，0.5咖下游引物，0.1咖上 游探针Probe-F，0.1咖下游探针Probe-R，50mM DTT，10mM dNTPaOmM rNTP，80mM MgC12， 450mM KCl，15 %体积百分含量DMSO，IM山梨糖醇，20mM四甲基氯化锭。
[0020] 在一些实施方案中，所述恒溫扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下:AMV逆转 录酶lU/化，T7RNA聚合酶抓/化，核糖核酸酶H 0.抓/化，焦憐酸酶0.抓/化，RNA酶抑制剂抓/ jiL，BSA 0.5蛇/化。
[0021] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针 及检测NASBA产物的方法。本发明所述高特异探针由两条邮邻的核巧酸序列组成，所述两条 邮邻的核巧酸序列3 '端第1-4位碱基均为核糖核巧酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核巧酸 碱基。本发明所述高特异探针应用于NASBA扩增产物的检测，灵敏度高，特异性强，且缩短了 检测时间，使得NASBA检测技术可更好的应用于病原微生物的核酸检测。
【附图说明】
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023] 图1示实施例2邮邻探针检测NSABA扩增产物;其中，图a为甲型流感通用检测引物 InfA-TY-PrimerF，InfA-TY-Pr imerR，和探针 InfA-TY-PrimerF、InfA-TY-Pr imerR 检测扩增 曲线，线巧阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感MP基因 RNA的检测结果；图b为甲型流 感H1 亚型引物InfA-Hl-PrimerF、InfA-Hl-PrimerR，和探针Inf A-Hl-ProbeF、Inf A-H1- ProbeR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感化亚型HA基因 RNA的 检测结果；图C为甲型流感H3亚型引物InfA-H3-PrimerF、InfA-H3-PrimerR，和探针InfA- 册-ProbeF、InfA-册-ProbeR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流 感册亚型HA基因 RNA的检测结果；图d为乙型流感通用检测引物I址B-TY-PrimerF，In巧-TY- PrimerR，和探针InfB-TY-PrimerF、InfB-TY-PrimerR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测 结果，线2为扩增乙型流感MP基因 RNA的检测结果；
[0024] 图2示实施例3不同浓度邮邻探针扩增比较;其中，线1为探针浓度为1咖时的扩增 检测结果，线2为探针浓度为0.1測时的扩增检测结果，线3为探针浓度为0.0 liiM时的检测结 果；
[0025] 图3示实施例3邮邻探针特异性分析;其中，线1为采用邮邻探针检测甲型流感MP基 因 RNA扩增化的检测结果，线2为阴性对照扩增两小时的检测结果，线3为采用普通分子信标 阴性化检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0027] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。下述实施 例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[002引实施例1、用于流感病毒NASBA扩增产物检测的邮邻探针
[0029]本发明设计了四套用于流感病毒NASBA扩增产物检测的引物及邮邻探针，用于甲 型流感病毒基因检测的引物为InfA-TY-PrimerfMnfA-TY-PrimerR，相应邮邻探针为1扯八- 了￥斗甘〇66尸、111'4-1￥斗'〇661?，用于甲型流感病毒化亚型基因检测的引物为111'4-化- PrimerF、InfA-Hl-PrimerR，相应邮邻探针为InfA-Hl-ProbeF、InfA-Hl-ProbeR，用于甲型 流感病毒册亚型基因检测的引物为InfA-H3-PrimerF、InfA-H3-PrimerR，相应邮邻探针为 1〇'4-邮斗'〇66。、111'4-邮斗'〇661?，用于乙型流感病毒基因检测的引物为111巧-1￥- PrimerF、InfB-TY-PrimerR，相应邮邻探针为 InfB-TY-ProbeF、InfB-TY-ProbeR。用于各病 毒检测的NASBA引物如表1所示，Btt邻探针序列如表2所示。
[0030] 表1用于流感病毒特异性检测的NSABA引物序列
[0031]
[0034] 采用上述引物和探针可特异检测甲型流感病毒、甲型流感病毒化亚型、H3亚型W 及乙型流感病毒。
[0035] 实施例2、邮邻探针用于NASBA产物检测
[0036] -、RNA模板的制备
[0037] 制备RNA模板所用质粒由博奥生物集团有限公司提供，包括含有甲型流感病毒基 因的重组质粒pUC-InfA-TY，含有甲型流感病毒H1亚型HA基因的重组质粒pUC-InfA-Hl，含 有甲型流感病毒册亚型HA基因的重组质粒pUC-InfA-册，含有乙型流感病毒基因的重组质 粒pUC-Inf B-TY。RNA模板制备过程如下。
[0038] 1、酶切:先将各供试重组质粒使用EcoRI内切酶37°C酶切化。
