用于检测转基因大豆gts 40?3?2的lamp引物组及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测转基因大豆GTS 40?3?2的LAMP引物组及检测方法；是通过提取待检大豆品种的DNA，利用设计的四条特异性LAMP引物对模板DNA进行扩增，2％琼脂糖凝胶电泳检测，利用是否出现带状电泳条带可确定待检大豆是否为转基因大豆GTS40?3?2。本发明检测限为每体系模板DNA量为0.001ng。本发明具有简便快捷、特异性高、灵敏度高等优点，为检测转基因大豆GTS 40?3?2提供了新的LAMP检测引物组。
【专利说明】
用于检测转基因大豆GTS 40-3-2的LAMP引物组及检测方法
技术领域
[0001 ] 本发明设及农业和植物检疫技术领域，具体设及转基因大豆Roundup Ready(GTS 40-3-2)的LAMP检测引物组及检测方法。
【背景技术】
[0002] 大豆是世界上重要的油料作物之一，2015年，大豆油约占中国植物油原料的44%， 我国大豆每年的需求量大约为8500万吨。然而，我国大豆生产难W满足国内需求，自1996年 W来，我国开始大量进口大豆，2014年大豆进口量达到7300万吨，约占世界大豆产量的 20%。目前，我国进口的大豆主要来自美国、阿根廷和己西，其中，2014年从美国进口大豆量 约占进口总量的42%。而美国是转基因大豆种植大国，美国的转基因大豆主要是孟山都公 司生产的抗草甘麟转基因大豆（Roundup Ready)。其中，GTS 40-3-2是将Agrobacterium tumefaciens strain CP4中分离出的抗草甘麟的5-締醇式丙酬莽草酸-3-憐酸合酶 化PSPS)基因转入商业大豆品种"A540沪中而育成。
[0003] 转基因作物的发展引起全世界对人类健康及环境安全的深切担忧，因此，科学的 对转基因作物进行有效监控，建立有效的检测方法，对于消除民众忧虑，促进国家间正常商 业贸易具有重要的意义。目前，世界上许多国家纷纷出台了严格的管理法规，对转基因食品 进行严格管理。比如，欧盟规定食品中基因修饰物质的含量超过1%就必须标示。我国政府 规定，凡是列入标示管理目录并用于销售的农业转基因作物都应当标示。
[0004] 目前，转基因检测的方法主要是基于目标蛋白的检测和基于目的核酸的检测。其 中，W蛋白为目标的检测方法主要是ELISA检测和胶体金快速检测试纸条法，运两种方法价 格昂贵，在日常检测中难W普及。基于核酸的检测方法主要是核酸分子杂交技术和PCR技 术。目前，国内外广泛使用的是定做CR和实时定量PCR检测方法。然而，PCR方法反应体系和 操作过程复杂，需要专业人±。另外，PCR扩增时间为1.5-2小时，所需PCR仪价格在5-10万元 左右。因此，寻找一种快速、简便、容易操作且准确的转基因作物检测方法势在必行。
[0005] 环介导等溫扩增技术(Xoop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是日本 荣研化学朱式会社2000年前后开发出的基因扩增技术，具有快速简便、不需要大型仪器、操 作方便等优点。目前，已利用GTS 40-3-2插入序列与大豆内源基因边界序列、CaMV35S序列、 GTS40-3-2外源基因插入序列等开发了转基因大豆GTS 40-3-2的系列LAMP检测方法。
[0006] 本发明利用转基因大豆GTS 40-3-2的5'-junction插入序列（GenBank accession number:AJ308514.1)设计了新的LAMP引物，可用于转基因大豆GTS 40-3-2的快速检测。本 发明对于准确快速的检测转基因大豆GTS 40-3-2具有重要的潜在应用价值。
【发明内容】
[0007] 为转基因大豆GTS 40-3-2检测提供新的解决方案，本发明提供了一种转基因大豆 GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，目的在于提供一种快速、准确、灵敏的GTS40-3-2的LAMP快 速检测方法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0009] 一种转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，包括如下步骤：
[0010] a)设计引物，引物序列为：
[00111
[0012] b)大豆基因组的提取:利用Cwbiotech DNA提取试剂盒提取大豆基因组。紫外分光 光度计化no化op 2000检测DNA提取质量和浓度，选取0D260/0D280检测值为1.7-1.9的DNA 样品用于LAMP扩增，-20°C保存备用。
