双光子吸收化合物的制作方法
【专利摘要】本发明的课题在于提供一种双光子吸收化合物，所述双光子吸收化合物的水溶性优异，且可在近红外波长区域内吸收双光子而被激发从而发出红色荧光。式(1)表示的化合物的水溶性优异，且可在近红外波长区域内吸收双光子而被激发从而发出红色荧光。式(1)中，X1及X2表示下述式(2)，且可以相同或不同，Y表示环数为2～4的稠合多环基，式(2)中，R1表示C1～C3的烷基，Z?表示针对吡啶鎓阳离子的反阴离子，波浪线表示针对Y的共价键。X1?Y?X2 (1)
【专利说明】
双光子吸收化合物
技术领域
[0001] 本发明设及新型的双光子吸收化合物，更详细而言，设及水溶性优异、且可在近红 外波长区域内吸收双光子从而发出红色巧光的化合物。此外，设及含有该双光子吸收化合 物的巧光探针组合物、用于生物成像(bioimaging)的巧光探针组合物。
【背景技术】
[0002] 所谓双光子吸收，是指在将光作为光子考虑时，两个光子同时被吸收，而导致分子 的状态被激发而跃迁到高能级。双光子吸收为非线性现象，其发生概率相对于光强度的平 方成比例。因此，由于仅在光强度高时才能观测到光的吸收，所W在用透镜将光进行聚光的 情况下，能够仅在光强度高的焦点附近产生吸收。此外，即使是能量低的光也能够激发至高 的跃迁能量，因此，例如可通过用透镜将近红外光进行聚光而造成双光子现象，从而对不能 被近红外光激发的分子通过照射而使其成为激发状态。
[0003] 仅在焦点附近发生双光子吸收的特征例如可应用于生物成像(非专利文献1)。所 谓生物成像，是指在细胞?组织或个体水平把握蛋白质等的分布?局部存在、并将其动态 作为图像加 W分析的技术，是对处于病态时期的病理阐明、诊断等方面有用的手段。在生物 成像中，利用双光子吸收时，通过针对测定试样进行焦点位置扫描，能够获得=维图像。
[0004] 对于想要通过生物成像获得试样深部的图像而言，近红外附近的长波长区域的光 被认为是优选的，运是因为在可见光区域，试样内光的吸收及散射程度大、光的透过性差。 因此，利用长波长区域的光进行激发的双光子吸收适合于对试样的深部进行成像。
[0005] 对于利用双光子吸收的生物成像而言，例如，可举出通过W下方式获得图像的方 法:对测定对象的试样给予可吸收双光子的巧光物质，使祀标生物分子与巧光物质相互作 用，并向其照射将近红外光通过透镜聚光而得的光，检测巧光物质的发光。该方法已作为双 光子巧光生物成像而为人们所知。
[0006] 为了通过双光子巧光生物成像获得试样深部的图像，除了利用近红外光引起双光 子吸收外，对于产生的巧光，也期望其为近红外附近的发光，W能够透过试样内部。因此，期 望开发出通过近红外附近区域的光而效率良好地发生双光子吸收、且在近红外附近区域产 生发光的化合物。
[0007] 为了使得效率良好地发生双光子吸收，需要选择化合物的双光子吸收截面积(GM) (其表示上述效率的良好程度)大的化合物。由此，认为n电子共辆体系扩张的化合物等是合 适的，但是化合物的n电子共辆体系越扩张，向水、醇等极性溶剂中的溶解性变得越差，在进 行生物成像时，给予至作为测定对象的生物试样并使其分布于生物体内变得困难。因此，期 望开发出兼具W下性质的双光子吸收化合物：效率良好地发生双光子吸收的性质、发红色 光的性质、显示水溶性的性质。
[000引现有技术文献
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献l:Biochemist巧 46(2007)9674
【发明内容】
[0011] 发明要解决的课题
[0012] 本发明的课题在于提供一种双光子吸收化合物，所述双光子吸收化合物的水溶性 优异，且可在近红外波长区域内吸收双光子而被激发从而发出红色巧光。
[0013] 用于解决课题的手段
[0014] 本申请的发明人为解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，下述环数为2~4 的稠合多环基化合物是水溶性优异、且可在近红外波长区域内吸收双光子而被激发从而发 出红色巧光的双光子吸收化合物，所述环数为2~4的稠合多环基化合物具有2个N-烷基化 晚基乙締基作为取代基。
[001引即，本发明设及：
[0016] (1)式(1)表示的化合物；
[0017] X^-Y-X^ (1)
[001引[式（1)中，XI及X嗦示下述式（2)，且可W相同或不同，Y表示环数为2~4的稠合多
环基。
[0019] 辉 I
[0020] (式(2)中，r1表示C1~C3的烷基，Z-表示针对[I比晚鐵阳离子(pyridinium cation) 的反阴离子(counter anion),波浪线表示针对Y的共价键。）]
