用于制备睫状缘干细胞的方法
【专利摘要】本发明提供一种用于制备由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干细胞的方法，所述方法包括下述步骤(1)或步骤(2)或两者：(1)悬浮培养从由多能干细胞诱导分化的含有睫状缘区样结构的细胞团聚体获得的细胞而获得视网膜球体的步骤；和(2)从获得自由多能干细胞诱导分化的含有睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞收集阶段特异性胚胎抗原1阳性细胞的步骤。根据本发明，能够以高的纯度有效地制备具有分化成包括视网膜层特异性神经元的视网膜细胞的潜力和自我复制能力的睫状缘区干细胞。
【专利说明】
用于制备睫状缘干细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于制备睫状缘区干细胞的方法等。
【背景技术】
[0002] 预期具有分化成视网膜细胞的潜能和自我复制能力的组织干细胞适用于细胞移 植治疗、药物发现筛选等。
[0003] 已知体内视网膜的睫状缘区（cilia巧marginal zone,CMZ)对于视网膜组织的结 构形成和维持执行重要功能（参见，例如，非专利文献1)。具有分化成视网膜细胞如光感受 器细胞的潜能的视网膜组织的干细胞(视网膜干细胞)存在于睫状缘区中（参见，例如，非专 利文献2)。已知RdhlO基因（非专利文献3)和化XI基因（非专利文献1)作为睫状缘区的基因 标志物。
[0004] 当将可W通过悬浮培养多能干细胞形成的包含视网膜组织的细胞团聚体在特定 条件下进一步培养时，获得包含睫状缘区样结构的细胞团聚体(参见，例如，专利文献1)。在 所述"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"中，所述睫状缘区样结构的功能是作为进展区 (progress zone)，并且此处可W高频率形成具有与所述睫状缘区样结构邻近的层结构的 连续的神经视网膜。所述"进展区"是位于一部分组织中的未分化的细胞群体，并且是在发 育和再生过程中具有连续增殖特性而有助于组织整体生长和/或通过分泌生长因子等而有 助于周围组织生长的特性的细胞群体。
[000引[文献列表]
[0006] [专利文献]
[0007] 专利文献 1:W0 2013/183774 A1 [000引[非专利文献]
[0009] 非专利文献 1 DEVELOPMENTAL DYNAMICS,239卷，第2066-2077页(2010)
[0010] 非专利文献 2 :Proc. Natl. Acad. Sci.USA，101 卷，第 15772-15777 页（2004)
[0011] 非专利文献 3: Development，136卷，第 1823-1833 页（2009)
[0012] 发明概述
[001引发明要解决的问题
[0014]需要开发一种W高纯度有效地制备具有分化成视网膜细胞的潜能和自我复制能 力的组织干细胞的方法。
[001引[解决问题的方式]
[0016] 本发明提供一种制备具有分化成视网膜细胞(诸如光感受器细胞）的潜能和自我 复制能力的细胞的方法，所述细胞存在于由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的 细胞团聚体中下有时称为睫状缘区干细胞或CMZ干细胞），等等。
[0017] [1]用于制备由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干细胞的方法，其包括下述步骤 (1)或步骤(2)或两者下有时称为本发明的干细胞制备方法1):
[0018] (1)悬浮培养获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体 的细胞由此获得视网膜球体(retinos地ere)的步骤;和
[0019] (2)从获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞 收集阶段特异性胚胎抗原1 (W下有时称为SSEA-1)阳性细胞的步骤；
[0020] [2]根据上述[1]所述的方法，其中进行步骤（1)，并且其中"获得自由多能干细胞 诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过下述方式获得的细胞：
[0021] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0022] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构下有时称为本发明的干细胞制 备方法2);
[0023] [3]根据上述[1]所述的方法，其中进行步骤(2)，并且其中"获得自由多能干细胞 诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过下述方式获得的细胞：
[0024] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0025] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构下有时称为本发明的干细胞制 备方法3);
[0026] [4]根据上述[1]所述的方法，其中进行步骤（1)，接着进行步骤(2)，并且其中步骤 (1) 中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过 下述方式获得的细胞：
[0027] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0028] 分散分离自前述细胞团聚体的睫状缘区样结构;并且
[0029] 步骤(2)中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体 的细胞"是通过分散步骤(1)中获得的视网膜球体获得的细胞（W下有时称为本发明的干细 胞制备方法4);
[0030] [5]根据上述[1]所述的方法，其中进行步骤(2)，接着进行步骤(1)，并且其中步骤 (2) 中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过 下述方式获得的细胞：
[0031] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0032] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构;并且
[0033] 步骤（1)中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体 的细胞"是通过分散步骤(2)中收集的细胞获得的细胞下有时称为本发明的干细胞制备 方法5);
[0034] [6]根据前述[1]、[3]、[4]和[5]中任一项所述的方法，其中所述SSEA-1阳性细胞 还是Rax阳性的；
[0035] [7 ]根据前述[1 ]、[3]、[4]、[5]和[6]中任一项所述的方法，其中所述SSEA-1阳性 细胞是无色素沉着的；
[0036] [引根据前述[1]、[2]、[4]和[引中任一项所述的方法，其中步骤(1)中的悬浮培养 在无血清培养基或含血清培养基中进行，所述无血清培养基或含血清培养基各自含有一种 或多种选自由下述组成的组的物质:作用于FGF信号转导途径的物质和作用于EGF信号转导 途径的物质；
[0037] [9]根据上述[引所述的方法，其中所述无血清培养基或含血清培养基进一步包含 ROCK抑制剂；
[0038] [10]根据上述[1]、[2]、[4]、[5]、[引和[9]中任一项所述的方法，其中所述视网膜 球体是无色素沉着的；
[0039] [11]根据上述[1]-[10]中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物 多能干细胞；
[0040] [12]根据上述[1]-[11]中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细 胞；
[0041] [13]用于制备视网膜层特异性神经元的方法，所述方法包括下述步骤:在存在一 种或多种选自由Notch信号抑制物质、类视黄醇和牛横酸组成的组的物质的情况下，培养通 过上述[1]-[12]中任一项的方法获得的睫状缘区干细胞；
[0042] [14]用于由视网膜组织障碍导致的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含通过上述[1]- [13]中任一项的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元；
[0043] [15]治疗由视网膜组织障碍导致的疾病的方法，所述方法包括将有效量的通过上 述[1]-[ 13]中任一项的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元移植到需要 所述移植的受试者中；
[0044] [16]通过上述[1]-[13]中任一项的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异 性神经元，其用于治疗由视网膜组织障碍导致的疾病；
[0045] [17]用于评价毒性或药效的试剂，所述试剂包含通过上述[1]-[13]中任一项的方 法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元；
[0046] [1引评价测试物质的毒性或药效的方法，所述方法包括使通过上述[1]-[13]中任 一项的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元与所述物质接触，并且测定所 述物质对所述细胞的影响;等等。
[0047] [发明效果]
[004引根据本发明，可W高纯度有效地制备具有分化成包括视网膜层特异性神经元在内 的视网膜细胞的潜能和自我复制能力的睫状缘区干细胞。
[0049] [附图简述]
[0050] 图1显示包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第35天)的相差 图像(A)和GFP巧光图像(BKRax)。
[0051] 图2显示包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第60天)的相差 图像(A)和GFP巧光图像(BKRax)。
[0052] 图3显示包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第63天)的冷冻 切片的染色图像。"A"是化xlO阳性细胞的免疫染色图像，"B"是化XI阳性细胞的免疫染色图 像，"C"是R化10阳性细胞的免疫染色图像，"护是Crx阳性细胞的免疫染色图像，"护是l\ijl 阳性细胞的免疫染色图像，并且甲'是SSEA-1阳性细胞的免疫染色图像。
[0053] 图4显示通过分散分离自包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养开始起 的第90天）的神经视网膜区或睫状缘区样结构获得的细胞的巧光显微镜图像。"A" (Rax)是 神经视网膜区(NR)的GFP巧光图像，"B"(SSEA1)是使用抗-SSEA-1抗体的神经视网膜区(NR) 的免疫巧光染色图像，"C"(Rax)是睫状缘区样结构(CMZ)的GFP巧光图像，并且"护（SSEA1) 是使用抗-SSEA-1抗体的睫状缘区样结构(CMZ)的免疫巧光染色图像。
[0054] 图5显示通过分散分离自包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养开始起 的第90天）的视网膜色素上皮和睫状缘区样结构获得的细胞的巧光显微镜图像。"A" (SSEA1)是使用抗-SSEA-1抗体的免疫巧光染色图像，"B"(Rax)是GFP巧光图像，并且"C"(亮 视野)是亮视野图像。
[0055] 图6显示通过分散包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第63 天)并且对获得的细胞进行悬浮培养形成的视网膜球体的巧光显微镜图像。"A"和"C" (Rax) 是GFP巧光图像，"B"(化xlO)是使用抗-化xlO抗体的免疫巧光染色图像，并且"护（SSEA1)是 使用抗-SSEA-1抗体的免疫巧光染色图像。
