用于检测牛源性成分的lamp引物及其设计方法
【专利摘要】用于检测牛源性成分的LAMP引物及其设计方法，涉及牛源性成分的检测。所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，包括以下步骤：步骤1，登陆NCBI网站，查找猪、羊、牛等动物的线粒体基因序列；步骤2，用DNAman软件对各种动物的线粒体基因序列进行比对，找出牛特异性序列；步骤3，设计引物，引物的设计原则包括Tm值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离、二级结构；步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点,只需不到10分钟，就可检测出牛源性成分。
【专利说明】
用于检测牛源性成分的LAMP引物及其设计方法
技术领域
[0001]本发明涉及牛源性成分的检测，具体是涉及一种用于检测牛源性成分的LAMP引物及其设计方法。
【背景技术】
[0002]目前，据国内的平面媒体和网络媒体等新闻报道，认为国内某些动物源性产品存在严重的肉类掺假问题，报道中描述的可能存在的掺假有，猪、鸡、鸭肉以及皮毛类的狐狸、水貂、海狸鼠、貉等肉充当牛羊肉，仍至还有鼠肉充当羊肉的报道。这些报道在国内外造成了强烈的社会影响，对我国动物源性产品的生产、加工和销售产生了严重的挑战，让各类消费者和相关产品的使用者对动物源性产品的使用和消费产生了一定的困惑。尽管国外的食品生产有较严格的可追溯程序(即每份产品中的所有成分都可以追溯来自某个养殖场出产，所有中间环节产品处理也可以追溯相关的供应商)，国外也有类似的肉类掺假报道，2012年12月在欧洲报道出马肉充当牛肉的丑闻，2013年I月在一项针对英国和爱尔兰国内的汉堡包内肉类进行DNA检测，发现27个声称是牛肉汉堡包内检测出23个样品有猪肉的DNA。肉类掺假的问题是动物源性产品检测中的一大难题，同时这个问题又是国家检测部门必须解决的重要课题。
[0003]人为财死鸟为食亡，有些不法商贩为了获取巨大的经济利益，以次充好，以经济价值低的充当价值高的，以病死动物肉充当健康肉，以鼠肉等极易传播疫病的动物肉类充当其他动物肉，等等。市场上的牛肉制品，价格高昂，是纯牛肉的却甚少，经常出现掺杂猪肉等便宜的肉类。
[0004]近年检测动物源性掺假的技术主要是针对动物特异性核酸或蛋白，有蛋白印迹、ELISA、核酸探针、PCR和荧光PCR等，目前使用最为广泛的是PCR和荧光PCR JCR方法由于其具有较高的灵敏度而能够在动物源性成分检测中得到广泛的应用。但在实际运用中，还是存在一些难以难以克服的问题，如假阴性、假阳性、非特异性扩增以及片状拖带、涂抹带等等。
[0005]环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplificat1n，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60?65°Ctil温扩增，15?60min左右即可实现19?110倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
[0006]Genie II等温扩增荧光检测系统是开放的检测平台，应用“等温扩增技术”原理，结合荧光检测技术，可用于各类等温扩增反应在分子水平基础上进行快速检测工作。
[0007]牛源性成分检测常用PCR和荧光定量PCR方法，常规PCR方法需要2h左右的PCR反应时间，30min左右的电泳时间以及配置凝胶和染色的时间；荧光定量PCR方法，大概需要Ih左右的时间，且荧光探针和仪器都较昂贵。
[0008]中国专利CN102994637A公开一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法。该方法包括一对牛特异性引物，上游引物为:5，-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3，;下游引物为:5 ’ -GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-S’；及与其配合使用的探针 5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3 ’，以及包含所述弓I物和探针的试剂盒。
[0009]中国专利CN105274246A公开了一种牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒，包括SEQ ID N0.2&3所示的特异性引物、反应试剂以及阳性和空白对照。此外还包括猪、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4?21所示。采用引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品中是否含有牛源性成分，以及是否掺有猪、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭等其他动物成分。