[0013] C化AMP扩增:对步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应溫度梯度 为6rC、63°C和65°C;总体系25化：其中引物FIP(SEQ ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F3(SEQ ID N0:1)，B3(SEQ ID N0:2)比例为0.祉M:0.祉或0.6咖:0.6咖:0.1咖:0.化 M;4mM MgS〇4,1.6mM dNTPs,0.8M betaine(Si卵a-Al化ich,Tokyo,Japan),l]iL Bst DNA polymerase(化w England Biolabs,Beijing,Qiina);扩增反应时间为40min或60min。
[0014] d)分析:对步骤c)得到的扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。2%琼脂糖凝胶电泳 出带状条带的为含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品，空白的为不含有转基因大豆GTS 40- 3-2的样品。
[0015] 作为优选，步骤C)中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F3(沈Q ID NO: 1)，B3(SEQ ID 顯：2)比例为0.祉]?:0.祉]\1:0.化]\1:0.化]\1，扩增反应时间为40111111或60111111， LAMP扩增反应溫度为6rC或63 °C。
[0016] 作为优选，步骤c)中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F3(沈Q ID NO: 1)，B3(沈Q ID NO: 2)比例为0.祉M: 0.祉M: 0. liiM: 0. lyM，扩增反应时间为40min，LAMP扩增 反应溫度为ere。
[0017] 本发明的有益效果是：
[001引本发明利用GenBank公布的转基因大豆GTS 40-3-2的5 '-junction插入序列 (GenBank accession numbe;r:AJ308514.1)基因序列设计LAMPQoop-mediated isothermal amplification)引物，建立了转基因大豆GTS 40-3-2的LAMP检测体系，并对反 应条件进行了优化。LAMP在引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(沈Q ID N0:4)，F3(SEQ ID N0:1)， B3(沈Q ID ^:2)比例为0.祉]?:0.祉]\1:0.1咖:0.1測的25化体系下，61°(：反应40111111为最佳 反应条件。结果表明，建立的LAMP检测体系简单、快速、灵敏度好、特异性高，在转基因大豆 GTS 40-3-2的LAMP检测方面潜力巨大。
【附图说明】
[0019] 图1 lamp引物扩增GTS 40-3-2的2%琼脂糖电泳图；
[0020] 图中:M为marker，1，2泳带为模板DNA为GTS 40-3-2; 3，4泳带为模板加水对照。
[0021] 图1说明：1，2泳带出现带状条带，表明设计的LAMP引物及扩增体系可w扩增出GTS 40-3-2的特异条带;3，4泳带未出现条带，表明反应体系未受到DM污染。
[0022] 图2为特异性检测图；
[0023] 图2中：M，marker;l-12泳带分别代表模板DNA来自转基因大豆（GTS 40-3-2， M0N87701，CV127,356043，M0N89788,305423)及小麦、大豆、玉米、油菜、水稻和空白（水)对 照；
[0024] 图2说明：1泳带出现带状条带，表明检测到转基因大豆GTS 40-3-2; 2-11泳带出现 空白，表明未检测到转基因大豆GTS 40-3-2,说明设计的引物对转基因大豆GTS 40-3-2具 有特异性;12泳带出现空白，表明反应体系未受到DNA污染。
[0025] 图3为灵敏性检测图；
[0026] 图3中M为marker, 1-9泳带分别代表每个体系（2化L)内DNA模板基因组量分别为 60,40,10,1,0.1,0.01,0.005,0.001和O.OOOlng;
[0027] 图3说明：1-8泳带均出现带状泳带，表明模板DM为0.001-60ng时该体系可检测到 转基因大豆GTS 40-3-2;9泳带空白，表明模板DNA为O.OOOlng时不能检测到GTS 40-3-2。因 此，该体系检测下限为O.OOlng/25化。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过具体实施案例，对本发明的技术方案做进一步的具体说明。应当理解，本 发明的实施例并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都 将落入本发明保护范围。
