一种棉花陆海渐渗系的评价方法
【专利摘要】一种棉花陆海渐渗系的评价方法，本发明公开了一种对陆海渐渗系进行综合评价的方法，其包括：（1）黄萎病抗性鉴定；（2）陆海渐渗系的分子标记分析；（3）确定分子标记在棉花基因组的物理定位；（4）根据分子标记的物理定位，对导入的抗病染色体片段进行物理定位，并绘制陆海渐渗系的物理图谱。本发明结合黄萎病抗性鉴定和分子标记分析，通过分子标记序列与四倍体陆地棉基因组比对，对陆海渐渗系中携带抗病基因进行定位，为抗病基因的克隆与抗病品种的改良奠定基础。
【专利说明】
-种棉花陆海渐渗系的评价方法
技术领域
[0001] 本发明属于作物育种领域，具体是分子辅助育种。尤其设及一种分子标记分析和 黄萎病抗性鉴定结果来定位导入到陆地棉中携带抗病基因的海岛棉染色体片段。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病（Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Klebahn)引起的一种侵染维管束组织的±传病害，在棉花生产中普遍发生且危害最为严 重，被称为"棉花的癌症"，给世界各主要产棉国家和地区植棉业造成严重威胁。近年来，随 着全球气候变化和耕作制度变更等影响，该病害在全球范围的棉花产区逐渐蔓延，尤其是 高溫多雨的地区和年份爆发尤为严重，引起了全世界研究者的关注。
[0003] 陆地棉是我国主要的栽培棉花，栽培面积大，产量高。但是其黄萎病抗性差，且抗 源少。海岛棉高抗棉花黄萎病，但产量低，将海岛棉抗病的染色体片段或抗病基因渐渗到广 泛栽培的陆地棉中，筛选抗病的陆海渐渗系，将有利于棉花抗病新品种的选育和品种改良。
[0004] W往的研究，主要集中在陆海渐渗系抗病基因 /Q化定位方面。通过构建陆海作图 群体，结合分子标记分析和黄萎病抗性鉴定结果来定位抗病基因。该方法工作量大，且受到 作图群体大小和分子标记数量的限制，很难精细定位到抗病基因 /Q化的遗传位置。现有的 研究中，对单一的陆海渐渗系材料的黄萎病抗性评价研究鲜有报道。
[0005] 参考文献
[0006] l.Shi Y,Li W,Li A,Ge R,Zhang B,Li J et al.Constructing a high-density linkage map for Gossypium hirsutumXGossypium barbadense and identifying QTLs for lint percent曰ge.Journal of Integrative Plant Biology.2015;(5):450-67.
[0007] 2.小麦抗白粉病基因化6候选基因化LRR-RLKl和化LRR-RLK2的克隆及功能分析。
【发明内容】
[000引本发明所要解决的技术问题是:本发明结合黄萎病抗性鉴定和分子标记分析，通 过分子标记序列与四倍体陆地棉基因组比对，对陆海渐渗系中携带抗病基因进行定位，为 抗病基因的克隆与抗病品种的改良奠定基础。
[0009] 本发明提供的技术方案是：
[0010] 结合黄萎病抗性鉴定和分子标记分析，检测陆海渐渗系中的抗病染色体片段，并 根据分子标记序列在棉花基因组中的定位，对渐渗片段进行物理定位，从而对陆海渐渗系 进行综合评价，其包括如下步骤：
[0011] (1)黄萎病抗性鉴定;在溫室，通过接种法对陆海渐渗系进行大丽轮枝菌(黄萎病 菌)单菌株接种，鉴定其抗性，在病田，对陆海渐渗系进行当地混合大丽轮枝菌菌系鉴定；
[0012] (2)陆海渐渗系的分子标记分析，利用陆地棉-海岛棉遗传图谱上的分子标记，对 陆海渐渗系进行基因型分析；