[0021] (2)如上述(1)所述的化合物，其特征在于，Y为W下化学式表示的稠合多环基中的 任一者；
[0022]
[0023] (式中，R2表示供电子基团，a为0~6的整数，b为0~8的整数，C为0~10的整数。a、b 或C为2W上的整数时，各R2可W相同或不同。波浪线表示针对Xi及X2的共价键。）
[0024] (3)如上述(2)所述的化合物，其特征在于，Y为W下化学式表示的稠合多环基中的 任一者；
[0025]
[00%](式中，R2表示供电子基团，a为0~6的整数，b为0~8的整数。a或b为上的整数 时，各R2可W相同或不同。波浪线表示针对Xi及X2的共价键。）
[0027] (4)如上述(2)或(3)所述的化合物，其特征在于，供电子基团为选自径基、C1~CIO 烷基、Cl~CIO烷氧基、氨基、具有酸键的烷基及具有酸键的烷氧基中的1个或2个W上；
[0028] (5)如上述（1)~（4)中任一项所述的化合物，其特征在于，反阴离子为面化物离 子、横酸根（sulfonate);
[0029] (6)如上述（1)~（5)中任一项所述的化合物，其特征在于，在600~1200nm的波长 区域内具有双光子吸收；
[0030] (7)如上述（1)~(6)中任一项所述的化合物，其特征在于，发出600~900皿的波长 区域的巧光；
[0031] (8)巧光探针组合物，其特征在于，含有上述（1)~(7)中任一项所述的化合物中的 1种或2种W上；
[0032] (9)用于生物成像的巧光探针组合物，其特征在于，含有上述(1)~(7)中任一项所 述的化合物中的1种或巧巾W上；
[0033] (10)巧光性生物分子，其特征在于，所述巧光性生物分子是含有与上述（1)~（7) 中任一项所述的化合物W化学方式结合的生物分子而成的。
[0034] 发明的效果
[0035] 本发明的化合物可在近红外波长区域内吸收双光子而被激发从而发出红色巧光， 并且还兼具水溶性，因此可用作巧光探针，并且能够对细胞、组织、器官及个体之类的生物 体进行生物成像。此外，由于发出容易穿过生物体的红色巧光，因此生物体深部的成像也成 为可能。
【附图说明】
[0036] [图。糞衍生物（I)的iHNMR图
[0037] [图2]蔥衍生物（II)的iHNMR图 [003引[图3]巧衍生物（III)的iHNMR图
[0039] [图4]糞衍生物(I)的紫外-可见吸收光谱
[0040] [图引蔥衍生物(II)的紫外-可见吸收光谱
[0041] [图6]巧衍生物(III)的紫外-可见吸收光谱
[0042] [图7]苯衍生物(IV)的紫外-可见吸收光谱
[0043] [图引糞衍生物(I)的巧光光谱
[0044] [图9]蔥衍生物(II)的巧光光谱
[0045] [图10]巧衍生物(III)的巧光光谱
[0046] [图山苯衍生物（IV)的巧光光谱
[0047] [图12]糞衍生物(I)的双光子吸收截面积光谱
[0048] [图13 ]蔥衍生物(II)的双光子吸收截面积光谱
[0049] [图14]巧衍生物(III)的双光子吸收截面积光谱
[0050] [图1引苯衍生物(IV)的双光子吸收截面积光谱
[0051] [图16]双光子激发巧光显微镜的光学系统的示意图
[0052] [图17]经糞衍生物（I)染色的化k293细胞的双光子激发巧光显微镜图像
[0053] [图1引经蔥衍生物（II)染色的化k293细胞的双光子激发巧光显微镜图像 [0化4][图19]经巧衍生物（III)染色的化k293细胞的双光子激发巧光显微镜图像
【具体实施方式】 [005引（化合物）
[0056] 本发明的化合物为式(1)表示的W下化合物。
[0057] X^-Y-X^ (1)
[0化引[式（1)中，XI及X嗦示下述式（2)，且可W相同或不同，Y表示环数为2~4的稠合多 环基。
[0化9]
[0060] (式(2)中，Ri表示C1~C3的烷基，Z-表示针对化晚鐵阳离子的反阴离子，波浪线表 示针对Y的共价键。）]
[0061] 上述C1~C3的烷基是指具有碳原子数为1~3的直链或支链的烷基，例如，表示甲 基、乙基、正丙基、异丙基等。
[0062] 上述针对化晚鐵阳离子的反阴离子例如表示:氯离子、漠离子、舰离子等面化物离 子；甲横酸根、对甲苯横酸根、=氣甲横酸根、=氣乙横酸根等横酸根;六氣錬酸根、六氣憐 酸根、四氣棚酸根等;优选为面化物离子、横酸根。
[0063] 上述环数为2~4的稠合多环基表示W下化学式所示的稠合多环基中的任一者。
[0064]