[0056] 图7显示通过分散分离自细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第70天)的神经视网膜 区(NR)或睫状缘区样结构(CMZ)并且对获得的细胞进行悬浮培养形成的视网膜球体的分析 结果。"A"和"B"是由睫状缘区样结构（CMZ)形成的视网膜球体的巧光显微镜图像，"A"(BF) 是亮视野图像，并且"B" (Rax)是GFP巧光图像。"C"显示原代视网膜球体的形成数目，并且 吧'显示次生性视网膜球体的形成数目。"护显示原代视网膜球体的直径分布，并且甲'显示 次生性视网膜球体的直径分布。
[0057] 图8"A"显示通过分散分离自细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第60天）的睫状缘 区样结构、用巧光标记的SSEA-1抗体免疫染色得到的细胞悬浮液并且用细胞分选仪进行 FACS分析获得的结果。图8 "B"显示分离自上述细胞悬浮液的Rax阳性和SSEA-1阳性细胞级 分(分离自XQ2中所示的细胞的级分1)的FACS分析结果，并且图8"C"显示分离自上述细胞 悬浮液的Rax阳性和SSEA-1阴性细胞级分(分离自"A"Q4中所示的细胞的级分2)的FACS分析 结果。
[0058] 图9显示通过分散分离自细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第60天)的睫状缘区样 结构、从得到的细胞悬浮液分离Rax阳性和SSEA-1阳性细胞级分(SSEA1+)、Rax阳性和SSEA- 1阴性细胞级分(SSEA1-)并且对分离的细胞级分进行悬浮培养而形成的视网膜球体的分析 结果。"A"和"B"是由Rax阳性和SSEA1阳性细胞级分(SSEA1+)形成的视网膜球体的巧光显微 镜图像，X (BF)是亮视野图像，"B" (Rax)是GFP巧光图像。"C"显示视网膜球体的形成数目。 "护显示形成的视网膜球体的直径分布。
[0059] 图10显示通过由通过分散分离自包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养 开始起的第90天)并且对得到的细胞进行悬浮培养形成的视网膜球体分化而获得的细胞的 巧光显微镜图像。"A"和"B"是由原代视网膜球体分化的细胞的图像，"C"和"护是由次生性 视网膜球体分化的细胞的图像。"A"和"C" (Rax)是GFP巧光图像，并且"B"和"护（Crx)是使用 抗-化X抗体的免疫巧光染色图像。
[0060] 图11显示通过由通过分散分离自包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培养 开始起的第60天）的睫状缘区样结构、并且对得到的细胞进行悬浮培养形成的次生性视网 膜球体分化而获得的细胞的巧光显微镜图像。"A"(巧视网膜蛋白（化Iretinin))是使用抗- 巧视网膜蛋白抗体的免疫巧光染色图像，"B"(Rax)是GFP巧光图像，"C"(Pax6)是使用抗- 化x6抗体的免疫巧光染色图像，并且"护（化J1)是使用抗-Tujl抗体的免疫巧光染色图像。
[0061] 图12显示通过由通过分散自分离自包含睫状缘区样结构的细胞团聚体（自悬浮培 养开始起的第54天)的睫状缘区样结构分离的Rax阳性和SSEA1阳性细胞并且对得到的细胞 进行悬浮培养而形成的视网膜球体分化而得到的细胞的巧光显微镜图像。"A" (&X)是使用 抗-Crx抗体的免疫巧光染色图像，"B"和"F"(Rax)是GFP巧光图像，"C"(Pax6)是使用抗- 化x6抗体的免疫巧光染色图像，"护（Tujl)是使用抗-Tujl抗体的免疫巧光染色图像，并且 "E"(巧视网膜蛋白）是使用抗-巧视网膜蛋白抗体的免疫巧光染色图像。
[0062] 图13显示通过分散分离自细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第79天）的睫状缘区 样结构、从得到的细胞悬浮液分离SSEA-1阳性细胞级分和SSEA-1阴性细胞级分并且对分离 前的细胞悬浮液、分离的SSEA-1阳性细胞级分和分离的SSEA-1阴性细胞级分中的每一个进 行悬浮生长培养而形成的视网膜球体的分析结果。"A"和"B"是由SSEA-1阳性细胞级分形成 的视网膜球体的巧光显微镜图像，"A" (BF)是亮视野图像，"B" (Rax)是GFP巧光图像。"C"是 视网膜球体的形成数目。"未分选的"是由分离之前的细胞悬浮液形成的视网膜球体的数 目/'SSEAr'是由SSEA-1阳性细胞级分形成的视网膜球体的数目，并且"SSEAr"是由SSEA-1 阴性细胞级分形成的视网膜球体的数目。
[0063] [实施方案描述]
[0064] W下详细说明用于进行本发明的方式。
[0065] 在本发明中，"干细胞"的实例包括具有分化成多种分化品系的能力（多能性)和在 维持多潜能性的同时W不变的方式生长的能力（自我复制能力）的细胞，所述细胞在组织受 损失时能够再生。在本文中，"干细胞"可W是胚胎干细胞巧S细胞)或组织干细胞(也称为组 织的干细胞、组织特异性干细胞或体干细胞），或人工多能干细胞（iPS细胞:诱导的多能干 细胞），但不限于此。如由来源于干细胞的组织细胞可W再生组织的事实理解的，已知干细 胞可W分化为与活体内的细胞接近的正常细胞。
[0066] 在本发明中，"组织干细胞"是，例如，存在于组织中的具有分化成多种组成组织的 分化品系的能力（多能性)和自我复制能力的细胞。已知"组织干细胞"具有在发育过程中、 细胞死亡和损伤组织再生过程中供应新细胞的作用。
[0067] 本发明中的"多能干细胞"的实例包括可W在体外培养并且具有分化为构成活体 的任意细胞(来源于S胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的组织）的能力（多能性)的干细胞，包 括胚胎干细胞化S细胞）。"多能干细胞"获自受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞和组织干细胞。 其还包括在将多种类型的基因引入体细胞后具有诱导的与胚胎干细胞类似的多能性的细 胞(也称为人工多能干细胞）。多能干细胞可W通过本身已知的方法产生。多能干细胞的制 备方法的实例包括Cell 131(5)第861-872页（2007)，Cell 126(4)第663-676页(2006)等中 描述的方法。
[0068] 本发明中"胚胎干细胞化S细胞r的实例包括具有自我复制能力和多潜能性(特别 是，"多能性"）的干细胞，其是来自早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞最早化981年建立， 并且自从1989年起也已经被用于制备基因敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也 被用于再生医学。
[0069] 本发明中的"人工多能干细胞"的实例包括通过直接重编程分化的细胞(如成纤维 细胞等）通过表达多种基因如0ct3/4、Sox2、Klf4和Myc而诱导成具有多能性的细胞，其由 Yamanaka的小组在2006在小鼠细胞中建立（Takahashi K和化manaka S. Ce 11.2006，126 (4)，第663-676页）。在2007年，人工多能干细胞还在人成纤维细胞中建立，并且具有与胚胎 干细胞类似的多潜能性(Cell ,131(5)，第861-872页(2007) ;Science ,318(5858)，第 1917- 1920页（2007);Nat Biotechnol.，26(1)，第101-106页（2008))。
[0070] 多能干细胞可从指定组织获得，或可W购买可商购的产品。例如，人胚胎干细胞， 趾ES-l、KhES-2和趾ES-3,可从京都大学的前沿医学科学研究所（InstiUite for Frontier Medical Sciences)获得。分别地，EB5细胞（其是小鼠胚胎干细胞）可从Inco;rporated A血inistrative Agency RIKEN获得，并且D3细胞系可从ATCC获得。
[0071] 多能干细胞可W通过根据本身已知的方法培养来维持。例如，人干细胞可W通过 使用Knockout?血清代替物化SR)培养来维持。例如，小鼠干细胞可W通过在添加胎牛血清 (FBS)和白血病抑制因子化I巧而没有饲养细胞的情况下培养来维持。
[0072] 遗传改造的多能干细胞可W通过使用，例如，同源重组技术产生。染色体上要被修 饰的基因的实例包括细胞标志物基因、组织相容性抗原基因、与由神经系统细胞障碍引起 的疾病相关的基因等。染色体上的祀基因可W用下述中所述的方法进行修饰： Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of Mu1:ant Mouse using ES cell,YODOSHA CO.，LTD. (1995)等。
[0073] 具体地，例如，分离要被修饰的祀基因的基因组基因（例如，细胞标志物基因，组织 相容性抗原基因，疾病相关的基因等），并且使用分离的基因组基因产生用于祀基因的同源 重组的祀向载体。将产生的祀向载体引入到干细胞中，并且选择显示出祀基因与祀向载体 之间的同源重组的细胞，由此可W产生在染色体上具有修饰的基因的干细胞。
[0074] 用于分离祀基因的基因组基因的方法的实例包括Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons( 1987-1997)等中所述的已知方法。 也可W使用基因DNA文库筛选系统（由Genome Systems供应）、Universal GenomeWalkeH式 剂盒（由CLONTECH供应)等分离祀基因的基因组基因。
[0075] 用于祀基因同源重组的祀向载体的制备和同源重组体的有效选择可W按照Gene Targeting,A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993)； Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of Mutant Mouse using ES cell， YODOSHA CO.，LTD. (1995)等中所述的方法进行。作为祀向载体，可W使用替代型或插入型 中的任一种。作为选择方法，可W使用诸如阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺巧酸 (po lyA)选择等的方法。
[0076] 从选择的细胞系选择目标同源重组体的方法的实例包括用于基因组DM的 Southern杂交法、PCR法等。
[0077] 本发明中的"团聚体"的实例包括分散在培养基中但聚集而形成的细胞团块。本发 明中的"团聚体"包括由在悬浮培养开始时分散的细胞形成的团聚体和在悬浮培养开始时 已经形成的团聚体。
[0078] "形成团聚体"意指聚集细胞形成细胞团聚体。当要形成干细胞团聚体时，分散的 干细胞可W自然地聚集。干细胞质量均匀的团聚体可W通过快速聚集给定数量的分散的干 细胞而形成。例如，当多能干细胞快速聚集W允许形成多能干细胞的团聚体时，可W在来自 形成的团聚体的被诱导分化的细胞中W良好的再现性形成上皮样结构。
[0079] 形成团聚体的实验操作的实例包括设及将细胞接种在具有大孔的悬浮培养皿中 并且等待非人工的聚集的方法，设及通过使用具有小孔的板(96孔板）、微孔等将细胞保持 在小的空间中的方法，设及通过使用小的离屯、管短时离屯、聚集细胞的方法等。
[0080]可W基于细胞团聚体的尺寸和细胞数目、宏观形态、通过组织染色分析的微观形 态及其均一性、分化和未分化标志物的表达及其均一性、分化标志物的表达的控制和它们 的同步性、团聚体之间的分化效率的再现性等确定多能干细胞团聚体的形成和在形成团聚 体的每个细胞中的上皮样结构的形成。
[0081 ]本发明中的"组织"的实例包括细胞群体的结构，其具有运样的构型，其中形状和 性质不同的多于一种类型的细胞W给定样式在空间上配置。
[0082] 在本发明中，"视网膜组织"的实例包括视网膜组织等，其中在体内视网膜中构成 相应视网膜层的至少两种或更多种类型的细胞如光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞(corn cell)、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞(或神经节细胞）、其先祖细胞、 视网膜先祖细胞等在空间上层状排列。关于各种细胞，哪种细胞构成哪个视网膜层可W通 过已知方法，例如，是否存在分化标志物和不分化标志物的表达或其水平等来检验。
[0083] 作为本发明中的"视网膜组织"，也可W提及含有视网膜先祖细胞或神经视网膜先 祖的上皮组织，其可W通过在适于分化为视网膜的条件下悬浮培养团聚体而在多能干细胞 的细胞团聚体的表面上形成。
