一种多重pcr快速检测稻曲菌交配型基因的方法
【专利摘要】本发明属于农作物病原菌有性生殖类型鉴定领域，尤其涉及一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，专用于检测稻曲菌有性生殖交配型基因,包括稻曲菌分离培养、制备稻曲菌基因组DNA保存备用、PCR扩增反应和凝胶电泳检测等步骤，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点，有效提高稻曲菌交配型基因检测和交配型类型鉴定的准确度，且保证了扩增的特异性，提高了扩增效率，不会产生假阳性和非特异扩增。
【专利说明】
一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法
技术领域
[0001]本发明属于农作物病原菌有性生殖类型鉴定领域，尤其涉及一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，专用于检测稻曲菌有性生殖交配型基因。
[0002]
【背景技术】
[0003]稻曲菌[Ustilaginoidea virens Cooke Tanaka]是引起水稻稻曲病的真菌病原菌，主要侵染水稻的穗部，将稻粒转变成大于其数倍的稻曲球，这严重降低了水稻的产量和质量。该菌无性态属于半知菌亚门瘤座孢科;有性态[Villosiclava virens (Nakata) E.Tanaka & C.Tanaka]属于子囊菌亚门麦角菌科。
[0004]真菌的交配型基因(Mating-typegene)是控制其有性生殖、生存力和毒性等的遗传基础，已知研究的真菌交配类型为异宗配合或同宗配合。交配型基因主要参与有性生殖过程基因表达调控，不同细胞融合识别，以及调控信息素及其受体等。
[0005]近些年来，研究者们对稻曲菌的交配型基因进行了一些研究，例如根据子囊菌交配型基因的核苷酸序列的保守区域设计简并引物，扩增到了稻曲菌一种交配型基因(Matl-2-1)的部分序列；或根据稻曲菌同属真菌的交配型基因的保守区域设计简并引物，扩增到了交配型基因Matl-1-1和Matl-2-l部分序列。以上研究方法都是采用的常规PCR方法，且引物都是设计的简并引物，因而较难扩增到特异的交配型核苷酸序列，且耗时。
[0006]多重PCR是在常规PCR技术上发展起来的，是在同一PCR反应加入两对或两对以上的特异引物，能同时扩增出多个核苷酸序列的PCR反应。利用一次多重PCR反应，可以同时检测、鉴别出多种基因，且操作简单、快速、灵敏度高;可以大大提高检测效率、降低检测成本，具有很尚的经济效益。
[0007]但多重PCR检测方法虽具有特异灵敏性，简便快速，高通量的检测技术，但其在实际运用中也存在不少问题，比如引物二聚体的形成，以及引物与模板的错配问题；比如污染问题就是其中之一。一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导扩增失败或非特异性产物，引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。还有菌的培养基选择不当，也会易使菌生长缓慢或被抑制，导致假阴性的结果。
[0008]
【发明内容】
[0009]为了解决以上技术问题，本发明提供一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其具有操作简单、快速、灵敏度高的特点，有效提高稻曲菌交配型基因检测和交配型类型鉴定的准确度，且保证了扩增的特异性，提高了扩增效率，不会产生假阳性和非特异扩增。
[0010]解决以上技术问题的本发明的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:包括以下步骤:
(1)稻曲菌分离培养:
在稻曲病发病高峰期，收集稻曲球样本，室内保存备用，进行分离培养；
(2)提取稻曲菌基因组DNA保存备用:采用液氮研磨菌丝体，应用CTAB法提取各菌株DNA，得到的样品-22—18° C保存备用；
(3)PCR扩增反应:以稻曲菌DNA为模版，在PCR反应体系中加入两对特异引物MATlFl/MAT1RUMAT2F1/MAT2R1进行扩增反应，质量浓度比为1:1，该两对特异引物的序列分别为:
特异引物MAT1F1:5’-CTT TGA GGT TGA GTT TCG TTC AGC-3，，
特异引物MATlRl:5’-CAT TTG AAA CCG ATA GAA GCG GG-3，，
特异引物MAT2F1:5’-CCT CGC TGT ATT ATG GCA GTT TCT-3，，
特异引物MAT2R1:5’-CCC CAC AAA AAG ACC GTC CCG GA-3’。
[0011]引物是根据稻曲菌交配型基因核心序列(编码alpha-box和HMG结构域)并应用Primer Premier 5.0软件进行设计。
[0012](4)最后进行凝胶电泳检测；
PCR产物与10 XPCR上样缓冲液(loading buffer)液混合，在加核酸燃料(Goldview)染色的3%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后用紫外检测仪检测，如果扩增到两条核苷酸序列，则为说明稻曲菌有性生殖为同宗配合，如果扩增到一条序列，则说明稻曲菌有性生殖为异宗配合。
[0013]所述采用稻曲球厚垣孢子悬浮液分离方法分离稻曲菌，稻曲菌菌株接种到PSA固体培养基上，25-30° C培养12-16天;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于23-30° C震荡培养5-8天，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-75—65° C保存备用。