12 (式中，R2表示供电子基团，a为0~6的整数，b为0~8的整数，C为0~10的整数。a、b 或C为2W上的整数时，各R2可W相同或不同。波浪线表示针对Xi及X2的共价键。） 2 在上述Y的稠合多环基中，优选W下化学式表示的稠合多环基。
[0067
[0068] (式中，R2、a、b、波浪线表示与上述相同的含义。）
[0069] 上述供电子基团是指具有使稠合多环基的电子密度增加的效果的基团，例如，可 举出径基、C1~CIO烷基、C1~CIO烷氧基、氨基、具有酸键的烷基及具有酸键的烷氧基等。
[0070] 上述C1~CIO烷基是指具有碳原子数为1~10的直链或支链的烷基，例如，表示甲 基、乙基、丙基、异丙基、正下基、异下基、叔下基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、壬基、异 壬基、癸基等。
[0071] 上述C1~CIO烷氧基例如表示：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正下氧基、异 下氧基、仲下氧基、叔下氧基、正戊氧基、正己氧基、正庚氧基、异庚氧基、叔庚氧基、正辛氧 基、异辛氧基、叔辛氧基、2-乙基己氧基等。
[0072] 上述氨基是指由-N出、-NHR3、-NR3R3'表示的官能团。此处，R 3及R3'表示甲基、乙基、 丙基、异丙基、正下基、异下基、叔下基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、壬基、异壬基、癸基 等C1~CIO烷基;环丙基、环下基、环戊基、环己基等C3~C6环烷基;苯基等。
[0073] 所谓具有酸键的烷基及具有酸键的烷氧基，是指含有1个或2个W上的酸键的烷基 及烷氧基，例女日，表示-C此0C曲、-0C此0C曲、-C此0C出C出、-0C此0C此C曲、-(C出）2〇C此細3、-0 (C出）2〇C出 C出、-(C出）2〇(C此）2C 曲、-0(c出）2〇(C出）2C出、-(C此）3〇(C 此）2C 曲、-0(c出）3〇(C此） 2C 出、-(C 出）2〇(C 出）2〇(C 出）2C 出、-0(C 出）2〇(C 出）2〇(C 出）2C 出等。
[0074] 上述供电子基团中，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、正下基、异下基、叔下基、甲氧 基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正下氧基、异下氧基、仲下氧基、叔下氧基、径基、-N此、甲 基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、-C此0C出、-0C此0C出、-(C此）2〇 (C出）2C出、-0 (邸2)2〇(邸2)2邸3。
[0075] 式（1)表示的化合物优选为在从可见区域至红外区域内通过双光子吸收而被激发 的化合物，该双光子吸收为在600~1200nm处被吸收的化合物是优选的。此外，式(1)表示的 化合物中，通过双光子吸收而发出600~900nm的波长区域的巧光的化合物是优选的。此外， 式（1)表示的化合物中，双光子吸收截面积优选为200GM(1GM= l〇-5Dcm4smolecule-iphoton -i)W上，更优选为500GMW上。
[0076] 关于式（1)表示的化合物，具体而言，可W例举表1~表3中示出的化合物。芳香环 上的数字表示芳香环的碳编号。
[0077] [表1]
[0085]
[0086] (化合物的合成）
[0087] 本发明的式（1)表示的化合物的合成方法没有特别限制，例如，可举出如W下的方 法1~3所示那样、介由双键将稠合多环部分与化晚部分进行连接的方法。
[00则方法1
[0089]稠合多环部分与化晚部分的偶联可W通过化ck反应进行。即，根据需要在适当的 反应溶剂中，使式(3)的面代芳基化合物与4-乙締基化晚在钮催化剂及碱的存在下反应，从 而获得式(4)的化合物。然后，针对式(4)的化合物，根据需要在适当的反应溶剂中，利用N- 烷基化剂(RiZ)将化晚的氮进行烷基化，由此可W合成式(1)的化合物。
[0090]
[00川[式中，乂1八2、￥、1?1、2表示与上述相同的含义。化1表示面原子古'、沪表示：
[0092]
[0093] (式中，Ri、波浪线表示与式(1)中的那些相同的含义。）。]
[0094] 上述面代芳基化合物及4-乙締基化晚可W使用市售品。此外，上述面代芳基化合 物与上述4-乙締基化晚化合物的使用量之比没有特别限定，可从W4-乙締基化晚相对于面 代芳基化合物的当量比计为2.0~4.0、优选为2.1~3.0的范围内适当选择。