[0084] 本发明中的"视网膜层"意为构成视网膜的各个层。其具体实例包括视网膜色素上 皮层、光感受器层、外界膜、外核层、外网织层、内核层、内网织层、神经节细胞层、神经纤维 层和内界膜。
[0085] 本发明中的"视网膜层特异性神经元'包括，例如，构成视网膜层的细胞，其是所述 视网膜层特有的神经细胞。视网膜层特异性神经元的具体实例包括光感受器细胞、视杆细 胞、视锥细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞(或神经节细胞)和色素 上皮细胞。
[0086] 本发明中的"视网膜干细胞"的实例包括具有分化成光感受器细胞、视杆细胞、视 锥细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞(或神经节细胞)和色素上皮 细胞中的任意成熟的视网膜细胞的能力和自我复制能力的细胞。
[0087] 作为本发明中的"视网膜先祖细胞"，可W提及能够分化为任何构成神经视网膜和 视网膜色素上皮的成熟视网膜细胞的先祖细胞。
[0088] 作为"神经视网膜先祖"，可W提及先祖细胞，其是注定形成视杯的内层并且能够 分化为构成神经视网膜的任何成熟细胞的细胞。
[0089] 视网膜细胞标志物的实例包括在视网膜先祖细胞中表达的Rax和PAX6,在神经视 网膜先祖细胞中表达的化xlO,在下丘脑神经元的先祖细胞中表达但在视网膜先祖细胞中 不表达的Nkx2.1，在下丘脑神经上皮中表达但在视网膜中不表达的Soxl，在光感受器细胞 的先祖细胞中表达的Crx等。视网膜层特异性神经元的标志物的实例包括在双极细胞中表 达的化xlO和L7,在神经节细胞中表达的TUJI和化n3,在无长突细胞中表达的巧视网膜蛋白 (化Iretinin)，在水平细胞中表达的巧结合蛋白（Ca化indin)，在光感受器细胞中表达的视 紫红质和恢复蛋白（Recoverin)，在色素上皮细胞中表达的RPE65和Mitf，在视杆细胞中表 达的化1，在视锥细胞中表达的Rxr-丫等。
[0090] 本发明中的"睫状缘区（CMZr的实例包括体内视网膜中的视网膜组织(具体是，神 经视网膜)和视网膜色素上皮的边界区域中存在的组织，其是包括视网膜的组织干细胞(视 网膜干细胞）的区域。睫状缘区也被称为睫状缘或视网膜缘，并且睫状缘区、睫状缘和视网 膜缘是等价的组织。已知睫状缘区在将视网膜先祖细胞和分化的细胞提供给视网膜组织、 维持视网膜组织结构等方面发挥重要作用。睫状缘区的标志物基因的实例包括RdhlO基因 (阳性）、化XI基因（阳性)等。
[0091] 用于本发明的"培养基"可W由作为基础培养基的用于培养动物细胞的培养基制 备。基础培养基的实例包括可W用于培养动物细胞的培养基，如BME培养基、BG化培养基、 CM化1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、 Mediuml 99培养基、Eagl e MEM培养基、aMEM培养基、DMEM培养基、ham培养基、F-12培养基、 DMEM/F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基和它们的混合培养基等。
[0092] 本发明中的"无血清培养基"的实例包括不含未调节或未纯化的血清的培养基。在 本发明中，含有纯化的血液来源的成分和动物组织来源的成分(例如，生长因子）的培养基 也包括在无血清培养基内，除非其中含有未调节的或未纯化的血清。
[0093] 无血清培养基可W含有血清代替物。血清代替物的实例包括清蛋白、转铁蛋白、月旨 肪酸、胶原前体、微量元素、2-琉基乙醇或3'琉基甘油、适当含有运些的等效物等的血清代 替物等。运样的血清代替物可W通过例如，W098/30679等中描述的方法制备。此外，血清代 替物可W是可商购的产品。此种可商购的血清代替物的实例包括Knockout?血清代替物 (In vitrogen:下文中有时也表示为KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物（Chemically Defined Lipid Concentrate,由Gibco制备）和Glutamax(由Gibco制备）。
[0094] 用于悬浮培养的"无血清培养基"可W含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如，非必需氨 基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-琉基乙醇、丙酬酸、缓冲剂、无机盐等。
[00对为了避免复杂的制备，补充W适量(例如，约1-约20%)的可商购的KSR的无血清培 养基(GMEM或DMEM培养基，补充有0.1 mM 2-琉基乙醇，0.1 mM非必需氨基酸混合物和ImM丙酬 酸钢;或补充W450iiM 1--硫代甘油等的F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物)可W优选 作为无血清培养基被提及。
[0096] 本发明中的"含血清培养基"的实例包括含有未调节或未纯化的血清的培养基。所 述培养基可W含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因 子、抗氧化剂、2-琉基乙醇、丙酬酸、缓冲剂、无机盐等。
[0097] 本发明中添加于培养基中的"血清"的实例包括哺乳动物血清，如牛血清、小牛血 清、胎牛血清、马血清、小马血清、胎马血清、兔血清、小兔血清、胎兔血清和人血清等。
[0098] 在本发明中，"含有物质X的培养基"是补充有外源物质X的培养基或含有外源物质 X的培养基，并且"不含物质X的培养基"是未补充外源物质X的培养基或不含外源物质X的培 养基。如本文中使用的，"外源物质r意为相对于在培养基中培养的细胞或组织来说为外源 的物质X，并且不包括细胞或组织产生的内源物质X。
[0099] 例如，"含有作用于FGF信号转导途径的物质的培养基"是补充有作用于FGF信号转 导途径的外源物质的培养基或包含作用于FGF信号转导途径的外源物质的培养基。"不含抑 制FGF信号途径的物质的培养基"是未补充抑制FGF信号途径的外源物质的培养基或不含抑 制FGF信号途径的外源物质的培养基。
[0100] 本发明中"悬浮培养"的实例包括在对细胞培养容器等非粘附条件下在培养基中 培养细胞团聚体。
[0101] 用于悬浮培养的细胞培养容器不特别限制，只要其使得能够悬浮培养细胞即可。 运样的细胞培养容器的实例包括烧瓶、组织培养烧瓶、盘、培养皿、组织培养盘、多皿 (multidish)、微板、微孔板、微孔（micropore)、多板（multiplate)、多孔板、室载玻片 (chamber slide)、碗(schale)、试管、浅盘、培养袋、转瓶等。优选的容器是细胞非粘附性容 器。
[0102] 作为细胞非粘附性容器，可W使用表面未人工处理成提高细胞粘附性(例如，利用 细胞外基质的包被处理等）的容器等。作为细胞非粘附性容器，可W使用表面被人工处理成 降低对细胞的粘附性(例如，超疏水处理)的容器等。
[0103] 本发明的干细胞制备方法1是用于产生由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干细胞 的方法，所述方法包括下述步骤(1)或步骤(2)或两者：
[0104] (1)悬浮培养获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体 的细胞由此获得视网膜球体的步骤;和
[0105] (2)从获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞 收集SSEA-1阳性细胞的步骤。
[0106] 本发明中的"由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干细胞"存在于由多能干细胞诱 导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体中，并且具有分化成视网膜细胞(如光感受器 细胞）的潜能和自我复制能力。上述睫状缘区干细胞是SSEA-1阳性的，Rax基因阳性的， Chx 10基因阳性的，R化10基因阳性的，Otx 1基因阳性的，Crx基因阴性的，和的-微管蛋白 (Tujl)基因阴性的。睫状缘区干细胞是非色素沉积细胞。睫状缘区中的此类干细胞可用作 用于评价化学物质的毒性或药效等的试剂、或用于目的在于细胞治疗的检测或治疗等的物 质。
[0107] SSEA-U阶段特异性胚胎抗原1)是细胞表达的抗原，也称为CD15或Lewis X化eX)。 有时SSEA-1表达在细胞表面上。
[010引本发明中的"SSEA-1阳性细胞'是在其中检测到SSEA-1表达的细胞。
[0109] 多能干细胞的实例包括灵长类动物多能干细胞，更具体地，人多能干细胞。多能干 细胞的实例包括胚胎干细胞和人造多能干细胞。
[0110] 在本发明的干细胞制备方法1的步骤（1)和步骤(2)中所用的"由多能干细胞诱导 分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"可W例如通过下述方法制备：
[0111] 制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的方法，所述方法包括W下步骤:在各自 含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养 基中，仅在表达RPE65基因的细胞出现前的一段时间，培养包含视网膜组织的细胞团聚体， 其中化xlO阳性细胞W所述组织的20% W上至100% W下的比例存在，然后在各自不含作用 于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养所得的"表达RPE65基因的细 胞不在其中出现的细胞团聚体"（W下有时称为本发明的细胞团聚体制备方法1)。
[0112] 在本发明的细胞团聚体制备方法1中用作起始材料的"包含视网膜组织的细胞团 聚体"是运样的细胞团聚体，其中在视网膜组织中化xlO阳性细胞W所述组织的20% W上至 100 % W下的比例存在。前述乂hx 10阳性细胞的比例"，例如，优选为40 % W上，更优选60 % 社。
[0113] 前述"包含视网膜组织的细胞团聚体"可W例如由多能干细胞（优选人多能干细 胞)制备。
[0114] 作为制备上述"包含视网膜组织的细胞团聚体"的方法，例如，可W提及包括下述 步骤(A)和(B)的方法：
[0115] (A)将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养W形成多能干细胞的团聚体的 步骤，和
[0116] (B)将步骤(A)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径 的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮 培养W得到包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体的步骤。
[0117] 说明通过在无血清培养基中悬浮培养多能干细胞形成多能干细胞的团聚体的步 骤(A)。
[0118] 用于步骤(A)的无血清培养基不特别受限，只要其是如上文所述的。例如，可W提 及补充有适量的可商购的血清代替物如KSR等的无血清培养基(例如，补充有10%KSR、45化 M 1--硫代甘油和lx化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM和F-12的1:1混合物的培养基）。在 人ES细胞的情形中，添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1%至约20%，优选约2%至 约 20 %。
[0119] 步骤(A)中的培养条件，如培养溫度、0)2浓度等可W适当确定。培养溫度例如是约 30°C至约40°C，优选约37°C。C〇2浓度例如是约1 %至约10%，优选约5%。
[0120] 步骤(A)中多能干细胞的浓度可W确定为适于更均匀和有效地形成多能干细胞的 团聚体。例如，当使用96孔微孔板对人ES细胞进行悬浮培养时，将制备为每孔约IX 103至约 1 X 105个细胞，优选约3 X 103至约5 X 104个细胞，更优选约5 X 103至约3 X 104个细胞，最优选 约1.2 X 104个细胞的液体加入孔中，并且将板静置W形成细胞团聚体。
[0121] 形成细胞团聚体所需的悬浮培养时间可W根据使用的多能干细胞酌情确定，W使 细胞可W均匀聚集。为了形成均匀的细胞团聚体，希望其尽可能短。例如，在人ES细胞的情 况下，团聚体优选在约24hr内，更优选在约12hr内形成。细胞团聚体形成所需的时间可W通 过控制用于聚集细胞的工具、离屯、条件等适当调节。