【发明内容】
[0010]为了解决快速检测进出口及市场上的牛源性成分、动物源性成分饲料中的牛源性成分，本发明提供一种用于检测牛源性成分的LAMP引物及其设计方法，该LAMP引物组合在具有简单、灵敏、快速、特异的优点。
[0011]所述用于检测牛源性成分的LAMP引物，具体引物序列如下:
[0012]cowF3:tatcggagta atccttctgc t
[0013]cowB3:ggaataatag gtggactatg gc
[0014]cowFIP:ttggtgatga ctgttgctcc tccacagtaa tagccacagc at
[0015]cowBIP:agcaatccca tacatcggca cgtaagggtt gctttgtcta ct
[0016]cowLoopF:cctcatggta ggacgtatcc ta
[0017]cowLoopB:atgaatctga ggcggattct c
[0018]所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，包括以下步骤:
[0019]步骤I，登陆NCBI网站，查找猪、羊、牛等动物的线粒体基因序列；
[0020]步骤2，用DNAman软件对各种动物的线粒体基因序列进行比对，找出牛特异性序列；
[0021]步骤3，设计引物，引物的设计原则包括Tm值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离、二级结构；
[0022]步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。
[0023]在步骤2中，所述用DNAman软件对各种动物的线粒体基因序列进行比对，选择CytB基因作为牛源性成分的检测基因。
[0024]在步骤3中，所述设计引物的软件可采用Primer Explorer V3，设计引物最好筛选最优的引物组合；各条引物的具体参数如下:Flc/Blc，64?66°C;F2/B2/F3/B3LoopF/LoopB，59?61°C ;所述引物Fl c和BI c比其余几条引物的Tm值高5 °C左右；
[0025]所述引物末端的安定性:引物Flc/Blc的5‘端的AG值<-4Kcal/mol，引物F2/B2/F3/B3LoopF/LoopB的3’端的AG值<_4Kcal/mol，引物末端不能含有互补序列，如cccggg或gaattc ；也不能含有相同的核苷酸，如ccgggg或aatttt ；
[0026]所述GC含量的设定范围在40%?65%之间；
[0027]所述引物之间的距离:从F2 5‘端到B2 5‘端在120?180bp之间，从F2的5’端到Flc的3‘端在40-60bp之间，从F2的5 ’端到F3的3‘端在O?20bp之间；
[0028]关于二级结构，引物自身不能形成二级结构。
[0029]在步骤4中，所述优化引物工作浓度为:FIP、BIP、F3、B3分别为3.2?12.8μΜ、3.2?12.8μΜ、0.8?3.2μΜ、0.8?3.2μΜ;所述内外引物浓度比为4: I ；所述反应温度为65°C ； 25yL反应体系如下:IMM试齐lJ15yL，20yM FIP 2μ?、20μΜ BIP 2μ?、10μΜ F3 1μ?、10μΜ Β3 lyL，模板lyL，补水至25yL;反应条件如下:扩增65°C，30min;退火从98°C到80°C，0.05°C/s。
[0030]本发明检测时间只需30min，且试验中途即可观察结果、判定结果，不需要配置凝胶、电泳、染色等过程，极大缩短了检测时间，且有与荧光定量PCR类似的曲线、判定原则和标准，具有快速、特异、敏感、节约费用等优点，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。这对于加强产品牛源性成分快速检验检疫、整顿制售掺假产品、维护消费者权益、打击违法牟取暴利等方面都具有十分重要的意义。
[0031]本发明的有益效果如下:
[0032]采用本发明建立的检测牛源性成分的LAMP方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点，只需不到10分钟，就可检测出牛源性成分。本发明的成功研制，大大加快了牛源性成分的检测。
[0033]采用本发明的检测牛源性成分的LAMP技术，具有简单、灵敏、快速、特异等优点，能大大方便口岸进出口货物的通关速度。这对于预防和控制我国动物源性成分掺假、添加牛源性成分的饲料具有重要的现实意义。本发明的引物在Genie II操作平台上进行应用。
【附图说明】
[0034]图1为LAMP技术检测牛源性成分的反应体系优化结果I。在图1中，1.FIP/BIP与F3/B3的浓度比 1:1; 2.FIP/BIP与F3/B3的浓度比2:1; 3.FIP/BIP与F3/B3的浓度比3:1; 4.FIP/BIP与F3/B3的浓度比4:1; 5.FIP/BIP与F3/B3的浓度比5:1; 6.FIP/BIP与F3/B3的浓度比6:l-J.FIP/BIP 与 F3/B3 的浓度比 7:1。