[00M]上述钮催化剂只要是通常在化ck反应中使用的钮催化剂即可，没有特别限定，例 如，可举出乙酸钮、氯化钮、=(二亚苄基丙酬）二钮、双（二亚苄基丙酬）钮、四苯基麟） 钮、[i，r-双（二苯基麟基）二茂铁]二氯化钮、双(=(邻甲苯基)麟）二氯化钮、双(=苯基 麟)二氯化钮、乙酷丙酬钮、钮碳、双（乙腊)二氯化钮、二(氯基苯)二氯化钮、（1,3-二异丙基 咪挫-2-亚基）（3-氯化晚基)二氯化钮、双(=叔下基麟)钮、二氯双(=苯基麟)钮（II)、二氯 双(=环己基麟)钮等。催化剂的使用量没有特别限定，可从W相对于面代芳基化合物的当 量比计为0.01~0.5、优选为0.05~0.3的范围内适当选择。
[0096] 上述碱只要是通常在化ck反应中使用的碱即可，没有特别限定，可举出S甲胺、S 乙胺、二异丙基乙基胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、=乙醇胺、乙二胺、化晚等胺类;碳酸 钢、碳酸钟、碳酸飽、氨氧化钢、氨氧化钟、氨氧化飽等无机碱类。碱的使用量没有特别限定， 可从W相对于面代芳基化合物的当量比计为2~20、优选为3~10的范围内适当选择。
[0097] 作为上述面代芳基化合物与上述4-乙締基化晚的偶联反应中的溶剂，例如，可举 出苯、甲苯等芳香族控类溶剂，乙腊、N，N-二甲基乙酷胺、N，N-二甲基甲酯胺等酷胺类溶剂， 四氨巧喃、乙酸等酸类溶剂等。运些反应溶剂可W各自单独使用，也可W适当组合巧巾W上 而使用。溶剂的使用量没有特别限定，可从使得面代芳基化合物的浓度成为0.1~2 (mo 1 / L)、优选0.5~1.5(mol/L)的量的范围内适当选择。
[009引上述面代芳基化合物与上述4-乙締基化晚的偶联反应时的溫度通常为0~200°C， 优选为20~130°C，可根据使用的溶剂、碱的沸点进行适当选择。反应可W在空气气氛下进 行，通常优选在非活性气体气氛下进行。作为非活性气体，可举出氣气、氮气、氮气等。
[0099]将由上述偶联反应得到的反应溶液根据需要进行浓缩后，可W将残余物直接用于 接下来的反应中，也可W在进行适当的后处理后，作为式(4)表示的化合物使用。作为后处 理的具体方法，可举出萃取处理及/或结晶、重结晶、色谱法等已知的纯化方法。
[0100] 对于上述烷基化剂而言，只要为通常在氮的烷基化中使用的N-烷基化剂即可，没 有特别限定，例如，可举出舰甲烧、舰乙烧、1-舰丙烷、硫酸二甲醋、=氣甲横酸甲醋等。烷基 化剂的使用量没有特别限定，可从W相对于式(4)表示的化合物的当量比计为1~10、优选 为1~5的范围内适当选择。
[0101] 作为上述烷基化中的溶剂，例如，可举出苯、甲苯等芳香族控类溶剂，乙腊、N，N-二 甲基乙酷胺、N，N-二甲基甲酯胺等酷胺类溶剂，四氨巧喃、乙酸等酸类溶剂，二氯甲烧、二氯 乙烧、氯仿等面素类溶剂等。运些反应溶剂可W分别单独使用，也可W适当组合巧巾W上而 使用。溶剂的使用量没有特别限定，可从使得式(4)表示的化合物的浓度成为0.01~2(mol/ L)、优选0.05~1.0(mol/L)的量的范围内适当选择。
[0102] 上述烷基化反应时的溫度通常为0~200°C，优选为20~130°C，可根据使用的溶 剂、碱的沸点进行适当选择。反应可W在空气气氛下进行，通常优选在非活性气体气氛下进 行。作为非活性气体，可举出氣气、氮气、氮气等。
[0103] 将上述烷基化反应结束后的反应溶液根据需要进行浓缩，然后，可W将析出的结 晶直接、或进行适当的后处理后作为式（1)表示的化合物使用。作为后处理的具体方法，可 举出萃取、结晶、重结晶、色谱法等已知的纯化方法。
[0…4] 方法2
[0105] ^^^：量的碱的存在下，根据需要在适当的反应溶剂中，使式（5)表示的醒与式 (6)表示的N-烷基-4-甲基化晚-1-鐵化合物进行反应，由此可W合成式（1)的化合物。
[0106]
1234 (式中，1?1心1^2、￥、2-表示与上述相同的含义。） 2 上述醒可W通过已知的方法从芳基化合物进行衍生。例如，可举出将市售的面代 芳基化合物进行裡化后，通过甲酯化反应进行衍生的方法;通过傅克(Friedel-Crafts)反 应将市售的糞、蔥、巧等芳基化合物进行衍生的方法;通过适当的氧化反应将双巧圣甲基)芳 基化合物进行衍生的方法等，但并不限定于上述方法。上述N-烷基-4-甲基化晚-1-鐵化合 物可^从4-甲基舰代化晚并按照211曰叫，￥.;胖曰叫，1;11^.;化，乂.；^11方.；^11，乂.；211曰〇， N. ;Huang,B.Org.Biomol. Qiem. 2010,8,4582-4588中记载的方法进行合成，但并不限定于 此。