[0122] 说明用于通过将步骤(A)中形成的细胞团聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog 信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养 基中悬浮培养获得包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体的步骤(B)。
[0123] 用于步骤(B)的培养基是未补充作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而补 充有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基，其不需要加入基底 膜制剂。
[0124] 用于运样的培养基的无血清培养基或含血清培养基不特别受限，只要其是如上文 所述的即可。例如，可W提及补充有适量的可商购的血清代替物如KSR等的无血清培养基 (例如，补充有10%KSR、450iiM 1--硫代甘油和lx化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM和F- 12的1:1混合物的培养基）。在人ES细胞的情况下，加入无血清培养基中的KSR的量通常是约 1 %至约20 %，优选约2 %至约20 %。
[0125] 作为用于步骤(B)中的无血清培养基，可W直接使用用于步骤(A)的无血清培养 基，或可W用新鲜无血清培养基替代。当将用于步骤(A)的无血清培养基直接用于步骤(B) 时，可W将作用于BMP信号转导途径的物质加入至所述培养基。
[01%]作用于Sonic hedgehog(下文有时表示为化h)信号转导途径的物质是能够增强 S化介导的信号转导的物质。作用于ah信号转导途径的物质的实例包括属于化dgehog家族 的蛋白（例如，化h)、S化受体、S化受体激动剂、化rmo巧hamine或SAG等。
[0127] 作用于BMP信号转导途径的物质的实例包括BMP蛋白如BMP2、BMP4、BMP7等，GDF蛋 白如GDF7等，抗-BMP受体抗体，BMP部分肤等。BMP2蛋白、BMP4蛋白和BMP7蛋白可从例如R&D Systems获得，并且GDF7蛋白可从例如Wako 化re Qiemical Industries,Ltd获得。
[0128] 作用于BMP信号转导途径的物质的浓度仅需要是可W诱导形成多能干细胞的团聚 体的细胞向视网膜细胞分化的浓度。例如，在BMP4的情况下，将其加入至培养基中至约 0.0 lnM至约化M，优选约0.1 nM至约lOOnM，更优选约1.5nM的浓度。
[0129] 作用于BMP信号转导途径的物质仅需要在步骤(A)中的悬浮培养开始约24小时后 加入，并且可W在自悬浮培养开始起的数天内（例如，15天内）加入至培养基。优选地，作用 于BMP信号转导途径的物质在自悬浮培养开始起的第1天至第15天，更优选第1天至第9天， 更优选第6天加入至培养基中。
[0130] 在将作用于BMP信号转导途径的物质加入至培养基后，W及在形成多能干细胞的 团聚体的细胞向视网膜细胞的分化诱导开始后，不需要向培养基中添加作用于BMP信号转 导途径的物质，并且培养基可W用各自不含作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养 基或含血清培养基替换。W此方式，培养基的成本可W被遏制。开始向视网膜细胞分化诱导 的细胞可W通过例如检测细胞中Rax基因的表达来确认。对通过使用在Rax基因基因座中敲 入有巧光报告蛋白基因如GFP等的多能干细胞在步骤(A)中形成的细胞团聚体在作用于BMP 信号转导途径的物质W分化诱导为视网膜细胞所需的浓度存在的情况下进行悬浮培养，并 且检测从表达的巧光报告蛋白发出的巧光，从而可W检验开始分化诱导为视网膜细胞的时 间。步骤(B)的一个实施方案是运样的步骤，其用于通过将步骤(A)中形成的细胞团聚体在 各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有分化诱导为视网膜细胞所需 浓度的作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养，直至 表达Rax基因的细胞开始出现，而获得包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体。
[0131] 步骤(B)中的培养条件如培养溫度、0)2浓度等可W适当确定。培养溫度例如是约 30°C至约40°C，优选约37°C。C〇2浓度例如是约1 %至约10%，优选约5%。
[0132] 获得包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体可W通过例如检测表达Rax或PAX6(其是 视网膜先祖细胞标志物）的细胞在团聚体中的存在来检验。通过包括上述步骤(A)和(B)的 方法获得的"包含视网膜先祖细胞的细胞团聚体"可W用作"包含视网膜组织的细胞团聚 体"作为本发明的细胞团聚体制备方法1中的起始材料。
[0133] 用作本发明的细胞团聚体制备方法1中的起始材料的"包含视网膜组织的细胞团 聚体"也可W专口制备，例如，通过包括下述步骤(C)、（D)和化)的方法制备：
[0134] (C)将多能干细胞在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中进行悬浮培 养W形成多能干细胞的团聚体的步骤，
[0135] (D)将步骤(C)中形成的细胞团聚体在含有基底膜制剂的无血清培养基中进行悬 浮培养的步骤，和
[0136] 化)将步骤(D)中培养的细胞团聚体在含血清培养基中进行悬浮培养的步骤。
[0137] 用于步骤(C)的抑制Wnt信号途径的物质不特别刻良，只要其可W抑制Wnt介导的 信号转导即可。抑制Wnt信号途径的物质的实例包括DkkUCerberus蛋白、Wnt受体抑制剂、 可溶型Wnt受体、Wnt抗体、酪蛋白激酶抑制剂、显性阴性Wnt蛋白、CKI-7 (N-( 2-氨基乙基)- 5-氯-异哇嘟-8-横酷胺）、D4476(4-{4-(2,3-二氨苯并[1,4]二P恶英-6-基)-5-11比晚-2-基- 1H-咪挫-2-基}苯甲酯胺）、IWR-1-endo(IWRle)、IWP-2等。抑制Wnt信号途径的物质的浓度 仅需要是可W形成多能干细胞的团聚体的浓度。例如，常见抑制Wnt信号途径的物质如 IWR1 e W约0.1咖至约100咖，优选约1咖至约10咖，更优选约化M的浓度加入。
[0138] 可W在悬浮培养开始前将抑制Wnt信号途径的物质加入至无血清培养基，或在自 悬浮培养开始起的数天内（例如，5天内）加入至无血清培养基。优选地，在自悬浮培养开始 起的5天内，更优选在3天内，最优选在悬浮培养开始的同时将抑制Wnt信号途径的物质加入 至无血清培养基中。此外，在添加抑制Wnt信号途径的物质的情况下进行悬浮培养直至自悬 浮培养开始起的第18天，更优选第12天。
[0139] 步骤(C)中的培养条件，如培养溫度和C〇2浓度可W适当确定。虽然培养溫度不受 特别限制，但是其例如是约30°C至约40°C，优选约37°C。0)2浓度例如是约1 %至约10%，优 选约5 %。
[0140] 步骤(C)中多能干细胞的浓度可W由本领域技术人员酌情确定W更均匀和有效地 形成多能干细胞的团聚体。形成细胞团聚体时的多能干细胞的浓度不特别受限，只要其允 许形成干细胞的均匀团聚体即可。例如，当使用96孔微孔板对人ES细胞进行悬浮培养时，加 入被制备成每孔约1 X 103至约5 X 104个细胞，优选约3 X 103个细胞至约3 X 104个细胞，更优 选约5 X103个细胞至约2 X104个细胞，最优选约9 X103个细胞的液体，并且将板静置W形成 细胞团聚体。
[0141] 形成细胞团聚体所需的悬浮培养时间可W根据使用的多能干细胞酌情确定，只要 所述细胞可W快速聚集即可。为了形成均匀的细胞团聚体，希望其尽可能短。例如，在人ES 细胞的情况下，希望细胞团聚体优选在24hr内，更优选在12虹内形成。细胞团聚体形成所需 的时间可W由本领域普通技术人员通过控制用于聚集细胞的工具、离屯、条件等适当调节。
[0142] 用于步骤(D)的基底膜制剂是指运样的制剂，其含有与上皮细胞的那些类似的具 有控制细胞形态、分化、生长、运动、功能表达等的功能的基底膜构成成分（当在其上铺板并 培养能够形成基底膜的目的细胞时）。本文中，"基底膜构成成分"是指在动物组织中在上皮 细胞层和间质细胞层之间存在的薄膜形态的胞外基质分子等。基底膜制剂可W通过例如利 用能够溶解细胞的脂质的溶液、碱溶液等移除经由基底膜附着在支持物上的能够形成基底 膜的细胞制备。优选的基底膜制剂的实例包括可作为基底膜成分商购的产品（例如， Matrigel?(由Becton,Dickinson and Company生产：下文中，有时称为Matrigel))，和已知 为基底膜成分的胞外基质分子(例如，层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酷肝素蛋白聚糖 (heparan sulfate proteoglycan)、巢蛋白等）。
[0143] Matrigel?是由来源于化ge化reth Holm Swarn化服）小鼠肉瘤的基底膜制备的产 品。Matrigel?的主要成分是IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酷肝素蛋白聚糖和巢蛋白。 除运些之外，还包含TGF-0、成纤维细胞生长因子(FGF)、组织纤溶酶原激活物和由EHS肿瘤 天然产生的生长因子。Matrigel?的"生长因子减少的(GFR)产品"具有比常规Matrigel?低 的生长因子浓度。在本发明，优选使用GFR产品。
[0144] 虽然步骤(D)中加入至无血清培养基W用于悬浮培养的基底膜制剂的浓度不特别 受限，只要神经组织（例如，视网膜组织）的上皮结构被稳定维持即可，但是例如，当使用 Madigel?时，其优选为培养基的1/20至1/200体积，更优选约1/100体积。虽然可W在开始 培养干细胞时将基底膜制剂加入至培养基，但优选地在自票浮培养开始起的5天内，更优选 在2天内将其加入至无血清培养基。
[0145] 作为用于步骤(D)的无血清培养基，可W直接使用用于步骤(C)的无血清培养基， 或可W用新鲜无血清培养基替代。
[0146] 当将步骤(C)中使用的无血清培养基直接用于步骤(D)时，可W将"基底膜制剂"加 入至所述培养基。
[0147] 步骤(D)中的培养条件，如培养溫度和C〇2浓度可W适当确定。虽然培养溫度不受 特别限制，但其例如是约30°C至约40°C，优选约37°C。C化浓度例如是约1 %至约10%，优选 约5 %。
[0148] 作为要用于步骤化)的含血清培养基，可W使用步骤(D)的培养中使用的无血清培 养基（向其直接加入血清），或用新鲜的含血清培养基替代。
[0149] 在自悬浮培养开始起的第7天或第7天后，更优选在第9天或第9天后，最优选在第 12天加入血清。加入的血清的浓度是约1 %至约30 %，优选约3 %至约20 %，更优选约10 %。
[0150] 在步骤化）中，除血清W外，添加作用于化h信号途径的物质可W提高视网膜组织 的制备效率。
[0151] 作用于化h信号途径的物质不特别受限，只要其可W增强化h介导的信号转导即 可。作用于化h信号途径的物质的实例包括属于化dgehog家族的蛋白（例如，Shh)、S化受体、 SUi受体激动剂、Purmo巧hamine、SAG等。
[0152] 在例如常见的作用于化h信号途径的物质如SAG的情况下，该步骤中使用的作用于 S化信号途径的物质的浓度是约0.1 nM至约lOiiM，优选约lOnM至约化M，更优选约lOOnM。
[0153] 在运样培养的细胞团聚体中，存在覆盖细胞团聚体表面的视网膜组织。视网膜组 织可W通过免疫染色方法等检验。通过上述包括步骤(C)、（D)和化)的方法获得的细胞团聚 体可W用作作为本发明的细胞团聚体制备方法1中的起始材料的"包含视网膜组织的细胞 团聚体"。
[0154] 视网膜组织在通过包括步骤(A)和(B)的上述方法或包括步骤(C)、（D)和化）的上 述方法获得的细胞团聚体中的存在也可W如下检验。例如，将通过上述方法获得的细胞团 聚体在含血清培养基中进行悬浮培养。用于悬浮培养的细胞培养容器的实例包括上述那 些。培养条件，如悬浮培养的培养溫度、0)2浓度和化浓度可W适当确定。尽管培养溫度不特 别受限，其例如是约30°C至约40°C。0)2浓度例如是约1 %至约10%。〇2浓度例如是约20%至 约70 %。尽管培养时间不特别限制，其通常是4她r W上，优选7天W上。