[0014]优化方案中，所述的分离培养为采用稻曲球厚垣孢子悬浮液分离方法分离稻曲菌，稻曲菌菌株接种到马铃薯蔗糖琼脂糖(PSA)固体培养基上，28° C培养14d左右;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于28° C震荡培养7天左右，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-70° C保存备用；
所述PCR反应体系为:基因组DNA 10 pM 2yL，含Mg2+的 10XPCR buffer lyL，dNTP 5μL，特异引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1 各I yL，Taq聚合酶 0.5pL,无菌dd H20 37.5μL，反应终体积为50yL。
[0015]所述基因组DNA的质量浓度为10 pM,dNTP 5仙的质量浓度为2.5mM，Taq聚合酶质量浓度为5U/UL。
[0016]所述特异引物MAT1F1/MAT1R1 或 MAT2F1/MAT2R1 质量浓度为 0.1-0.25μΜ。
[0017]所述特异引物MAT1F1/MAT1R1 或 MAT2F1/MAT2R1 质量浓度为 0.2μΜ。
[0018]基因组DNA10 pM 2yL:模板DNA量小时，扩增产物强度相应减弱，当模板量大时，会出现大片段扩增产物丢失或无扩增产物，且点样孔至电泳道出现强的弥散背景。本发明选用模板DNA浓度10 pM，能扩增到条带清晰、稳定、分辨率到的产物。
[0019]特异引物MATlFl/MATlRl、MAT2Fl/MAT2Rl(0.2yM)各IyL:引物为PCR反应提供核苷酸聚合作用的起始点，特异的结合在核苷酸链上与之互补的区域，有效的得到目的序列；不同引物浓度进行PCR扩增，其扩增结果不一致，当引物浓度高于0.25μΜ时，就会出现弥散背景，并且有些扩增带发生减弱或消失。本发明经过多次试验确定引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2Fl/MAT2Rl(0.2yM)各I yL为宜。
[0020]所述PCR扩增程序为:93-96°C预变性l-3min; 93-96°C变性20_60s，45°C_60°C退火45s-90s，70?75°C 延伸30-60s，30-40个循环；最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0021 ]本发明中的优化方案为所述PCR扩增反应程序为:95° C预变性2min; 95° C变性35s，56° C退火Imin，72° C延伸40s，35个循环;最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0022]95° C预变性2min:预变性是为了打开模板DNA的二级结构，DNA双链充分打开后，在第一次退火过程中引物可以尽多的结合到靶序列上;温度不同，预变性时间不同，本发明中95° C预变性2min是适宜稻曲菌DNA预变性条件。
[0023]95°C变性35s:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响，此步若不能使靶基因模板完全变性，就会导致PCR失败;本发明经过多次试验确定95° C变性35s是最佳。
[0024]56° C退火Imin:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，变性后温度快速冷却至45°C_60°C，可使引物和模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于本试验引物23-24个核苷酸，G+C含量约45%-52%，56° C退火Imin可以使引物与模板完全结合。
[0025]72。(:延伸408:?0?反应的延伸温度一般选择在70?75°(:之间，常用温度为72°(:，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，是根据待扩增片段的长度而定，本发明72° C延伸40s就能保证靶序列合成。
[0026]35个循环:循环次数决定PCR扩增产物的数量，但循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。本发明中35个循环既保证靶序列的量，又避免了非特异性产物的扩增。
[0027]本发明的突出优点在于:
(1)本发明选用特异引物进行PCR扩增，能针对性的检测出稻曲菌交配型基因单一的目的片段，具有很高的特异性和灵敏度，不会检测出其它一些基因，同时受菌株本身污染干扰小，准确率高；
(2)本发明具有操作简单、快速，大大提高了检测效率、缩短了一半检测时间、降低了检测成本，同时能根据扩增交配型基因核苷酸序列有无快速的鉴定稻曲菌有性生殖类型。
[0028](3)本发明灵敏度高、特异性强，引物的设计解决了反应过程中引物二聚体的形成，以及引物与模板的错配问题，避免了外源DNA污染导致假阳性。
[0029]
【附图说明】
[0030]图1是本发明的实施例的凝胶电泳结果图。
[0031](其中，M为Trans2KDNA marker，1-17号为多重PCR扩增16株稻曲菌交配型基因结果:1.阴性对照；
2.Uvcdl,3.Uvcd2,4.Uvcd6,5.Uvcd8,6.Uvql2,7.Uvql3,8.Uvql5,9.Uvql6,10.Uvyal；11.Uvya2,12.Uvya3,13.Uvya5,14.Uvnc2,15.Uvnc3,16.Uvnc5,17.Uvnc6)