[0013] (3)通过本地blast,将筛选到的、定位在渐渗系的分子标记序列与四倍体陆地棉 (AADD)基因组进行比对，确定分子标记在棉花基因组的物理定位；
[0014] (4)根据分子标记的物理定位，对导入的抗病染色体片段进行物理定位，并绘制陆 海渐渗系的物理图谱。
[0015] 本发明具有W下有益效果:本发明结合黄萎病抗性鉴定和分子标记分析结果，通 过与四倍体陆地棉基因组序列比对，对陆海渐渗系携带的抗病染色体片段进行物理定位。 该方法可W对渐渗系材料进行抗病性状和遗传背景的双重评价，有利于抗病基因/Q化的物 理定位和分子标记辅助选择育种，同时为陆海渐渗系的抗病基因的克隆和棉花抗病新品种 的选育奠定了基础。本发明的关键点是：1、通过性状评价和遗传分析对陆海渐渗系进行双 重评价;2、通过分子标记序列与棉花基因组信息比对，对陆海渐渗系的渐渗片段进行物理 定位。
【附图说明】
[0016] 图1陆海渐渗系的黄萎病抗性。
[0017] 图2标记MUCS145的电泳结果，泳道1:Ladder marker;泳道2:渐渗系2047;泳道3: 中棉所36;泳道4:海1。
[0018] 图3本地Blast+的命令。
[0019] 图4渐渗系2047的染色体片段渐渗示意图。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 审IJ，仅仅作示例说明。
[0021] (1)陆海渐渗系来源
[0022] 陆地棉品种中棉所36与海岛棉海1杂交，获得F1。利用轮回亲本中棉所36回交5代， 获得BC5F1代。然后，自交3代获得BC5F3陆海渐渗系群体。从该群体中选出1个稳定遗传的陆 海渐渗系2047用于本研究。
[0023] (2)棉花黄萎病抗性鉴定
[0024] 在溫室，通过赔石沙±纸鉢定量薩菌液方法进行单菌株抗性鉴定。将陆海渐渗系、 中棉所36、冀棉11(感病对照)和中植棉12(抗病对照)种子消毒后种于装有赔石:沙±=1:1 的混合基质的纸鉢中。在棉苗生长至一片真叶平展时，接种浓度为IX 107个抱子/ml的棉花 黄萎病菌V991抱子悬浮液10ml。接菌约20天后，采用标准的5级制进行调查并计算病情指数 DI，如表1。在病田，将陆海渐渗系、中棉所36、冀棉11和中植棉12种子播于大田，采取自然发 病法进行鉴定。待棉花生长至成株期，采用5级制棉花黄萎病分级调查，并计算病情指数DI。
[0025] 病情指数DI = [(1级病株数*1+2级病株数巧+3级病株数*3+4级病株数*4)/(调查 总株数*4) >100
[0026] 表1棉花黄萎病病级划分5级制标准
[0027]
[0028] ~利用W上方法I，分别在溫室、安阳大田和新疆大田对陆海渐渗系进行黄萎病抗性I 鉴定，结果见图1。从图中可W看出，在=个环境下，渐渗系2047的病指均在20% W下，低于 亲本中36和抗病对照冀11 (30-50% )，接近抗病对照中植棉2号（10-15% )。
[0029] (3)陆海渐渗系的分子标记分析
[0030] 本发明人实验室构建的中棉所36 X海1的BC1F1群体遗传连锁图谱，含有2292个 SSR标记位点，分布在26条染色体上，总遗传图距51 15.16cm，覆盖了棉花全基因组[1]。利用 挑选出的、均匀分布在遗传图谱上的640个SS財示记，对中棉所36、海1和陆海渐渗系进行基 因型分析。首先，选取中棉所36、海1和陆海渐渗系的幼嫩组织，提取DNA，进行PCR扩增。PCR 反应体系见表2。按照W下程序在PCR仪上进行反应：94°C:3min;(94°C:30sec;50-60°C: 4536。；72。(：：6〇36。）3〇-：34巧。163;72。[:10111111;4。(：保存。