[0039] 2、转录：按扣L 5 X Transcription Optimized Buff eHPromega)，2U T7RNA聚合 酶，lOmM DTT(P;romega)，lOU重组RNA酶抑制剂（Promega)，2mM rNTP，酶切产物f5]iL配制总体 积为50化的反应体系，震动均匀后37 °C转录4h。
[0040] 3、消化:将转录完成后的体系加入化L的DNA消化酶(抽〇曰361，51]/化），震荡离屯、， 37°C 解育 20min。
[0041 ] 4、纯化：使用Ma ch er e y-Nag e 1公司的RNA纯化试剂盒产品，其产品目录号为 740948，按如下步骤纯化转录产物RNA:
[00创 a)配制RA1-C2也0H混合液：WRA1 :C2曲0H=1:1(体积比）的比例配制。每100化的转 录产物中，需要加入60化L RA1-C2曲0H混合液，即300化RA1+30化L C2曲0H溶液，在运里需 要根据转录产物的管数计算所配混合液的体积。若产物不足10化L，则用水将产物的量补到 10化L(即在每管产物中加入50iiL的天根化ase-打ee出0)。
[0043] b)将之前准备好的RA1-C抽50H混合液分到1.5mL离屯、管内，两管，每管600化，将100 化产物转入到相对应的离屯、管内，管内共70化L，充分震荡离屯、。
[0044] C)准备两个吸附柱，并做好相应的标记，将70化L产物混合液转入到吸附柱内（吸 附柱最大容量为70化L)，1.2万巧m离屯、2min，倒掉下层溶液。
[0045] d)在吸附柱内加入7(K)化的RA3,放置Imin，使其可W充分的分散在吸附柱的底部， 1.2万巧m离屯、2min，倒掉下层溶液。
[0046] e)在吸附柱内加入350化的RA3,放置2min，1.2万巧m离屯、2min，倒掉下层溶液。
[0047] f)在吸附柱内加入300化的RA3,放置2min，1.2万巧m离屯、2min，倒掉下层溶液。
[004引g)打开吸附柱的盖子3min后，1.2万巧m空离2min，倒掉下层溶液，重复此步骤一 次。
[0049] h)空离结束W后，把吸附柱转移到相对应的离屯、管中，打开吸附柱盖子放置 15min，使乙醇挥发完全，在吸附柱中加入60化Rnase-出0(试剂盒里自带的）洗脱，放置 2min，1.2万rpm 离屯、2min。
[(K)加]i)将离屯、所得模板吸回吸附柱中，放置2min，1.2万巧m离屯、2min，重复此步骤两 次。
[0051] j)丢掉吸附柱，将离屯、管内的模板取出化L，用化no化op测定其浓度，并记录其浓 度及其260/280,260/23化|：值。根据测定浓度将1?酷模板浓度稀释至10^(3〇9163/化。
[0052] 二、邮邻探针用于NASBA扩增产物的检测
[0化3] 1、将上述制备的RNA模板稀释至103copiesAiL，作为NASBA扩增的模板。
[0054] 2、NSABA扩增体系由恒溫扩增缓冲液和恒溫扩增酶溶液组成。其组成如下:恒溫扩 增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM化is-肥L(抑8.0)，0.5測上游引物，0.5測下 游引物，O.lyM上游探针，O.lyM下游探针，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCb， 450mM KCl，15 %体积百分含量DMSO，IM山梨糖醇，20mM四甲基氯化锭。按所述浓度配制相应 的扩增缓冲液。
[0055] 恒溫扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下:AMV逆转录酶lUAiL，T7RNA聚合酶 抓/化，核糖核酸酶H 0.抓/化，焦憐酸酶0.抓AiL，RNA酶抑制剂抓AiL，BSA 0.5蛇/化。按所 述浓度配制相应的酶溶液。
[0056] 3、扩增体系配制
[0057] 取化L恒溫扩增缓冲液(见步骤2)、1化恒溫扩增酶溶液(见步骤2)、2化相应模板稀 释液混合成10化反应溶液于PCR管中，旋满震荡均匀。将PCR管置于7500实时巧光定量PCR仪 中，设置4rc反应1小时，并同时完成实时在线检测。
[0化引 4、结果判读
[0059]扩增结果如图1所示，若体系有扩增则扩增曲线为倒S形曲线，若体系无扩增，则曲 线为直线。由结果可W看出NSABA扩增具有良好的特异性。
[0060] 实施例3、邮邻探针特性分析
[0061] -、邮邻探针使用浓度
[0062] 1、不同邮邻探针浓度恒溫扩增体系的配制
[0063] 恒溫扩增缓冲液 Bl:200mM Tris-肥 L(pH 8.0)，0.5咖 InfA-TY-PrimerF，0.扣 M InfA-TY-PrimerR,0.01iiM InfA-TY-ProbeF, 0 . OlyM InfA-TY-ProbeR, 50mM DTXaOmM dNTPaOmM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%体积百分含量DMS0，1M山梨糖醇，20mM四甲 基氯化锭。
[0064] 恒溫扩增缓冲液 B2:200mM Tris-HCL(抑 8.0)，0.5iiM InfA-TY-PrimerF，0.扣 M InfA-TY-PrimerR，0.1iiM InfA-TY-ProbeF，0.1iiM InfA-TY-ProbeR，50mM DTTaOmM dNTP， lOmM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%体积百分含量DMS0，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化 锭。