[0035]图2为LAMP技术检测牛源性成分的反应体系优化结果2。在图2中，1.FIP、BIP、F3、83的工作浓度分别为0.4口]?、0.44]\1、0.14]\1、0.14]\1;2上1?、81?、？3、83的工作浓度分别为0.841、0.8“]?、0.24]\1、0.24]\1;3丨1?、81?、卩3、83的工作浓度分别为1.64]\1、1.64]\1、0.44]\1、0.44]\1;4上1?、81?小3、83的工作浓度分别为3.2口]?、3.24]\1、0.84]\1、0.84]\1;5上1?、81?、？3、83的工作浓度分别为6.44]?、6.44]\1、1.64]\1、1.64]\1;6丨1?』1?小3、83的工作浓度分别为12.84]\1、12.84Μ、3.2μΜ、3.2μΜ。
[0036]图3为LAMP技术检测牛源性成分的LoopF、LoopB的优化结果。在图3中，l.LoopF、LoopB的工作浓度均为0.6μΜ; 2.LoopF、LoopB的工作浓度均为0.4μΜ; 3.LoopF、LoopB的工作浓度均为0.2μΜ; 4.LoopF、LoopB的工作浓度均为O; 5 ?空白对照。
[0037]图4为LAMP技术检测牛源性成分的反应条件优化结果。在图4中，1:扩增温度59°C;2:为扩增温度60 °C；3:扩增温度61°C；4:扩增温度62 °C ； 5:扩增温度63 °C；6:扩增温度64 V ；7:扩增温度65 °C ； 8:扩增温度66 0C。
[0038]图5为LAMP技术检测牛源性成分的敏感性试验结果。在图5中，1:牛源性成分核酸浓度5.408mg/mL ； 2:牛源性成分核酸浓度5.408 X 10—Vg/mL ； 3:牛源性成分核酸浓度5.408X 10—Vg/mL ； 4:牛源性成分核酸浓度5.408 X 10—3mg/mL ； 5:牛源性成分核酸浓度5.408X10
—4mg/mLο
[0039]图6为LAMP技术检测牛源性成分的特异性试验结果I。在图6中，1:牛源性成分核酸;2:猪源性成分核酸;3:山羊核酸;4:绵羊核酸;5:鼠核酸;6:马核酸;7:狐狸核酸;8:空白对照。
[0040]图7为LAMP技术检测牛源性成分的特异性试验结果2。在图7中，9:牛源性成分核酸;10:驴核酸;11:狗核酸;12:鸭核酸;13:鸡核酸;14:兔核酸;15:空白对照。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述，但附图和【具体实施方式】不应理解为是对本发明进行的限定。
[0042]下述实施例中所用的材料、试剂均可等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]组织DNA提取试剂盒:LabServ公司，产品编号KFR-802096。
[0044]等温扩增荧光检测系统:0ptiGene公司，Genie II系统。
[0045]IMM试剂:北京晟泰勃科技有限公司。
[0046]LAMP试验反应条件如无特殊说明，均为Genie II等温扩增荧光检测系统默认的反应条件:扩增65°(:，3011^11;退火从98°(:到80°(:，0.05°(:/8。
[0047]CowFIP:20μΜ
[0048]CowBIP:20μΜ
[0049]CowF3:10yM
[0050]CowB3:10yM[0051 ] CowLoopB:ΙΟμΜ
[0052]CowloopF:ΙΟμΜ
[0053]牛源性成分核酸浓度:1.352 X 103mg/mL
[0054]牛源性成分核酸、猪源性成分核酸、山羊核酸、绵羊核酸、鼠核酸、马核酸、狐狸核酸、驴核酸、狗核酸、鸭核酸、鸡核酸、兔核酸均为各自动物组织提取的核酸。
[0055]实施例1用于检测牛源性成分的LAMP方法的建立及内外引物浓度比的优化
[0056](I)取7个反应管中，每管反应体系25yL。各管分别加入頂M 15yL、F3 lyL、B3 lyL、IyL牛源性成分核酸，第I个反应管中加入FIP 0.5yL、BIP 0.5yL;第2个反应管中加入FIP IyL、BIP IyL;第3个反应管中加入FIP 1.5yL、BIP 1.5yL;第4个反应管中加入FIP 2yL、BIP2yL;第5个反应管中加入FIP 2.5yL、BIP 2.5yL;第6个反应管中加入FIP 3yL、BIP 3yL;第7个反应管中加入FIP 3.5yL、BIP 3.5yL。各管补充水至25yL。。
[0057](2)扩增65 °C，30min;退火从98 V 到80 °C，0.05 °C /s。
[0058](3)试验结果如图1所示，均能出现S型扩增曲线，第I至第7个反应的Tm值(mm: ss)分别为24:30、17:30、15:15、14:45、14:30、15:00、15:00，扩增曲线结合Tm值，最佳反应为第
4、5管，最佳内外引物$1?、81?为内引物，？3、83为外引物)工作浓度比为4:1或者5:1，在后续反应中均采用4:1的比例。