[0155] 完成悬浮培养后，将细胞团聚体用固定剂如多聚甲醒溶液固定，并且制备冷冻切 片。将获得的冷冻切片免疫染色，并且检验每种分化谱系的视网膜细胞(光感受器、水平细 胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞）的存在。将获得的冷冻切片免疫染色，并且 检验视网膜组织的层结构的形成。因为视网膜组织的各个层由不同视网膜先祖细胞(光感 受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞)构成，所W层结构的形成可W 通过使用针对表达在运些细胞中的上述标志物的抗体的免疫染色来检验。
[0156] 在如上述制备的细胞团聚体中含有的视网膜组织中的乂 hxlO阳性细胞的比例"可 w通过例如w下方法检查。
[0157] (1)首先，制备"包含视网膜组织的细胞团聚体"的冷冻切片。
[0158] (2)然后，进行Rax蛋白的免疫染色。当使用通过将表达Rax基因的细胞改变成表达 巧光蛋白如GFP而获得的基因重组细胞时，使用巧光显微镜等观察上述巧光蛋白的表达。表 达Rax基因的视网膜组织区域在获得的免疫染色图像或巧光显微图像中被指明。
[0159] (3)使用与冷冻切片（其中表达Rax基因的视网膜组织区域已被指明）相同的切片 或相邻切片作为样品，将核用核染色剂如DAPI染色。然后，将上述表达Rax基因的视网膜组 织区域中染色的核的数目计数，从而测量所述视网膜组织区域中所述细胞的数量。
[0160] (4)使用与冷冻切片（其中表达Rax基因的视网膜组织区域已被指明）相同的切片 或相邻切片作为样品，将化xlO蛋白免疫染色。将上述视网膜组织区域中的化xlO阳性细胞 的数量计数。
[0161] (5)基于上述(3)和(4)中测量的各个核数量，将化xlO阳性细胞中核的数量除W上 述表达Rax基因的视网膜组织区域中的核的数量，从而计算"ChxlO阳性细胞的比例"。
[0162] 在本发明的细胞团聚体制备方法1中，首先，仅在表达RPE65基因的细胞出现之前 的一段时间在各自含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培 养基或含血清培养基中培养包含视网膜组织的细胞团聚体，在所述视网膜组织中化xlO阳 性细胞W所述组织的20 % W上和100 % W下的比例存在。
[0163] 作为本文中优选的培养，可W提及悬浮培养。
[0164] 作为无血清培养基，可W提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的无血清培养基。 更具体地，可W提及作为补充有N2补充物(N2，Invi化ogen)的DMEM/F-12培养基的无血清培 养基。作为含血清培养基，可W提及作为补充有胎牛血清的基础培养基的含血清培养基。
[0165] 培养条件，如培养溫度、0)2浓度可W适当设置。培养溫度例如是在约30°C至约40 °C的范围内，优选例如约3 7 °C。C0 2浓度例如是在约1 %至约10 %的范围内，优选例如约5 %。
[0166] 当在培养基中培养上述"包含视网膜组织的细胞团聚体"时，无血清培养基或含血 清培养基中含有的作用于Wnt信号途径的物质不特别受限，只要其可W增强Wnt介导的信号 转导即可。作用于Wnt信号途径的物质的具体实例包括属于Wnt家族的蛋白（例如，Wntl、 胖11133、￥11173)、￥111受体、￥111受体激动剂、651(30抑制剂（例如，6-漠說玉红-3'-目亏（81〇)、 CHIR99021、Ke 吨 aul lone)等。
[0167] 在常见的作用于Wnt信号途径的物质如CHIR99021的情况下，包含在无血清培养基 或含血清培养基中的作用于Wnt信号途径的物质的浓度例如在约O.liiM至约lOOiiM的范围 内，优选例如在约化M至约30yM的范围内，更优选例如为约化M。
[0168] 当在培养基中培养上述"包含视网膜组织的细胞团聚体"时，无血清培养基或含血 清培养基中含有的抑制FGF信号途径的物质不受特别限制，只要其可W抑制FGF介导的信号 转导即可。抑制FGF信号途径的物质的实例包括FGF受体、FGF受体抑制剂（例如，SU-540 2、 AZD4547、BGJ398)、MAP激酶级联抑制性物质（例如，M邸抑制剂、MAPK抑制剂、ERK抑制剂）、 PI3激酶抑制剂、Akt抑制剂等。
[0169] 无血清培养基或含血清培养基中含有的抑制FGF信号途径的物质的浓度仅需要是 可W诱导形成多能干细胞的团聚体的细胞向视网膜细胞分化的浓度。例如，在SU-5402的情 况下，将其加入至培养基中至约0.化M至约10化M，优选约化M至约30础，更优选约扣M的浓 度。
[0170] 本发明的细胞团聚体制备方法1中的"仅在表达RPE65基因的细胞出现前培养一段 时间"意为在表达RPE65基因的细胞出现前的整个时间或部分时间进行培养。即，在整个时 间或部分时间（任意时间）（在此期间，培养系统中的"包含视网膜组织的细胞团聚体"由基 本上不表达RPE65基因的细胞构成）的培养是足够的。通过使用运样的培养，可W获得表达 RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体/'表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细 胞团聚体"包括"表达RPE65基因的细胞根本不在其中出现的细胞团聚体"和"表达RPE65基 因的细胞基本上不在其中出现的细胞团聚体"。作为"表达RPE65基因的细胞基本上不在其 中出现的细胞团聚体"，可W提及在细胞团聚体中含有的视网膜组织中W约1%W下的比例 含有RPE65阳性细胞的细胞团聚体。
[0171] 为了确定运样的具体时间，"包含视网膜组织的细胞团聚体"用作样品，并且存在 或不存在样品中含有的RPE65基因的表达仅需要通过通常的基因工程方法或生化方法测 量。具体而言，例如，是否存在RPE65基因的表达或其水平可W通过对上述"包含视网膜组织 的细胞团聚体"的冷冻切片进行使用抗RPE65蛋白抗体的免疫染色方法来检查。
[0172] "在表达RPE65基因的细胞出现前的一段时间"例如是运样的一段时间，在其期间 上述视网膜组织中存在的化xlO阳性细胞的比例比在开始在各自含有作用于Wnt信号途径 的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养上述细胞团聚体 时减小，并且落在30%至0%的范围内。"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚 体"是运样的细胞团聚体，其中化xlO阳性细胞W上述视网膜组织的30%至0%内的比例存 在于所述组织中。
[0173] 虽然"在表达RPE65基因的细胞出现前的一段时间"的天数根据作用于Wnt信号途 径的物质和抑制FGF信号途径的物质的类型，无血清培养基或含血清培养基的类型，其他培 养条件等而变化，但其例如是在14天内。更具体地，当使用无血清培养基(例如，运样的无血 清培养基，其是补充有N2的基础培养基)时，上述时间优选例如是在10天内，更优选例如3天 至6天。当使用含血清培养基(例如，运样的含血清培养基，其是补充有胎牛血清的基础培养 基)时，上述时期优选例如在12天内，更优选例如6天至9天。
[0174] 然后将通过如上所述的培养获得的"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞 团聚体"在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养。
[0175] 作为本文中优选的培养，可W提及悬浮培养。
[0176] 作为无血清培养基，可W提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的培养基。作为含 血清培养基，可W提及作为补充有胎牛血清的基础培养基的培养基。更具体地，可W提及作 为补充有胎牛血清的DMEM/F-12培养基的含血清培养基。
[0177] 上述无血清培养基或含血清培养基可W含有已知的生长因子、促进生长的添加剂 和化学物质等。已知的生长因子的实例包括66。、。6。、16。、膜岛素等。促进生长的添加剂的 实例包括N2补充物(N2，Invi化ogen)、B2巧h充物（Invitrogen)、KSR等。促进生长的化学物 质的实例包括类视黄醇(例如，视黄酸)和牛横酸。
[0178] 优选的培养期例如是运样的培养期，其间存在于上述视网膜组织中的化xlO阳性 细胞的比例比在开始在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养 基中培养上述细胞团聚体时增加，并且达到30% W上。
[0179] 培养条件如培养溫度、0)2浓度可W适当设置。培养溫度例如是在约30°C至约40°C 的范围内，优选例如约3 7 °C。CO 2浓度例如是在约1 %至约10 %的范围内，优选例如约5 %。
[0180] 虽然直至获得"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"的上述培养天数根据无血清 培养基或含血清培养基的类型，其他培养条件等而改变，但其例如是在100天内。上述培养 天数优选为例如20天至70天，更优选例如30天至60天。
[0181] 在如上述产生的"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"中，视网膜色素上皮和视网 膜组织(具体地，神经视网膜)与相同细胞团聚体中的睫状缘区样结构邻近地存在。所述结 构可W通过显微观察等检验。具体地，例如，当细胞团聚体由其中GFP基因被敲入Rax基因座 (RAX: : GFP敲入细胞）的多能干细胞产生时，神经视网膜(其是RAX: : GFP强阳性区）、视网膜 色素上皮(其是运样的上皮组织，其中用透射光可W观察到色素沉着)和在神经视网膜和视 网膜色素上皮之间的边界区域中并且具有特征结构的睫状缘区样结构的存在可W通过使 用巧光立体显微镜(例如，Olympus公司生产的SZX16)来检验。
[0182] 在按上述产生的"包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"中，在两个神经视网膜组织 之间的区域中形成睫状缘区样结构。即，有时形成连续含有神经视网膜组织、睫状缘区样结 构和另一神经视网膜组织的组织。在该情况下，睫状缘区样结构的存在可W通过显微观察 检验，因为睫状缘区样结构的特征是比相邻神经视网膜组织更薄。
[0183] 用于本发明的干细胞制备方法1的步骤（1)和步骤(2)中的"由多能干细胞诱导分 化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"例如还可W通过专利文献1所述的下述方法制备 (W下有时称为本发明的细胞团聚体制备方法2):
[0184] 制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的方法，所述方法包括W下步骤:仅在出 现表达RPE65基因的细胞之前的一段时间，在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清 培养基或含血清培养基中，培养包含视网膜组织的细胞团聚体，其中化xlO阳性细胞W所述 组织的20% W上的比例存在，然后在各自不含作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基 或含血清培养基中培养所得到的"表达RPE65基因的细胞不在其中出现的细胞团聚体"。
[0185] 在本发明的细胞团聚体制备方法2中用作起始材料的"包含视网膜组织的细胞团 聚体"是运样的细胞团聚体，其中化xlO阳性细胞在视网膜组织中W所述组织的20% W上的 比例存在。前述乂hx 10阳性细胞的比例"，例如，优选为40 % W上，更优选60 % W上。作为所 述"包含视网膜组织的细胞团聚体"的制备方法，可W提及W上作为本发明的细胞团聚体制 备方法1的起始材料的制备方法提及的包括步骤(A)和(B)的方法，或包括步骤(C)、（D)和 化)的方法。
[0186] 在本发明的干细胞制备方法1的步骤（1)中，对按照上述制备的获得自"由多能干 细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"的细胞进行悬浮培养并且获得视网膜 球体。
[0187] 获得自"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"的细胞的 实例包括通过分散上述"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"得 到的细胞，通过分散由前述细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞和通过分散由前 述细胞团聚体收集的细胞得到的细胞。当对所述细胞在存在生长因子等的条件下W低密度 进行悬浮培养时，可W形成源自一个细胞或少量细胞（如2-约10个细胞）的球形细胞团聚 体，即，视网膜球体。