[00化]恒溫扩增缓冲液 B3:200mM Tris-HCL(抑 8.0)，0.5iiM InfA-TY-PrimerF，0.扣 M InfA-TY-PrimerR，化M InfA-TY-ProbeF，化M InfA-TY-ProbeR，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15 %体积百分含量DMSO，IM山梨糖醇，20mM四甲基氯化锭。
[0066] 恒溫扩增酶溶液同实施例2中酶溶液配制方法相同。
[0067] 按实施例2中扩增体系的配制方法配制S种不同邮邻探针浓度的NSABA扩增体系， 将配好体系的PCR管置于7500实时巧光定量PCR仪中，设置41°C反应1小时，并同时完成实时 在线检测。
[0068] 2、结果分析
[0069] 结果如图2所示，结果表明随着探针浓度的加大，其起始巧光值变大，其巧光变化 率也有一定的增大，但变化不显著。为了获得较好的实验数据建议邮邻探针浓度设为0.化 M，该浓度既能很好的反应扩增过程中的巧光变化，且巧光值适中，不会因为巧光值过低或 过局而超出检测器的检测范围。
[0070] 二、邮邻探针特异性分析
[0071 ] 1、恒溫扩增缓冲液的配制
[0072] 邮邻探针恒溫扩增缓冲液的配制方法同步骤一中的恒溫扩增缓冲液B2相同。
[0073] 普通分子信标恒溫扩增体系B4的配制如下：200mM Tris-H化（pH 8.0),0.扣M InfA-TY-PrimerF,0.5iiM InfA-TY-PrimerR,0. lyM InfA-TY-Pro,50mM DTXaOmM dNTP, lOmM rNTP，80mM MgCl2,450mM雌1，15%体积百分含量0150，11山梨糖醇，2〇111]\1四甲基氯化 锭。
[0074] 按实施例2中的扩增体系的配制方法配制恒溫扩增体系。将配制好的体系置于 7500实时巧光定量PCR仪中，设置41°C反应1小时，并同时完成实时在线检测。
[0075] 2、结果分析
[0076] 结果如图3所示，结果表明，采用本发明提供的邮邻探针使NSABA扩增的特异性更 好。随着扩增时间的延长，只要体系中无特异性模板，就不会产生假阳性的扩增信号，而采 用普通的分子信标随着扩增时间延长，即便体系中没有特异性模板，也会有微弱的假阳性 信号产生。
【主权项】
1. 一种高特异探针，其特征在于，由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷 酸序列3 '端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。2. 根据权利要求1所述的高特异探针，其特征在于，所述两条毗邻的核苷酸序列每条链 链长均在8-18喊基之间。3. 根据权利要求1或2所述的高特异探针，其特征在于，所述两条毗邻的核苷酸序列与 NSABA扩增产物碱基互补配对。4. 根据权利要求3所述的高特异探针，其特征在于，两条毗邻的核苷酸序列与NSABA扩 增产物碱基互补配对结合后，两条链之间的距离为0-8个碱基之间。5. 根据权利要求1-4任意一项所述的高特异探针，其特征在于，两条毗邻的核酸序列中 处于上游的一条核酸序列的3'端标记有荧光报告基团，处于下游的一条核酸序列的5'端标 记有荧光淬灭基团。6. 根据权利要求5所述的高特异探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、TET、HEX、 了(^、0￥3、0￥5、1?(^或了6138 1^(1;所述荧光淬灭基团为了411^、8即1、8即2或〇￥5。7. 权利要求1-6任意一项所述高特异探针在NASBA扩增产物的实时在线检测中应用。8. -种NASBA扩增产物的实时在线检测方法，其特征在于，取包含权利要求1-6任意一 项所述高特异探针的恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板混合成反应体系，置于在 实时荧光定量PCR仪中，在41°C反应1小时。9. 根据权利要求8所述的实时在线检测方法，其特征在于，所述高特异探针浓度为0.01 μΜ-1μΜ〇10. 根据权利要求8或9所述的实时在线检测方法，其特征在于，所述反应体系中所述恒 温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板的体积比为7:1: 2。11. 根据权利要求8-10任意一项所述的实时在线检测方法，其特征在于，所述恒温扩增 缓冲液其组成如下：恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μΜ上游引物，0.5μΜ下游引物，0 . ΙμΜ上游探针，0 . ΙμΜ下游探针，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%体积百分含量DMS0，1M山梨糖醇，20mM四甲 基氯化铵;所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下:AMV逆转录酶lU/yL，T7RNA聚 合酶5U/yL，核糖核酸酶Η 0.5U/yL，焦磷酸酶0.5U/yL，RNA酶抑制剂5U/yL，BSA 0.5yg/yL。
【文档编号】C12N15/11GK106048014SQ201610397821
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】张岩, 盖伟, 邢婉丽, 单万水, 刘厚明, 宋翠丹, 程京
【申请人】博奥生物集团有限公司, 深圳市第三人民医院