此外，上述醒与上述N-烷基-4-甲基化晚-1-鐵化合物的使用量之比没有特别限定，可从 WN-烷基-4-甲基化晚-1-鐵相对于醒的当量比计为2.0~4.0、优选为2.1~3.0的范围内适 当选择。 3 上述碱没有特别限定，可举出=甲胺、=乙胺、二异丙基乙基胺、二环己胺、乙醇 胺、二乙醇胺、=乙醇胺、乙二胺、化晚、赃晚等。碱的使用量没有特别限定，可从W相对于上 述醒的当量比计为0.01~1.0的范围内适当选择。 4 作为上述反应中的反应溶剂，例如，可举出苯、甲苯等芳香族控类溶剂，乙腊、N，N- 二甲基乙酷胺、N，N-二甲基甲酯胺等酷胺类溶剂，四氨巧喃、乙酸等酸类溶剂，甲醇、乙醇、 异丙醇等醇类溶剂，二氯甲烧、二氯乙烧、氯仿等面素类溶剂等。上述反应溶剂可W分别单 独使用，也可W适当组合巧巾W上而使用。溶剂的使用量没有特别限定，可从使得上述醒的 浓度成为0.001~l.〇(mol/L)的量的范围内适当选择。
[0111] 上述反应时的溫度通常为0~200°C，优选为20~130°C，可根据使用的溶剂、碱的 沸点进行适当选择。反应可W在空气气氛下进行，通常优选在非活性气体气氛下进行。作为 非活性气体，可举出氣气、氮气、氮气等。
[0112] 将反应结束后的反应溶液根据需要进行浓缩后，可W将析出的结晶直接、或进行 适当的后处理后作为式（1)表示的化合物使用。作为后处理的具体方法，可举出萃取、结晶、 重结晶、色谱法等已知的纯化方法。
[01。] 方法3
[0114]此外，式（4)表示的化合物可W通过霍纳尔一沃兹沃思一埃蒙斯（Horner- Wadswodh-Emmons)反应进行衍生。即，根据需要在适当的反应溶剂中，使憐酸醋化合物(7) 及4-化晚甲醒在碱的存在下反应，从而获得式(4)的化合物。然后，与方法1同样地，利用N- 烷基化剂将化晚的氮进行烷基化，由此可W合成式(1)的化合物。
[0115
[0116](式中，Y、Xi'、X2'表示与上述相同的含义，R4表示乙基或氣乙基。）
[0117] 对于上述式(7)表示的憐酸醋化合物，可举出按照Iwase,Y. ;Kamada,K.;化ta,K.; Kondo，K. J.Mater. Chem. 2003,13,1575-1581中记载的方法、使双（面代甲基）芳基化合物与 亚憐酸=乙醋或亚憐酸酸氣乙基)醋反应从而进行衍生的方法等，但并不限定 于此。上述4-化晚甲醒可W使用市售品。此外，上述憐酸醋化合物与上述4-化晚甲醒的使用 量之比没有特别限定，可从W4-化晚甲醒相对于憐酸醋化合物的当量比计为2.0~4.0的范 围内适当选择。
[0118] 上述碱没有特别限定，可举出1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一締、氨化钢、六甲基 二娃基氨基钢（Sodium hexamethyldisilazide)、六甲基二娃基氨基钟、苄基S甲基氨氧化 锭、叔下醇钟等。碱的使用量没有特别限定，可从W相对于面代芳基化合物的当量比计为 2.0~4.0的范围内适当选择。
[0119] 作为上述反应中的反应溶剂，例如，可举出苯、甲苯等芳香族控类溶剂，乙腊、N，N- 二甲基乙酷胺、N，N-二甲基甲酯胺等酷胺类溶剂，四氨巧喃、乙酸等酸类溶剂，甲醇、乙醇、 异丙醇、叔下醇等醇类溶剂，二氯甲烧、二氯乙烧、氯仿等面素类溶剂等。上述反应溶剂可W 分别单独使用，也可W适当组合巧巾W上而使用。溶剂的使用量没有特别限定，可从使得醒 的浓度成为0.001~l.〇(mol/L)的量的范围内适当选择。
[0120] 上述反应时的溫度通常为0~200°C，优选为20~130°C，可根据使用的溶剂、碱的 沸点进行适当选择。反应可W在空气气氛下进行，通常优选在非活性气体气氛下进行。作为 非活性气体，可举出氣气、氮气、氮气等。
[0121] 将上述反应结束后的反应溶液根据需要进行浓缩后，可W将析出的结晶直接作为 式（1)表示的化合物使用，或者经洗涂、或进行适当的后处理后作为式（1)表示的化合物使 用。作为后处理的具体方法，可举出萃取、结晶、重结晶、色谱法等已知的纯化方法。
[0122] (巧光探针组合物）
[0123] 上述式（1)表示的化合物可W直接作为巧光探针使用，根据需要，也可W配合通常 用于制备试剂的添加剂而W巧光探针组合物的形式使用。例如，作为为了在生理环境下使 用试剂而添加的添加剂，可W使用助溶剂、抑调节剂、缓冲剂、等渗剂等添加剂，本领域技术 人员可W适当选择它们的配合量。它们的组合物通常作为粉末形态的混合物、冻干物、颗粒 剂、片剂、液体制剂等合适形态的组合物而被提供。
[0124] (生物成像）