[0059]实施例2用于检测牛源性成分的LAMP方法引物工作浓度的优化
[0060](I)取6个反应管中，每管反应体系25yL。各管分别加入IMM 15yL、IyL牛源性成分核酸，第I个反应管中加入FIP 0.5yL、BIP 0.5yL、F3 0.25yL、B3 0.25yL;第2个反应管中加入FIP lyL、BIP lyL、F3 0.5yL、B3 0.5yL;第3个反应管中加入FIP 1.5yL、BIP 1.5yL、F30.75yL、B3 0.75yL;第4个反应管中加入FIP 2yL、BIP 2yL、F3 lyL、B3 IyL;第5个反应管中加入FIP 2.5yL、BIP 2.5yL、F3 1.25yL、B3 1.25yL;第6个反应管中加入FIP 3yL、BIP 3yL、F3 1.5yL、B3 1.5。反应体系不足25yL的用水补足。
[0061 ] (2)扩增 65°C，30min;退火从 98°C到 80°C，0.05°C/s。
[0062](3)试验结果如图2所示，均能出现S型扩增曲线，第I至第6个反应的Tm值(mm: ss)分别为 24:00、15:45、14:30、15:00、15:00、15:00，扩增曲线结合 Tm值，第3管较好，FIP、BIP、F3、B3 的工作浓度分别为 I.2μΜ、I.2μΜ、0.3μΜ、0.3μΜ。
[0063]实施例3用于检测牛源性成分的LAMP方法的LoopF、LoopB的优化结果
[0064](I)取4个反应管中，每管反应体系25yL。各管分别加入IMM 15yL、IyL牛源性成分核酸、FIP 1.5yL、BIP 1.5yL、F3 0.75yL、B3 0.75yL，第 I 个反应管中加入 LoopF 1.5yL、LoopB 1.5yL;第2个反应管中加入LoopF IyL,LoopB IyL;第3个反应管中加入LoopF 0.5μL、LoopB 0.5yL;第4个反应管中加入LoopF OyL、LoopB OyL;第5个反应管以水代替牛源性成分核酸作为空白对照，反应体系不足25yL的用水补足。
[0065](2)扩增65 cC，30min;退火从98 V 到80 Γ，0.05 Γ /s。
[0066](3)试验结果如图3所示，均能出现S型扩增曲线，第I至第4个反应的Tm值(mm: ss)分别为8:00、8:00、8:45、14:45。当加入1^0??、1^0?8后，大大加快了1^103反应速度，随着LoopF、LoopB浓度的增加，LAMP反应速度已达到平台期，不会再加快。结合扩增曲线和Tm值，最佳反应为第2管，L00pF、L00pB最佳反应浓度均为0.4μΜ。
[0067]实施例4用于检测牛源性成分的LAMP方法的反应条件优化结果
[0068](I)取8个反应管中，每管反应体系25yL。各管分别加入IMM 15yL、IyL牛源性成分核酸、FIP 1.5yL、BIP 1.5yL、F3 0.75yL、B3 0.75yL、LoopF lyL、LoopB lyL，补充水至25μL0
[0069](2)第I至第8管扩增温度分别为59 °C、60 °C、61°C、62 °C、63 °C、64°C、65°C、66 °C，时间 30min;退火从98 °C 到80 °C，0.05 °C /s。
[0070](3)试验结果如图4所示，均能出现S型扩增曲线，第I至第8个反应的Tm值(mm: ss)分别为11:15、9:30、9:00、8:15、7:45、7:30、7:15、7:15。扩增曲线结合1(?值综合判定，第7、8管的反应温度均优于其他反应温度，这2管的反应温度均可采用，LAMP常用的反应温度为65°C，因此选择65 °C为最佳反应温度。
[0071 ]实施例5LAMP技术检测牛源性成分的敏感性试验
[0072](I)取5个反应管中，每管反应体系25yL。各管分别加入MM 15yL、FIP 1.5yL、BIP1.5yL、F3 0.75yL、B3 0.75yL，第I至第6管加入的牛源性成分核酸终浓度分别为5.408mg/mL、5.408 X 10—Vg/mL、5.408 X 10—2mg/mL、5.408 X 10—3mg/mL、5.408 X 10—4mg/mL，补充水至25uLo
[0073](2)扩增 65°C，30min;退火从 98°C 到 80°C，0.05°C/s。
[0074](3)试验结果如图5所示，均能出现S型扩增曲线，第I至第3个管反应的Tm值(mm:ss)分别为15:45、19:45、23:30。第4、5管3011^11内无了(《值。1^?方法检测牛源性成分最低限量为 5.408X10—2mg/mL。
[0075]实施例6LAMP技术检测牛源性成分的特异性试验
[0076](I)取15个反应管中，每管反应体系25yL。各管分别加入IMM 15yL、FIP 1.5yL、BIP1.5yL、F3 0.75yL、B3 0.75yL，第I至15管分别加入牛源性成分核酸IyL;猪源性成分核酸1μL;山羊核酸IyL;绵羊核酸0.5yL ；鼠核酸IyL ；马核酸IyL ；狐狸核酸IyL ； H2O IyL ；牛源性成分核酸IyL ；驴核酸IyL;狗核酸IyL;鸭核酸IyL;鸡核酸IyL;兔核酸IyL; H2O IyL。各管补充水至25yL。