[0029] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0030] LAMP法Bst DNA polymerase由化W Elngland Biolabs公司提供，大豆基因组DNA使 用Cwbiotech DNA提取试剂盒提取，琼脂糖Agarose H(上海生工），Betaine由Sigma- A1化ich公司提供。
[0031 ] 利用GenBank公布的转基因大豆GTS 40-3-2的5 ' -junction插入序列（GenBank accession number :AJ308514.1)基因序列设计LAMP( loop-mediated isothermal amplification)引物。
[0032] 实施例1
[0033] 转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，包括如下步骤：
[0034] a)设计引物，引物序列为：
[0035]
[0036] b)大豆基因组的提取:称取2-3g大豆种子，研磨，利用Cwbiotech DNA提取试剂盒 提取大豆基因组。紫外分光光度计化nodrop 2000检测DNA提取质量和浓度，选取0D260/ 0D280检测值为1.7-1.9的DM样品用于LAMP扩增，-20°C保存备用。
[0037] C化AMP扩增:对步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应溫度梯度 为61°C;总体系25化:其中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F3(SEQ ID N0:1)， 63(569 10騰：2)比例为0.如]?:0.如]\1:0.化]\1:0.1础，4111]\11邑504，1.6111]\1(1^?3,0.81 betaine(Sigma-Aldrich,Tokyo,Japan),luL Bst DNA polymerase(New England Biolabs，Beijing, China);设置 LAMP 扩增反应时间为 40min。
[0038] d)分析:对步骤c)得到的扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。2%琼脂糖凝胶电泳 出带状条带的为含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品，空白的为不含有转基因大豆GTS 40- 3-2的样品。
[0039] 实施例2
[0040] 转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，包括如下步骤：
[0041] a)设计引物，引物序列为：
[0042]
[0044] b)大豆基因组的提取:称取2-3g大豆种子，研磨，利用Cwbiotech DNA提取试剂盒 提取大豆基因组。紫外分光光度计化nodrop 2000检测DNA提取质量和浓度，选取0D260/ 0D280检测值为1.7-1.9的DNA样品用于LAMP扩增，-20°C保存备用。
[0045] C化AMP扩增:对步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应溫度梯度 为63°C;总体系25化：其中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F3(SEQ ID N0:1)， 63(569 10騰：2)比例为0.64]?:0.64]\1:0.化]\1:0.1础，4111]\11邑504，1.6111]\1(1^?3,0.81 betaine(Sigma-Aldrich,Tokyo,Japan),luL Bst DNA polymerase(New England Biolabs，Beijing, China);设置 LAMP 扩增反应时间为 40min。
[0046] d)分析:对步骤c)得到的扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。2%琼脂糖凝胶电泳 出带状条带的为含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品，空白的为不含有转基因大豆GTS 40- 3-2的样品。
[0047] 实施例3
[004引转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，包括如下步骤：
[00例 a)设计引物，引物序列为：
[(K)加 ]
[0051 ] b)大豆基因组的提取:称取2-3g大豆种子，研磨，利用Cwbiotech DM提取试剂盒 提取大豆基因组。紫外分光光度计化nodrop 2000检测DNA提取质量和浓度，选取0D260/ 0D280检测值为1.7-1.9的DNA样品用于LAMP扩增，-20°C保存备用。