[0125] 本发明的生物成像按照W下的步骤进行：
[0126] 步骤1)，将式（1)表示的化合物或含有所述化合物的巧光探针组合物施予至细胞、 组织、器官或个体；
[0127] 步骤2)，使上述化合物分布于上述细胞、组织、器官或个体中，使其与上述细胞、组 织、器官或个体内的生物分子接触；
[01%]步骤3)，将上述细胞、组织、器官或个体暴露于上述化合物可吸收的波长的光；
[0129 ]步骤4 )，检测从上述化合物发出的巧光。
[0130] 在步骤1)中，将上述化合物或巧光探针组合物施予至细胞、组织、器官或个体时， 可W溶解于水、二甲基亚讽之类的溶剂、缓冲液中。例如，施予的对象为细胞时，例如可举出 在培养有细胞的培养基中混合上述化合物或巧光探针组合物的方法，但并不限定于此。
[0131] 在步骤2)中，所谓上述生物分子，例如，可举出在细胞核、内质网、高尔基体、内体、 溶酶体、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞膜、细胞壁等中存在的核酸、蛋白质、憐脂等。 此外，通过使上述化合物与上述生物分子接触，可形成共价键、离子键、配位键、氨键、范德 瓦尔斯键等化学键，成为显示巧光性的生物分子。此外，步骤2)中，可合适地例示出：上述化 合物与存在于线粒体中的生物分子形成化学键。
[0132] 在步骤3)中，所谓上述化合物可吸收的波长，只要是紫外区域、可见区域、红外区 域即可，没有特别限定，为了获得细胞、组织、器官或个体的深部的图像，优选对它们的透过 性良好的600~1200nm的波长区域。作为激发光的光源，使用市售的光源即可。此外，作为暴 露于光的方法，为了利用上述化合物的双光子吸收而获得细胞、组织、器官或个体的=维图 像，优选用透镜等将600~1200nm的波长区域的激发光进行聚光并扫描焦点的位置。
[0133] 步骤3)及步骤4)可W如本发明的实施例5所示那样利用双光子激发巧光显微镜进 行。
[0。4] 实施例
[0135] W下，在实施例中更详细地说明本发明，本发明的技术范围并不限定于运些。
[01化]实施例1.糞衍生物(I)的合成
[0137：
[0138] 在氣气气氛下的舒伦克管（Schlenk tube)中，加入2,6-二漠糞（0.29g，lmmol)和 二氯双苯基麟）钮（II)(Pd(PPh3)2Cl2,0.077g，0.11mmol)。向其中加入4-乙締基化晚 (0.26g, 2.56mmol)、1血苯、1血^乙胺，于100°C加热揽拌3天。过滤混合溶液并进行浓缩。然 后，用二氯甲烧萃取，用水洗涂有机层，向有机层中加入硫酸儀(无水)进行干燥，并进行浓 缩。用丙酬对粗结晶进行重结晶，获得金黄色固体形态的4,4-(2,6-糞二基二-(化)-2,1-乙 締基）双化晚（4,4-(2,6-]1日9111:11日16]16(1171(1;[-(化）-2,1-61:116]16(1171)1313971'1(1;[]16)。
[0139] 将4,4-(2,6-糞二基二-(1E)-2，1-乙締基)双化晚(0.33g，lmmol)溶解于 10 血二氯 甲烧中，加入舰甲烧(C出I，lmU并于室溫揽拌24小时。用二氯甲烧洗涂析出的固体，获得黄 色固体形态的糞衍生物(I)。将得到的糞衍生物(I)的iHNMR示于图1。
[0140] 实施例2.蔥衍生物(II)的合成
[pi/in
1234 在经火焰干燥的双颈瓶中，加入2,6-二漠蔥（0.34g，lmmol)，用氣气将容器内充 满。加入无水四氨巧喃（15mL)，将混合溶液冷却至-78°C。向其中缓慢滴加正下基裡（11- BuLi，21.4mL，34.2mmo 1)，于-78°C揽拌1小时。然后，缓慢滴加无水二甲基甲酯胺(DMF)，揽 拌1小时。然后，缓慢升溫至室溫，加水进行泽灭(quench),并用甲苯萃取，用水洗涂有机层， 向有机层中加入硫酸儀(无水)进行干燥，并进行浓缩。用柱色谱法(展开溶剂=氯仿9:丙酬 1)进行纯化。然后，用甲苯/乙醇混合溶剂进行重结晶，获得黄色固体形态的2,6-蔥二甲醒。 2 舰化 1,4-二甲基[I比晚鐵（1,4-dimethylpy;ridin-1-ium iodide)按照已报道的方 '法（Zhan邑，Y. ;Wan邑，J. ;Yu,X. ;Liu,H. ;Liu,X. ;Zhao,N. ;Huan邑， B. Org. Biomol. Chem. 2010，8，4582-4588.)进行合成。 3 向烧瓶中加入2,6-蔥二甲醒(0.04g，0.17mmol)和舰化1，4-二甲基化晚鐵(0.07g, 0.3mmol)，溶解于20mL乙醇中。滴加10滴赃晚，于80°C加热揽拌24小时。将析出的固体过滤 并用乙醇洗涂，由此，获得澄色固体形态的蔥衍生物（II)。将得到的蔥衍生物（II)的iHNMR 示于图2。 4 实施例3.巧衍生物(III)的合成