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0033]实施例1
稻曲菌分离培养:在稻曲病发病高峰期，从四川各地收集稻曲球样本，室内保备用;采用稻曲球厚垣孢子悬浮液分离方法分离稻曲菌，把分离纯化得到的稻曲菌菌株接种到马铃薯蔗糖琼脂糖(PSA)固体培养基上，28° C培养14d左右;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于28° C震荡培养7d左右，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-70。C保存备用;稻曲菌为常见菌种。
[0034]其次提取稻曲菌基因组DNA保存备用:采用液氮研磨菌丝体，应用CTAB法提取各菌株DNA，得到的样品-20° C保存备用。
[0035]实施例2
其它内容如实施例1，其中25°C培养16d左右;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于23° C震荡培养8d左右，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-75° C保存备用；
其次提取稻曲菌基因组DNA保存备用:采用液氮研磨菌丝体，应用CTAB法提取各菌株DNA，得到的样品-22° C保存备用。
[0036]实施例3
其它内容如实施例1，其中30°C培养12d左右;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于30° C震荡培养5d左右，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-65° C保存备用；
其次提取稻曲菌基因组DNA保存备用:采用液氮研磨菌丝体，应用CTAB法提取各菌株DNA，得到的样品-18° C保存备用。
[0037]实施例4
然后进行PCR扩增反应:以稻曲菌DNA为模版，在PCR反应体系中加入两对特异引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1进行扩增反应，质量浓度比例为1:1，该两对特异引物的序列分别为:
特异引物MAT1F1:5’-CTT TGA GGT TGA GTT TCG TTC AGC-3，，
特异引物MATlRl:5’-CAT TTG AAA CCG ATA GAA GCG GG-3，，
特异引物MAT2F1:5’-CCT CGC TGT ATT ATG GCA GTT TCT-3，，
特异引物MAT2R1:5’-CCC CAC AAA AAG ACC GTC CCG GA-3’。
[0038]引物是根据稻曲菌交配型基因核心序列(编码alpha-box和HMG结构域)并应用Primer Premier 5.0软件进行设计，由北京华大基因公司合成并提供。
[0039]PCR 反应体系为:基因组DNA 2yL，10XPCR buffer(含 Mg2+)lyL，dNTP(2.5mM) 5μL，特异引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1 各I yL，Taq聚合酶(5U/yL)0.5yL，无菌dd H2037.5yL，反应终体积为50UL; (PCR)
PCR扩增程序为:95° C预变性2min ； 95° C变性35s，56° C退火Imin，72° C延伸40s，35个循环;最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0040]最后进行凝胶电泳检测，5yL PCR产物与IyLlO XPCR loading buffer混合，在加Goldview染色的3%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后进行紫外检测仪检测电泳，拍照得到图1o
[0041 ] 实施例5
其它内容如实施例4中的内容，其中基因组DNA的质量浓度为10pM，dNTP 5仙的质量浓度为2.5mM，Taq聚合酶质量浓度为5U/UL，特异引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1质量浓度为0.ΙμΜ。
[0042]PCR扩增程序为:93° C预变性Imin; 93-96° C变性20s，45°C °C退火45ss，70°C延伸30s，30个循环;最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0043]实施例6
其它内容如实施例4中的内容，其中基因组DNA的质量浓度为10pM，dNTP 5仙的质量浓度为2.5mM，Taq聚合酶质量浓度为5U/UL。特异引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1质量浓度为 0.25μΜ。
[0044]PCR扩增程序为:96°(:预变性311^11; 96°C变性60s，60°C退火90s，75°C延伸60s，40个循环;最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0045]实施例7
其它内容如实施例4中的内容，其中基因组DNA的质量浓度为10pM，dNTP 5仙的质量浓度为2.5mM，Taq聚合酶质量浓度为5U/UL，特异引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1质量浓度为0.2μΜ。
[0046]PCR扩增程序为:95° C预变性2min; 94° C变性40s，55°C退火60s，73°C 延伸40s，38个循环;最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0047]实施例8