[0052] C化AMP扩增:对步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应溫度梯度 为65°C;总体系25化：其中引物FIP(沈Q ID N0:3)，BIP(SEQ ID N0:4)，F3(SEQ ID N0:1)， 63(569 10騰：2)比例为0.如]?:0.如]\1:0.化]\1:0.1础，4111]\11邑504，1.61111(1^口3,0.81 betaine (Sigma-Aldrich, Tokyo , Japan),lyL Bst DNA polymerase(New England Biolabs，Beijing, China);设置 LAMP 扩增反应时间为 60min。
[0053] d)分析:对步骤c)得到的扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。2%琼脂糖凝胶电泳 出带状条带的为含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品，空白的为不含有转基因大豆GTS 40- 3-2的样品。
[0化4]灵敏性检测:将利用本发明步骤b)得到的转基因大豆GTS 40-3-2基因组DNA稀释， W保证每个体系（2扣L)内DNA模板基因组量分别为60，40，10，1，0.1，0.01，0.005，0.001和 O.OOOlng，验证LAMP优化体系针对转基因大豆GTS 40-3-2的检测效果。LAMP结果如图3所 示:LAMP检测体系灵敏度对转基因大豆GTS 40-3-2能够达到0.0 Olng/体系。
[0055] 特异性检测：利用DNA提取试剂盒(Cwbiotech)提取大豆基因组。紫外分光光度计 Nano化op 2000检测DNA提取质量和浓度，按照DNA模板浓度20ng/体系进行LAMP和PCR扩增， 验证LAMP优化体系的特异性。从电泳图1可W看出，含有转基因大豆GTS 40-3-2的扩增样液 能跑出清晰的梯度性LAMP条带，并且，根据条带可W明显区分转基因大豆GTS 40-3-2(图2) 和非转基因大豆及其他作物。结果表明，本发明建立的针对转基因大豆GTS 40-3-2的LAMP 检测方法特异性强。
[0化6]本文发明中使用的转基因大豆(GTS 40-3-2，M0N87701，CV127,356043，M0N89788， 305423)及小麦、大豆、玉米、油菜、水稻等材料均为中国农业大学黄昆仑教授实验室提供。
【主权项】
1. 一种转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，其特征在于步骤如下： a) 设计引物，引物序列为：b) 大豆基因组的提取:利用Cwbiotech DNA提取试剂盒提取大豆基因组；紫外分光光度 计Nanodrop 2000检测DNA提取质量和浓度，选取0D260/0D280检测值为1.7-1.9的DNA样品 用于LAMP扩增，-20 °C保存备用； c) LAMP扩增:对步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为61 °(：、63°(：和65°(： ;总体系25此:其中引物卩1?，8^3,83的比例为0.8處:0.8處:0.1處:0.1虚 或0.6iiM:0.6iiM: 0.1祕：0. lyM;4mM MgS〇4，1.6mM dNTPs，0.8M betaine，lyL Bst DNA polymerase;扩增反应时间为40min或60min; d) 分析:对步骤c)得到的扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳;2%琼脂糖凝胶电泳出带 状条带的为含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品，空白的为不含有转基因大豆GTS 40-3-2的 样品。2. 如权利要求1所述的一种转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，其特征在于所 述步骤(：）中引物？1?，8^3,83的比例为0.8_:0.8福:0.1福:0.1福，扩增反应时间为 40min或60min，LAMP扩增反应温度为61°C或63°C。3. 如权利要求1所述的一种转基因大豆GTS40-3-2的LAMP快速检测方法，其特征在于所 述步骤(：）中引物？1?，8^3,83的比例为0.8_:0.8福:0.1福:0.1福，扩增反应时间为 40min，LAMP扩增反应温度为61°C。
【文档编号】C12Q1/68GK106048049SQ201610566417
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】张小村, 许文涛, 黄昆仑
【申请人】山东农业大学