[0146；
[0147] 对于1，6-二下基巧，将巧作为起始物质，按照已报道的方法（Minabe，M.; Takeshige,S.；Soeda,Y.；Kimura,T.；Tsubota,M.Bull.Chem.Soc.Jpn.1994,67,172- 179.and Niko,Y.；Kawauchi,S.；0tsu,S.；Tokumaru,K.；Konishi,G.J.Org.Chem.2013,78, 3196-3207.)进行合成。
[014引将1，6-二下基巧（0.33g，1.06mmo 1)和二氯甲基甲酸(0.50血，5.3mmo 1)溶解于5mL 的二氯甲烧中，冷却至0 °C。向其中加入将四氯化铁(0.6mL 5.3mmo 1)溶解于2mL的二氯甲烧 而得到的溶液。于室溫揽拌反应溶液24小时。用大量冰水将反应泽灭后，用氯仿进行萃取。 将得到的有机层用碳酸氨钢水溶液和食盐水洗涂，用无水硫酸儀(MgS化)进行干燥，并进行 浓缩。将粗产物用柱色谱法(氯仿：己烧= 3:1)和随后的基于甲醇的重结晶进行纯化，获得 黄色固体形态的3，8-二下基巧-1，6-二甲醒(0.16g，收率为41 % )。
[0149] 将3，8-二下基巧-1，6-二甲醒（0 . lOg，0.27mmol)和舰化1，4-二甲基化晚鐵 (0.16g，0.67mmol)溶解于lOmL氯仿与30mL甲醇的混合液中，向其中滴力日5滴催化量的赃晚。 将反应液回流12小时。对反应液进行浓缩，将得到的粗产物用热甲醇和热氯仿洗涂2次，获 得红色固体形态的巧衍生物(〇.13g，收率为59%)。将得到的巧衍生物（III)的iHNMR示于图 3。
[0150] 比较例1.苯衍生物(IV)
[0151
[0152]苯衍生物（IV)按照Iwase,Y. ;Kamada,K. ;0hta,K. ;Kondo,K.J.Mate;r.Qiem.2003, 13,1575-1581中记载的方法进行合成。
[。巧引实施例4.紫外-可见吸收光谱、巧光光谱、双光子吸收截面积的测定
[0154]按照下述条件测定由实施例1~3合成的化合物及比较例1的紫外-可见吸收光谱、 巧光光谱、双光子吸收截面积。
[01巧]紫外-可见吸收光谱使用670-UV-VIS-NIR分光光度计（spectrophotometer) (Jasco Co.)进行测定。测定结果示于图4~图7。
[0156] 巧光光谱使用C9920-03G化amamatsu Photonics.K.K.)进行测定。巧光量子产率 通过使用积分球的绝对测定进行确定。使用浓度已调整为l(T6mol/L的试样进行测定。测定 结果示于图8~图11。
[0157] 按W下顺序确定双光子吸收截面积。与单光子吸收行为相同，双光子吸收行为也 是光谱学性质，因此对物质间的双光子吸收截面积的比较需要测定光谱。因此，在数种波长 下测定双光子吸收截面积，将其值W波长为横轴进行绘图，从而得到双光子吸收光谱。各波 长下的双光子吸收截面积的值利用开孔Z扫描法进行测算。作为光源，使用将从再生放大器 (Spectra-Physics , Spitfire)输出的激光通过差频产生装置（Spectra-Physics ,0PA- 800C)进行波长转换而得的激光。
[015引输出的激光的重复频率为1曲Z,脉冲宽度为150-200fs。用焦点距离为15cm的透镜 将激光进行聚光，沿着其光轴移动样品，根据此时观察到的透过率变化程度测算双光子吸 收截面积。使用的激光的平均功率为0.01~0.4mW，峰值输出功率为6-240GW/cm2。将双光子 吸收截面积的光谱示于图12~15。
[0159] 实施例5.细胞的巧光化实验和观察
[01側细胞的培养
[0161]作为染色的模型细胞，使用作为人胚胎肾细胞的化k293细胞。对于化k293细胞，在 包含10% (v/v)的胎牛血清、1 % (v/v)的膜蛋白酶及链霉素的Du化ecco改良Eagle培养基 (Du化ecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中，在37°C、5%C02的条件下进行培养。
[01创细胞的巧光化