[0188] 从"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"分离睫状缘区 样结构的方法的实例包括在显微镜下用精细綴子、解剖刀等解剖的方法。例如，可W通过前 述方法检验睫状缘区样结构在"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚 体"中的存在。使用从"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"切下 的睫状缘区样结构，可W增加在开始悬浮培养时细胞中睫状缘区干细胞的含量。
[0189] 作为从"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"收集细胞 的方法，可W提及W下提及的步骤(2)中进行的用于收集SSEA-1阳性细胞的方法。
[0190] 分散细胞团聚体、睫状缘区样结构或细胞的方法的实例包括机械分散处理、细胞 分散处理和细胞保护剂加入处理。运些处理可W组合进行。优选地，进行细胞分散处理，然 后进行机械分散处理。
[0191]作为机械分散处理的方法，可W提及吹吸处理(pipetting treatment)。
[0192] 作为用于细胞分散处理的细胞分散液，可W提及包含酶(诸如膜蛋白酶、胶原酶、 透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等)和馨合剂(诸如乙二胺四乙酸等）的 溶液。优选地，使用膜蛋白酶、木瓜蛋白酶或胶原酶，更优选地，使用木瓜蛋白酶。还可W使 用可商购的包含木瓜蛋白酶的细胞分散液。
[0193] 作为用于细胞保护剂添加处理的细胞保护剂，可W提及作用于FGF信号转导途径 的物质、作用于EGF信号转导途径的物质、肝素、抑制ROCK途径的物质、血清和血清替代物。
[0194] 例如，将细胞团聚体、睫状缘区样结构或细胞用包含木瓜蛋白酶的细胞分散液处 理，并且通过吹吸进一步分散。
[0195] 作为用于上文提及的分散的细胞的悬浮培养的培养基，可W提及各自补充有用于 神经细胞培养的添加剂和生长因子的无血清培养基或含血清培养基。优选地，可W提及各 自补充有选自由作用于FGF信号转导途径的物质和作用于EGF信号转导途径的物质组成的 组的一种或多种物质的无血清培养基或含血清培养基。
[0196] 当向上述培养基中加入抑制ROCK途径的物质时，可W提高视网膜球体形成效率。
[0197] 也可W向上述培养基中加入肝素。已知肝素提高作用于FGF信号转导途径的物质 和作用于EGF信号转导途径的物质的效果。
[019引用于上述悬浮培养的作用于FGF信号转导途径的物质的实例包括FGF1、FGF2、FGF4 和FGF10。用作作用于FGF信号转导途径的物质的FGF2(bFGF)的浓度为，例如，约Ing/ml至约 200ng/ml，优选地约5ng/ml至约lOOng/ml，更优选地约lOng/ml至约50ng/ml。
[0199] 作用于EGF信号转导途径的物质的实例包括EGF、TGF-a和皿-EGF。用作作用于EGF 信号转导途径的物质的EGF的浓度为，例如，约Ing/ml至约lOOng/ml，优选地约5ng/ml至约 50ng/ml，更优选地约 lOng/ml至约40ng/ml。
[0200] 抑制ROCK途径的物质是能够抑制由化0激酶介导的信号的物质。抑制ROCK途径的 物质的实例包括Y-27632和法舒地尔(Fasudil)。作为抑制ROCK途径的物质加入的Y-27632 的浓度是，例如，约0.01咖至约1 〇〇咖，优选地约化M至约30咖，更优选地约10咖。
[0201] 步骤(1)中的悬浮培养中铺板的细胞数目是，例如，约IxlO2个细胞/ml至约IxlO6个 细胞/ml,优选地约IxlO3个细胞/ml至约5xl05个细胞/ml,更优选地约5xl0 3个细胞/ml至约 IxlO5个细胞/ml。
[0202] 用于上述悬浮培养的培养材料优选是平底低粘附性培养材料。
[0203] 运样形成的视网膜球体包含自我复制的睫状缘区干细胞。当在开始悬浮培养时细 胞包含很多干细胞时，可W形成的视网膜球体的数目变高。当在悬浮培养开始时细胞中包 含的干细胞具有高自我复制能力时，可W形成的视网膜球体的尺寸(例如，直径)变大。所形 成的视网膜球体可W通过与适当的因子反应分化成视网膜层特异性神经元。
[0204] 在本发明的干细胞制备方法1的步骤(2)中，从获得自如上所述制备的"由多能干 细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"的细胞收集SSEA-1阳性细胞。
[0205] 获得自"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"的细胞的 实例包括通过分散上述"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"得 到的细胞，通过分散从上述细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞，和通过分散由 上述细胞团聚体或睫状缘区样结构形成的视网膜球体得到的细胞。从运些细胞收集SSEA-1 阳性细胞。
[0206] 从"由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体"分离睫状缘区 样结构的方法可W与在前述步骤(1)中进行的方法相似。
[0207] 作为由上述细胞团聚体或睫状缘区样结构形成视网膜球体的方法，可W提及包括 前述步骤(1)中的细胞悬浮培养的方法。
[0208] 作为分散细胞团聚体、睫状缘区样结构或视网膜球体的方法，可W提及前述步骤 (1)中的分散处理。
[0209] 可W提及用于收集SSEA-1阳性细胞的方法、使用流式细胞仪的方法和使用磁力的 方法。使用流式细胞仪的方法的实例包括运样的方法，所述方法包括用巧光标记的抗- SSEA-1抗体标记SSEA-1阳性细胞，并且通过流式细胞仪选择和收集细胞。使用磁力的方法 的实例包括运样的方法，所述方法包括用磁化的抗-SSEA-1抗体标记SSEA-1阳性细胞，并且 通过磁力细胞分离装置(MACS)选择和收集细胞。
[0210] 作为抗-SSEA-1抗体，也可W使用任意抗体，只要其识别SSEA-1抗原即可。也可W 使用可商购的抗-S SEA-1抗体，诸如畑em i C on的抗-S SEA-1抗体，BD的抗-S SEA-1抗体， MiItenyi Biotec的抗-SSEA-1 抗体等。
[0別。当要分离SSEA-1阳性细胞时，除了SSEA-1阳性外，还可W通过使用Rax阳性或不存 在色素沉着作为指标来进行分离。
[0212] 运样收集的SSEA-1阳性细胞级分包含睫状缘区干细胞。通过将细胞与适当的因子 反应，所收集的SSEA-1阳性细胞级分可W分化成视网膜层特异性神经元。
[0213] 在本发明的干细胞制备方法2中，进行本发明的干细胞制备方法1的步骤（1)。在本 发明的干细胞制备方法2中，作为"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的 细胞团聚体的细胞"，使用通过分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞 团聚体得到的细胞，或通过分散由细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞。
[0214] 目P，本发明的干细胞制备方法2是用于产生由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干 细胞的方法，所述方法包括进行悬浮培养通过W下方式获得的细胞的步骤：
[0215] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0216] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构，由此形成视网膜球体。
[0217] 在本发明的干细胞制备方法3中，进行本发明的干细胞制备方法1的步骤(2)。在本 发明的干细胞制备方法3中，作为"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的 细胞团聚体的细胞"，使用通过分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞 团聚体得到的细胞，或通过分散由细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞。
[0218] 目P，本发明的干细胞制备方法3是用于产生由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干 细胞的方法，所述方法包括进行从通过W下方式获得的细胞收集SSEA-1阳性细胞的步骤：
[0219] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0220] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构。
[0221] 在本发明的干细胞制备方法4中，进行本发明的干细胞制备方法1的步骤（1)，接着 进行步骤(2)。作为步骤（1)中的"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的 细胞团聚体的细胞"，使用通过分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞 团聚体得到的细胞，或通过分散由细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞。作为步 骤(2)中的"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"， 使用通过分散步骤(1)中得到的视网膜球体而得到的细胞。
[0222] 目P，本发明的干细胞制备方法4是用于产生由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干 细胞的方法，所述方法包括进行下述：
[0223] (1)悬浮培养通过W下方式得到的细胞的步骤：
[0224] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0225] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构，由此获得视网膜球体;和
[0226] (2)从通过分散通过步骤（1)得到的视网膜球体而得到的细胞收集SSEA-1阳性细 胞的步骤。
[0227] 在本发明的干细胞制备方法5中，进行本发明的干细胞制备方法1的步骤(2)，接着 进行步骤（1)。作为步骤(2)中的"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的 细胞团聚体的细胞"，使用通过分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞 团聚体得到的细胞，或通过分散由细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞。作为步 骤（1)中的"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"， 使用通过分散步骤(2)中收集的细胞而得到的细胞。
[0228] 目P，本发明的干细胞制备方法5是用于产生由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干 细胞的方法，所述方法包括进行从通过W下方式得到的细胞收集SSEA-1阳性细胞的步骤：
[0229] 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或
[0230] 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构，和
[0231] 悬浮培养通过分散在前述步骤中收集的细胞而得到的细胞的步骤，由此得到视网 膜球体。
[0232] 通过本发明的干细胞制备方法1-5中的任一种方法下有时称为本发明的干细 胞制备方法)得到的视网膜球体或SSEA-1阳性细胞级分可W用作包含高比例的睫状缘区干 细胞的细胞群体。