[0031] PCR反应结束后，在扩增产物中加入化1 loading buffer,离屯、混匀。取化1扩增产 物点样，用8%聚丙締酷胺凝胶(PAGE)电泳检测结果。电泳时总电压为150V-200V，电泳化- 2h。电泳结束后，对聚丙締酷胺凝胶进行染色。染色方法如下：首先，将0.2克AgN〇3加入到 200ml d地2〇中溶解，将凝胶放入AgN〇3溶液中摇荡lOmin进行染色;然后，用200ml蒸馈水漂 洗30sec;最后，将4克化0H和2ml甲醒加入到200ml d地20中，配置显色液，将凝胶放入显色 液中摇荡直到出现清晰条带为止。
[0032] 染色后，将PAGE胶用保鲜膜包好，并置于X射线胶片观察灯下观察拍照。
[0033] 表2 PCR反应体系
[0034]
[00对图2是标记MUCS145的扩增结果。结果表明，在750bp处，海1中扩增出一条多态条 带。渐渗系2047也扩增出一条相同的条带。同理，16对标记NAU5289、DPL0085、NAU3036、 加645、NAU2733、BNL3065、DPL0283、HAU2014、BNL3145、NAU5307、NAU3434、PGML0972、 NAU4034、TMB1296也在渐渗系2047检测到多态条带。说明在运些标记位点，渐渗系2047中渐 渗了海岛棉的染色体片段。
[0036] (4)序列比对
[0037] 为了明确渐渗系中导入海岛棉染色体片段的物理位置，我们将16对多态引物序列 与四倍体陆地棉TM-1基因组(AD)数据库进行本地blast。首先，利用Blast+软件，输入操作 命令(如图3)，进行本地blast,输出引物序列定位的TXT文档。然后，根据文档中引物序列比 对的得分高低，确定15对多态标记的物理定位(表3)。
[0038] 表3多态标记的物理定位
[00-501
[0(
[0041] (5)陆海渐渗系渐渗片段的物理定位
[0042] 根据表3中多态性标记的物理定位，我们绘制了渐渗系2047的物理图谱（图4)。从 图中可W看出染色体41、42、43、44、47、413、03、04、010、012中各渐渗了1个海岛棉片段，染 色体A5、D2、D5渐渗了 2个海岛棉片段，染色体D7渐渗了 3个海岛棉片段。
【主权项】
1. 一种对陆海渐渗系进行综合评价的方法，其包括如下步骤： (1) 黄萎病抗性鉴定； (2) 陆海渐渗系的分子标记分析，利用陆地棉-海岛棉遗传图谱上的分子标记，对陆海 渐渗系进行基因型分析； (3) 通过本地blast，将筛选到的、定位在渐渗系的分子标记序列与四倍体陆地棉 (AADD)基因组进行比对，确定分子标记在棉花基因组的物理定位； (4) 根据分子标记的物理定位，对导入的抗病染色体片段进行物理定位，并绘制陆海渐 渗系的物理图谱。2. 如权利要求1所述的对陆海渐渗系进行综合评价的方法，其特征在于，所述的陆海渐 渗系通过以下方法获得： 陆地棉品种中棉所36与海岛棉海1杂交，获得F1，利用轮回亲本中棉所36回交5代，获得 BC5F1代，然后，自交3代获得BC5F3陆海渐渗系群体。3. 如权利要求1所述的对陆海渐渗系进行综合评价的方法，其特征在于，第（1)步黄萎 病抗性鉴定具体要求:在温室，通过接种法对陆海渐渗系进行大丽轮枝菌(黄萎病菌)单菌 株接种，鉴定其抗性;或在病田，对陆海渐渗系进行当地混合大丽轮枝菌菌系鉴定。4. 如权利要求1所述的对陆海渐渗系进行综合评价的方法，其特征在于，棉花黄萎病病 级划分5级制标准如下：
【文档编号】C12Q1/68GK106048033SQ201610509302
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】陈婷婷, 袁有禄, 李鹏涛, 石玉真, 王艳玲, 张雷, 刘爱英, 龚举武, 商海红, 李俊文, 巩万奎, 葛群
【申请人】中国农业科学院棉花研究所