[0163] 作为进行显微镜观察的准备工作，在35mm玻璃制皿（glass base dish)中，将 化k293细胞W细胞密度成为IX 105个细胞/皿的方式进行传代。进行传代，24小时后，通过 显微镜观察确认了细胞附着于皿。从皿中除去培养基，使用憐酸缓冲生理盐水(PBS)洗涂细 胞2次。将2mL下述不含酪红的DMEM培养基装入皿中，通过解育12小时而进行染色，所述DMEM 培养基中添加了糞衍生物（I)、蔥衍生物（II)或巧衍生物（III)的1 X l(T3mo 1/dnf3的二甲基 亚讽(DMS0)溶液化L(PY最终浓度为1皿〇1血-3，最终DMS0浓度为0.1 % (v/v))。在马上要进 行显微镜观察之前，将包含色素的培养基从皿中除去，使用PBS洗涂细胞2次，将2mL不含酪 红的DMEM培养基加入皿中。
[0164] 双光子激发巧光显微镜观察
[01化]双光子激发巧光显微镜使用光学模块（Optical Block)巧amamatsu曲otonics K.K.)制成。其光学系统示于图16。光源使用飞秒渗铁蓝宝石激光器(Mira900，Coherent)。 将用于扫描焦点的流电扫描仪(Galvano scanner)、设置有截止波长为750nm的短波通二向 色镜(FF750-SDi02-25X36，Semrock)和中屯、波长为 650nm 的带通滤波器(FF01-650/60-25， Semrock)的镜单元(mirror unit)插入至光学系统中。在巧光的检测中，使用光电倍增管 (R928，Hamamatsu Photonics K.K.)，在lOOOV的外加电压下经由带有前置放大器(5MHz)的 插槽（socket)进行DC检测。作为DAQ，使用USB-6251BNC，作为控制程序的平台，使用Lab VIEW2011(化tional Instruments)。作为样品台，使用KZG0620-G，作为物镜，使用倍率为40 倍、NA=1.15的无限远校正物镜。将通过观察而得到的图像示于图17~19。
[0166] 本发明的糞衍生物（I)、蔥衍生物(II)及巧衍生物(III)分别能够溶解于二甲基亚 讽(DMS0)，并且能够将化k293细胞巧光化。此外，利用双光子激发巧光显微镜观察到了上述 细胞发出红色巧光。
[0167] 产业上的可利用性
[0168] 本发明的化合物可在近红外波长区域内吸收双光子而被激发从而发出红色巧光， 并且还兼具水溶性，因此可用作巧光探针。将本发明的化合物施予至细胞、组织、器官及个 体后，可进行它们的生物成像。此外，由于发出容易穿过生物体的红色巧光，因此生物体深 部的成像也成为可能。
【主权项】
1. 式（1)表不的化合物， χ?γ-χ2 (1) 式（1)中，X1及X2表示下述式(2)，且可以相同或不同，Υ表示环数为2~4的稠合多环基，式(2)中，R1表示C1~C3的烷基，表示针对吡啶鑰阳离子的反阴离子，波浪线表示针对 Υ的共价键。2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，Υ为以下化学式表示的稠合多环基中的任 一者，式中，R2表示供电子基团，a为0~6的整数，b为0~8的整数，c为0~10的整数;a、b或c为2 以上的整数时，各R2可以相同或不同；波浪线表示针对X1及X2的共价键。3. 如权利要求2所述的化合物，其特征在于，Y为以下化学式表示的稠合多环基中的任 一者，式中，R2表示供电子基团，a为0~6的整数，b为0~8的整数;a或b为2以上的整数时，各R2 可以相同或不同；波浪线表示针对X1及X2的共价键。4. 如权利要求2或3所述的化合物，其特征在于，供电子基团为选自羟基、C1~C10烷基、 C1~C10烷氧基、氨基、具有醚键的烷基及具有醚键的烷氧基中的1个或2个以上。5. 如权利要求1~4中任一项所述的化合物，其特征在于，反阴离子为卤化物离子、磺酸 根。6. 如权利要求1~5中任一项所述的化合物，其特征在于，在600~1200nm的波长区域内 具有双光子吸收。7. 如权利要求1~6中任一项所述的化合物，其特征在于，发出600~900nm的波长区域 的焚光。8. 荧光探针组合物，其特征在于，含有权利要求1~7中任一项所述的化合物中的1种或 2种以上。9. 用于生物成像的荧光探针组合物，其特征在于，含有权利要求1~7中任一项所述的 化合物中的1种或2种以上。10. 荧光性生物分子，其特征在于，所述荧光性生物分子是含有与权利要求1~7中任一 项所述的化合物以化学方式结合的生物分子而成的。
【文档编号】G01N33/58GK106061945SQ201480076845
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年9月26日
【发明人】铃木康孝, 川俣纯, 守友博纪, 富永亮, 小西玄, 小西玄一, 仁子阳辅
【申请人】大塚电子株式会社