[0077](2)扩增65 cC，30min;退火从98 V 到80 Γ，0.05 Γ /s。
[0078](3)试验结果如图6、7所示，只有牛源性成分核酸出现S型扩增曲线，其余动物成分核酸均无扩增曲线。表明本试验具有特异性。
【主权项】
1.用于检测牛源性成分的LAMP引物，其特征在于其具体引物序列如下: cowF3:tatcggagta atccttctgc t cowB3:ggaataatag gtggactatg gc cowFIP:ttggtgatga ctgttgctcc tccacagtaa tagccacagc at cowBIP:agcaatccca tacatcggca cgtaagggtt gctttgtcta ct cowLoopF:cctcatggta ggacgtatcc ta cowLoopB:atgaatctga ggcggattct C02.如权利要求1所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤I，登陆NCBI网站，查找猪、羊、牛等动物的线粒体基因序列； 步骤2，用DNAman软件对各种动物的线粒体基因序列进行比对，找出牛特异性序列； 步骤3，设计引物，引物的设计原则包括Tm值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离、二级结构； 步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。3.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述用DNAman软件对各种动物的线粒体基因序列进行比对，选择cytB基因作为牛源性成分的检测基因。4.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤3中，所述设计引物的软件采用Primer Explorer V3。5.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤3中，所述设计引物筛选最优的引物组合;各条引物的具体参数如下:Flc/Blc，64?66°C ；F2/B2/F3/B3LoopF/LoopB，59?61°C ;所述引物Flc和BIc比其余几条引物的Tm值高5°C。6.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤3中，所述引物末端的安定性:引物Flc/Blc的5‘端的AG值彡-4Kcal/mol，引物F2/B2/F3/B3LoopF/LoopB的3 ’端的AG值<_4Kcal/mol，引物末端不能含有互补序列，如cccggg或gaattc ；也不能含有相同的核苷酸，如ccgggg或aatttt。7.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤3中，所述GC含量的设定范围在40%?65%之间。8.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤3中，所述引物之间的距离:从F2 5 ‘端到B2 5 ‘端在120?180bp之间，从F2的5 ’端到Flc的3‘端在40?60bp之间，从F2的5 ’端到F3的3‘端在O?20bp之间。9.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤4中，所述优化引物工作浓度为:FIP、BIP、F3、B3分别为3.2?12.8μΜ、3.2?12.8μΜ、0.8?3.24]?、0.8?3.24]\1;所述内外引物浓度比为4:1。10.如权利要求2所述用于检测牛源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于在步骤4中，所述反应温度为65°C;25yL反应体系如下:IMM试剂15μ?，20μΜ FIP 2μ?、20μΜ BIP2yL、ΙΟμΜ F3 Ιμ?αΟμΜ Β3 lyL，模板lyL，补水至25yL;反应条件如下:扩增65°C，30min;退火从98cC到80cC，0.05cC/s。
【文档编号】C12Q1/68GK106048062SQ201610652748
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610652748.9, CN 106048062 A, CN 106048062A, CN 201610652748, CN-A-106048062, CN106048062 A, CN106048062A, CN201610652748, CN201610652748.9
【发明人】徐淑菲, 孔繁德, 唐泰山, 苗丽, 张秀平
【申请人】厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心