本实施例中，以清水作为阴性对照，同样进行凝胶电泳检测，标记为I。
根据图1中目的片段MATl-1为256 bp和MAT1-2为220 bp的有无判断检测结果，结果显示:样品 2- Uvcd1、3-Uvcd2、4-Uvcd6、5-Uvcd8、6-Uvql 2、7-Uvql3、8-Uvql 5、9-Uvql6、10_Uvyal、11-Uvya2、12_Uvya3、13_Uvya5、14_Uvnc2、15_Uvnc3、16_Uvnc5、17- Uvnc6都检测出交配型基因MATl-1和MAT1-2，结果说明这些菌株同时拥有这两种基因，因此推断稻曲菌为同宗配合的真菌。
[0048]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)稻曲菌分离培养: 在稻曲病发病高峰期，收集稻曲球样本，分离培养； (2)提取稻曲菌基因组DNA保存备用:采用液氮研磨菌丝体，应用CTAB法提取各菌株DNA，得到的样品-22—18° C保存备用； (3)PCR扩增反应:以稻曲菌DNA为模版，在PCR反应体系中加入两对特异引物MATlFl/MAT1RUMAT2F1/MAT2R1进行扩增反应，质量浓度比为1:1，该两对特异引物的序列分别为: 特异引物MAT1F1:5’-CTT TGA GGT TGA GTT TCG TTC AGC-3，， 特异引物MATlRl:5’-CAT TTG AAA CCG ATA GAA GCG GG-3，， 特异引物MAT2F1:5’-CCT CGC TGT ATT ATG GCA GTT TCT-3，， 特异引物MAT2R1:5’-CCC CAC AAA AAG ACC GTC CCG GA_3，; (4)凝胶电泳检测； PCR产物与1 X PCR上样缓冲液混合，在加核酸燃料染色的3%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后用紫外检测仪检测，如果扩增到两条核苷酸序列，则稻曲菌有性生殖为同宗配合，如果扩增到一条序列，则稻曲菌有性生殖为异宗配合。2.根据权利要求1所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述采用稻曲球厚垣孢子悬浮液分离方法分离稻曲菌，稻曲菌菌株接种到PSA固体培养基上，25-30° C培养12-16天;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于23-30° C震荡培养5-8天，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-75—65° C保存备用。3.根据权利要求2所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述采用稻曲球厚垣孢子悬浮液分离方法分离稻曲菌，稻曲菌菌株接种到PSA固体培养基上，28° C培养14天;挑取稻曲菌菌丝块于PS液体培养基中，置于28° C震荡培养7天，过滤收集菌丝于50mlEP管中，-70° C保存备用。4.根据权利要求1所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述PCR反应体系为:基因组DNA 2口1^，含]\%2+的10\?0? buffer IpL, dNTP 5yL，特异引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1 各I yL，Taq聚合酶 0.5pL,无菌dd H20 37.5yL，反应终体积为50yL。5.根据权利要求4所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述基因组DNA的质量浓度为10 pM,dNTP 的质量浓度为2.5mM，Taq聚合酶质量浓度为 5U/yL。6.根据权利要求4或5所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述特异引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1质量浓度为0.1-0.25μΜ。7.根据权利要求6所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述特异引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1质量浓度为0.2μΜ。8.根据权利要求1所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述PCR扩增程序为:93-96° C预变性l-3min ； 93-96° C变性20_60s，45 V-60 V退火45s-90s，70?75°C 延伸30-60s，30-40个循环；最后72° C延伸8min，4° C保存。9.根据权利要求8所述的一种多重PCR快速检测稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述PCR扩增反应程序为:95° C预变性2min; 95° C变性35s，56° C退火Imin，72° C延伸 40s，35个循环;最后72° C延伸8min，4° C保存。
【文档编号】C12Q1/68GK106048046SQ201610552647
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】伏荣桃, 卢代华, 王剑, 龚学书, 陈诚, 郑爱萍, 林乾
【申请人】四川省农业科学院植物保护研究所