[0233] 可W通过在存在选自由抑制Notch信号的物质、类视黄醇和牛横酸组成的组的一 种或多种物质的条件下培养由本发明的干细胞制备方法得到的睫状缘区干细胞而产生视 网膜层特异性神经元。
[0234] 睫状缘区干细胞的实例包括在通过本发明的干细胞制备方法得到的视网膜球体 中包含的睫状缘区干细胞和在通过本发明的干细胞制备方法得到的SSEA-1阳性细胞级分 中包含的睫状缘区干细胞。
[0235] 例如，在适于神经元分化的条件下培育前述视网膜球体或前述SSEA-1阳性细胞级 分。通过分散前述视网膜球体或前述SSEA-1阳性细胞级分得到的细胞可W相似地进行培 养。
[0236] 作为用于所述培养的培养基，可W提及各自含有一种或多种选自由抑制Notch信 号的物质、类视黄醇和牛横酸组成的组的物质的含血清培养基或无血清培养基。例如，可W 将前述视网膜球体、前述SSEA-1阳性细胞级分或通过分散它们得到的细胞在各自补充有一 种或多种选自由作用于FGF信号转导途径的物质和作用于EGF信号转导途径的物质组成的 组的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养给定的时间，并且在各自补充有一种或多 种选自由抑制Notch信号的物质、类视黄醇和牛横酸组成的组的物质的无血清培养基或含 血清培养基中培养。运些培养基可W适当地包含添加剂如B2巧h充剂（Invitrogen)。
[0237] 此处，"抑制Notch信号的物质"可W是任意物质，只要其抑制Notch信号的活性即 可，并且例如可W提及T-分泌酶抑制性物质，Notch受体抑制性物质，D11抑制性物质和化S 抑制性物质。作为前述丫-分泌酶抑制性物质，可W提及DAPT(N-[N-(3,5-二氣苯乙酷基)- 心丙氨酷]-S-苯基甘氨酸叔下基醋）。当使用DAPT作为抑制Notch信号的物质时，例如，其被 添加至约O.OlyM至约1〇〇咖的浓度。
[0238] 作为用于培养睫状缘区干细胞的培养材料，可W提及悬浮培养材料和贴壁培养材 料。作为贴壁培养的培养皿的涂层材料，可W提及聚-D-赖氨酸、聚-k赖氨酸、聚鸟氨酸、层 粘连蛋白、巢蛋白、Matrigel或明胶。
[0239] 例如，在37°C，5%的C〇2浓度和20 %-40 %的氧浓度，培养睫状缘区干细胞。
[0240] 例如，可W通过检验细胞标志物的表达来检验通过上述培养得到的细胞是否包含 视网膜层特异性神经元。
[0241] 本发明还包括通过本发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经 元作为用于评价毒性或药效的试剂的用途，通过本发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视 网膜层特异性神经元作为移植用生物材料的用途等。
[0242] 通过本发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元可W用于筛 选用于由视网膜细胞障碍导致的疾病的治疗药物，用于研究疾病的材料或药物发现材料。 在化学物质等的毒性或药效的评价中，通过本发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜 层特异性神经元还用于毒性(诸如光毒性、神经毒性等)研究、毒性检测等。例如，将通过本 发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元与测试物质接触，并且测定所 述物质对所述细胞的影响，基于此来评价所述物质的毒性或药效。
[0243] 通过本发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元可W用作移 植用生物材料，所述移植用生物材料用于补充处于细胞损伤状态的患病组织本身(例如，用 于移植手术)等。例如，将有效量的通过本发明的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特 异性神经元移植入需要移植的受试者，从而治疗视网膜组织障碍导致的疾病。
[实施例]
[0244] W下通过参考实施例更详细地说明本发明，所述实施例不被认为是限制性的。
[0245] 实施例1:由多能干细胞制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体
[0246] 将敲入 RAX: :GFP 的人 ES 细胞（来源于趾 ES-l;Nakano，T.等人 Cell Stem Cell 2012,10(6) ,771-785)根据 "Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, 2006,103( 25) ,9554-9559"和 "Nat.Biotech. ,2007，25,681-686"中描述的方法培养。作为培养基，使用补充有20%KSR 化nockout Serum? Replacement; InvitrogenKO.lmM 2-琉基乙醇，2mM k谷氨酷胺，lx非 必需氨基酸和8ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Sigma)。
[0247] 将上述培养的ES细胞单个分散在lYypLE Express(Invitrogen)中，并且使单个分 散的ES细胞悬浮在lOOiil无血清培养基中至非细胞粘附性96孔培养板（SUMIL0N球形板， SUM口0M0 BAKELITE C0.，LTD.)的每个孔中1.2X104个细胞，W允许快速形成团聚体，将其 在37°C，5%C02进行培养。然后使用的无血清培养基是作为补充有10%KSR、450iiM 1--硫 代甘油、lx化学成分确定的脂质浓缩物和Y27632的F-12培养基和IMDM培养基的1:1混 合物的无血清培养基。在自开始悬浮培养起的第6天W1.5nM的终浓度加入BMP4，并且继续 悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基换成不含作用于BMP信号转导途径的物质的上述培 养基。
[0248] 在自悬浮培养开始起的第18天将运样制得的包含视网膜组织的细胞团聚体在补 充有化M CHIR9902U作用于Wnt信号途径的物质)和扣M S呪402(抑制FGF信号途径的物质） 的无血清培养基中培养6天，即，到从悬浮培养开始起的第24天。然后所用的无血清培养基 是作为补充有1%N2补充剂（Invitrogen)的DMEM/F-12培养基的无血清培养基。
[0249] 将在自悬浮培养开始起第24天得到的细胞团聚体在不含作用于Wnt信号途径的物 质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(所述培养基是补充有10%胎牛血清、1%N2 补充剂、〇.5iiM视黄酸和lOOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基）中在40%化条件下进一步悬浮培 养11天，即，至从悬浮培养开始起的第35天，并且在巧光显微镜下观察得到的细胞团聚体。 图1显示了细胞团聚体（自悬浮培养开始起的第35天)的相差图像(A)和GFP巧光图像(B)。发 现在细胞团聚体中形成Rax基因表达阳性的神经视网膜和色素沉积的视网膜色素上皮，并 且在其边缘部分形成了睫状缘区样结构（图中箭头）。
[0250] 实施例2:由多能干细胞制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体
[0251] 将通过实施例1所述的方法制备的单个分散的敲入RAX::GFP的人ES细胞悬浮在 lOOiil无血清培养基中至在非细胞粘附性96孔培养板(SUMIL0N球形板，SUmTOMO BA邸LITE CO.，LTD.)的每个孔中9 X 103个细胞，并且在37°C，5%C〇2悬浮培养。然后所用的无血清培养 基是通过向G-MEM培养基中加入20%KSR、0.1 mM 2-琉基乙醇、ImM丙酬酸、20測Y27632和化 M IWRle(抑制Wnt信号途径的物质）而得到的无血清培养基。在悬浮培养过程中，在从悬浮 培养开始起第2天，加入每体积1/100的量的GFR Matrigel?(BD Biosciences)。在从悬浮培 养开始起第12天，加入每体积1/10的量的胎牛血清和lOOnM SAG(作用于化h信号途径的物 质），并且进行悬浮培养，直至从悬浮培养开始起的第18天。
[0252] 将在自悬浮培养开始起第18天的包含视网膜组织的细胞团聚体在补充了化M CHIR9902U作用于Wnt信号途径的物质）的无血清培养基中悬浮培养2天，即，直至从悬浮培 养开始起的第20天。然后所用的无血清培养基是作为补充了1%N2补充剂（Invitrogen)的 DMEM/F-12培养基的无血清培养基。
[0253] 将在自悬浮培养开始起第20天的细胞团聚体在不含作用于Wnt信号途径的物质的 含血清培养基（作为补充了 10%胎牛血清、1%N2补充剂、0.5iiM视黄酸和lOOiiM牛横酸的 DMEM/F-12培养基的培养基）中在40%化条件下进一步悬浮培养40天，即，直至从悬浮培养 开始起的第60天，并且在巧光显微镜下观察得到的细胞团聚体。图2显示了细胞团聚体（自 悬浮培养开始起的第60天）的相差图像(A)和GFP巧光图像(B)。发现在细胞团聚体中形成 Rax基因表达阳性的神经视网膜和色素沉积的视网膜色素上皮，并且在其边缘部分形成了 睫状缘区样结构（图中箭头）。
[0254] 实施例3:由多能干细胞制备包含睫状缘区样结构的细胞团聚体和标志物表达分 析
[0255] 将通过实施例1所述的方法制备的在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体在 不含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基（作为补充了 10 %胎牛血清，1 %N2补充剂，0.5咖视黄酸，和lOOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基） 中在40%化条件下进一步悬浮培养39天，即，直至自悬浮培养开始起的第63天，并且将在自 悬浮培养开始起的第63天得到的细胞团聚体用4%低聚甲醒固定，W制备冷冻切片。关于制 备的冷冻切片，进行下述的免疫染色：ChxlO(其是一种神经视网膜先祖细胞标志物）（图 3A)，0txl (其是一种睫状缘区标志物）（图3B)，RdhlO(其是一种睫状缘区标志物）（图3C)， 化x(其是一种光感受器细胞标志物）（图3D)，或化J1(其是一种神经细胞(包括神经节细胞） 的标志物）（图3E)。发现在细胞团聚体中形成了化xlO阳性的（图3A)、化XI阳性的（图3B)和 R化10阳性的（图3C)睫状缘区样结构（图中箭头），睫状缘区样结构（图中箭头)是Crx阴性的 (图3D)和化J1阴性的（图3E)。
[0256] 将由在自悬浮培养开始起第63天的细胞团聚体制备的上述冷冻切片针对SSEA-1 进行免疫染色。发现，在上述细胞团聚体中，SSEA-1在睫状缘区样结构中局部表达（图3F)。 在SSEA-1阳性细胞中没有观察到色素沉积。
[0257] 从上述结果，发现在自悬浮培养开始起第63天在上述细胞团聚体中包含的睫状缘 区样结构中存在无色素沉积的化xlO阳性的、Otxl阳性的、R化10阳性的、Crx阴性的、Tujl阴 性的和SSEA-1阳性的细胞。
[0258] 实施例4:从包含睫状缘区样结构的细胞团聚体分离睫状缘区样结构
[0259] 将通过实施例1所述的方法制备的在自悬浮培养开始起第24天的细胞团聚体在不 含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(作为补充了 10% 胎牛血清、1 %N2补充剂、0.5咖视黄酸和lOOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中在 40 %化条件下悬浮培养66天，即，直至从悬浮培养开始起的第90天。在用巧光立体显微镜观 察下，通过使用解剖刀和綴子，从在自悬浮培养开始起的第90天得到的细胞团聚体上分别 切下Rax阳性的神经视网膜区和存在于神经视网膜和视网膜色素上皮的边界部分的睫状缘 区样结构。
[0260] 将得到的神经视网膜区和睫状缘区样结构分别分散在包含木瓜蛋白酶的分散液 (神经细胞分散液，SUM口0M0 BA邸LITE)中，制备细胞悬浮液。在细胞存活的同时，将各细胞 悬浮液用巧光标记的抗-SSEA-1抗体(抗-SSEA1，切3缀合的；Chemicon)免疫染色，并且通过 巧光显微镜观察。将表达的GFP的巧光用作Rax基因表达的指标，并且将在上述抗-SSEA-1抗 体中的切3的巧光用作SSEA-1表达的指标。结果显示在图4中。在上述从神经视网膜区制备 的细胞悬浮液中，Rax阳性的和SSEA-1阴性的细胞的比例为约80 %，Rax阳性的和SSEA-1阳 性的细胞的比例为约10%，Rax阴性的细胞为约10% (图4A，B)。在从睫状缘区样结构制备的 上述细胞悬浮液中，Rax阳性的和SSEA-1阴性的细胞的比例为约30%，Rax阳性的和SSEA-1 阳性的细胞的比例为约50%，Rax阴性的细胞为约20% (图4C，D)。发现可W通过手术从所述 细胞团聚体切下睫状缘区样结构而纯化包含在前述细胞团聚体中的Rax阳性的和SSEA-1阳 性的细胞。
[0261] 实施例5:分析包含在含有睫状缘区样结构的细胞团聚体中的Rax阳性的和SSEA-1 阳性的细胞中的色素沉积
[0262] 通过与实施例4的方法类似的方法，在巧光立体显微镜的观察下，使用解剖刀和綴 子，同时从在自悬浮培养开始起第90天和通过实施例4所述的方法制备的细胞团聚体上切 下视网膜色素上皮和睫状缘区样结构。
[0263] 将得到的视网膜色素上皮和睫状缘区样结构通过与实施例4的方法类似的方法分 散在包含木瓜蛋白酶的分散液中，W产生细胞悬浮液。在细胞存活时，将得到的细胞悬浮液 用巧光标记的抗-SSEA-1抗体(抗-SSEAl，Cy3缀合的；化emicon)免疫染色，并且通过巧光显 微镜观察。结果显示在图5中。在SSEA-1阳性的（图5A，箭头)和Rax阳性的细胞（图5B，箭头） (图5C，箭头）中没有观察到色素沉积。
[0264] 实施例6:由包含睫状缘区样结构的细胞团聚体形成视网膜球体
[0265] 将通过实施例1的方法制备的在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体在不含 作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(作为补充了 10%胎 牛血清、1 % N2补充剂、0.5測视黄酸和1 OOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中在40 % 化条件下进一步悬浮培养39天，即，直至从悬浮培养开始起的第63天。将得到的在自悬浮培 养开始起的第63天的细胞团聚体通过与实施例4的方法类似的方法分散在包含木瓜蛋白酶 的分散液中，W产生细胞悬浮液。将包含在得到的细胞悬浮液中的细胞W lx 105个细胞/ml 的细胞密度在无血清培养基（其是补充了bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素（5iig/ml)、 B27 (50倍稀释）的DMEM/F-12培养基）中悬浮培养10天。结果，形成球形细胞团聚体(视网膜 球体）。发现在自悬浮培养开始起的第63天的上述细胞团聚体包含具有增殖能力的细胞。
[0266] 将得到的视网膜球体用4%低聚甲醒固定，使用GFP的表达作为指标，检验Rax基因 的表达，通过免疫染色检验化xlO和SSEA-1的表达。结果显示在图6中。发现形成前述视网膜 球体的细胞中约90 %是Rax阳性的（图6A)和化X10阳性的（图6B )，即，表达视网膜先祖细胞 标志物和神经视网膜先祖细胞标志物的细胞。上述视网膜球体包含约40%的Rax阳性的（图 6C)和SSEA-1阳性的（图6D)细胞。
[0267] 在上述培养物实例中，由在作为起始材料的上述细胞悬浮液中包含的1至约10个 细胞形成包含约50-500个细胞的视网膜球体。因此，由包含在上述细胞悬浮液中的1至约10 个细胞形成约20-200个Rax阳性的和SSEA-1阳性的细胞。发现，由上述包含睫状缘区样结构 的细胞团聚体得到的细胞的悬浮培养可W有效地产生Rax阳性的和SSEA-1阳性的细胞。
[0268] 实施例7:从由包含睫状缘区样结构的细胞团聚体分离的睫状缘区样结构形成视 网膜球体
[0269] 将通过实施例1所述的方法制备的在自悬浮培养开始起第24天的细胞团聚体在不 含作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(作为补充了 10% 胎牛血清、1 %N2补充剂、0.5咖视黄酸和lOOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中在 40%化条件下进一步悬浮培养46天，即，直至从悬浮培养开始起的第70天。在用巧光立体显 微镜观察下，通过使用解剖刀和綴子，从在自悬浮培养开始起的第70天的细胞团聚体上分 别切下神经视网膜区和睫状缘区样结构。
[0270] 将得到的神经视网膜区和睫状缘区样结构通过与实施例4的方法类似的方法各自 分散在包含木瓜蛋白酶的分散液中，W产生细胞悬浮液。将包含在各细胞悬浮液中的细胞 W1000个细胞/孔(5xl03个细胞/ml)接种在用无血清培养基(其是补充了 bFGF(2化g/ml)、 EGF(20ng/ml)、肝素(5iig/ml)、B27(50-倍稀释的）的DMEM/F-12培养基)低粘附性处理的平 底96孔培养皿（由Nunc制造）中，并且在37°C悬浮培养10天，W形成视网膜球体。发现所形成 的视网膜球体是Rax阳性的（图7B)并且没有色素沉积（图7A)。形成的视网膜球体(原代视网 膜球体)的数目和尺寸(直径)显示在图7C和D中。发现上述神经视网膜区和睫状缘区样结构 包含具有自我复制能力的细胞。与从神经视网膜区（NR)得到的细胞相比，从睫状缘区样结 构（CMZ)得到的细胞表现出更高的视网膜球体形成效率（图7C)。发现与从神经视网膜区 (NR)得到的细胞相比，从睫状缘区样结构(CMZ)得到的细胞具有更大尺寸的形成的视网膜 球体（图7D)。前述由睫状缘区样结构形成的视网膜球体包含Rax阳性的和SSEA-1阳性的细 胞。发现悬浮培养由从上述细胞团聚体分离的睫状缘区样结构得到的细胞可W有效地产生 Rax阳性的和SSEA-1阳性的细胞。
[0271] 制备由通过分散神经视网膜区得到的细胞形成的前述视网膜球体的细胞悬浮液， 和由通过分散睫状缘区样结构得到的细胞形成的上述视网膜球体的细胞悬浮液，并且通过 实施例6所述的方法培养，W形成次生性视网膜球体。形成的视网膜球体的数目和尺寸(直 径）显示在图7E和F中。发现上述原代视网膜球体包含具有自我复制能力的细胞。与源自神 经视网膜区（NR)的细胞相比，源自睫状缘区样结构（CMZ)的细胞表现出更高的次生性视网 膜球体形成效率（图7E)。发现，与从神经视网膜区(NR)得到的细胞相比，从睫状缘区样结构 (CMZ)得到的细胞具有更大尺寸的形成的次生性视网膜球体（图7F)。由源自睫状缘区样结 构的细胞形成的上述次生性视网膜球体包含Rax阳性的和SSEA-1阳性的细胞。发现通过重 复上述视网膜球体形成培养可W扩增Rax阳性和SSEA-1阳性的细胞。
[0272] 实施例8:从由包含睫状缘区样结构的细胞团聚体分离的睫状缘区样结构收集 SSEA-1阳性的细胞
[0273] 将通过实施例1的方法制备的在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体在不含 作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(作为补充了 10%胎 牛血清、1 % N2补充剂、0.5測视黄酸和1 OOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中在40 % 化条件下进一步悬浮培养36天，即，直至从悬浮培养开始起的第60天。从自悬浮培养开始起 的第60天得到的细胞团聚体上切下睫状缘区样结构，通过与实施例4相似的方法分散在包 含木瓜蛋白酶的分散液中，W产生细胞悬浮液。在细胞存活时，将得到的细胞悬浮液用巧光 标记的抗-SSEA-1抗体(SSEA1-APC，由抓制备)免疫染色，并且通过细胞分选仪(ARIA2,由抓 制造)进行FACS分析。结果显示在图8中。发现包含在前述细胞悬浮液中的细胞中约50%是 Rax阳性的和SSEA-1阳性的（图8A)。发现具有约50%的纯度的Rax阳性的和SSEA-1阳性的细 胞可W通过从上述细胞团聚体上切下前述睫状缘区样结构而制备。
[0274] 使用细胞分选仪(ARIA2,由抓制造），可W从上述细胞悬浮液中分离Rax阳性的和 SSEA-1阳性的细胞（图8A，Q2似及Rax阴性的和SSEA-1阳性的细胞（图8A，Q4)。收集Rax阳性 的和SSEA-1阳性的细胞级分(级分1)与Rax阴性的和SSEA-1阳性的细胞级分(级分2)，并且 通过FACS分析。发现，级分1中包含的细胞中有87 %是Rax阳性的和SSEA-1阳性的（图8B)，并 且级分2中包含的细胞中有82 %是Rax阳性的和SSEA-1阴性的（图8C)。发现，可W通过从包 含睫状缘区样结构的细胞团聚体收集前述睫状缘区样结构并且将其分散在其中，并从所得 到的细胞悬浮液中收集SSEA-1阳性细胞而制备具有约87%的纯度的Rax阳性的和SSEA-1阳 性的细胞。
[0275] 实施例9:从由包含睫状缘区样结构的细胞团聚体分离的睫状缘区样结构收集 SSEA-1阳性细胞和由所收集的细胞形成视网膜球体
[0276] 通过按照实施例7所述的方法培养按照实施例8的方法用细胞分选仪分选的Rax阳 性的和SSEA-1阳性的细胞级分和Rax阳性的和SSEA-1阴性的细胞级分中的每种来形成视网 膜球体。所形成的视网膜球体是Rax阳性的（图9B)，并且没有色素沉积（图9A)。形成的视网 膜球体的数目和尺寸(直径）显示在图9C和D中。发现，与Rax阳性的和SSEA-1阴性的细胞级 分相比，由Rax阳性和SSEA-1阳性的细胞级分可更高的效率形成视网膜球体（图9C)。发 现，与Rax阳性和SSEA-1阴性的细胞相比，由Rax阳性和SSEA-1阳性的细胞可W形成具有更 大尺寸的视网膜球体(图9D)。此外，观察到由Rax阳性和SSEA-1阳性的细胞形成的视网膜球 体包含80 % W上的Rax阳性和SSEA-1阳性的细胞。发现，由上述方法制备的Rax阳性和SSEA- 1阳性的细胞比Rax阳性和SSEA-1阴性的细胞包含更高数量的具有自我复制能力的细胞，并 且可W通过视网膜球体形成培养扩增Rax阳性和SSEA-1阳性的细胞。
[0277] 实施例10:通过加入ROCK抑制剂提高视网膜球体产生效率
[0278] 将通过实施例1的方法制备的在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体在不含 作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(作为补充了 10%胎 牛血清、1 % N2补充剂、0.5測视黄酸和1 OOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中在40 % 化条件下进一步悬浮培养39天，即，直至从悬浮培养开始起的第63天。将得到的在自悬浮培 养开始起的第63天的细胞团聚体通过与实施例4的方法类似的方法分散在包含木瓜蛋白酶 的分散液中，W产生细胞悬浮液。将包含在得到的细胞悬浮液中的细胞W lx 105个细胞/ml 的细胞密度在无血清培养基（其是补充了bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素（5iig/ml)、 B27(50倍稀释）的DMEM/F-12培养基）中在存在或不存在lOiiM Y-27632(ROCK抑制剂）的条件 下悬浮培养10天。结果，形成球形的细胞团聚体（视网膜球体）。在该情形中，在不存在Y- 27632的条件下，形成1300个视网膜球体，而在存在Y-27632的条件下形成1976个视网膜球 体。即，发现加入ROCK抑制剂提高了视网膜球体形成效率。
[0279] 实施例11:由视网膜球体产生光感受器细胞
[0280] 通过实施例7所述的方法，由通过实施例4所述的方法制备的睫状缘区样结构形成 原代视网膜球体和次生性视网膜球体。将得到的原代视网膜球体和次生性视网膜球体各自 接种在用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的细胞培养皿中，在无血清培养基（作为补充了 bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、B27 (50-倍稀释的）的DMEM/F-12培养基的培养基）中培养4 天，并且在含血清培养基(作为补充了 10%胎牛血清、B27、0.5iiM视黄酸aOOiiM牛横酸和lOii 1歴?1'的0161/。-12培养基的培养基）中在40%化，5%0)2,37°(：的条件下培养10天。将得到 的细胞用低聚甲醒固定，并且观察显示Rax基因的表达的GFP巧光图像和用针对Crx(其是一 种光感受器细胞标志物)的抗体的免疫染色图像。结果显示在图10中。发现可W由上述原代 视网膜球体和次生性视网膜球体分化出Rax阳性（图10A和C)和Crx阳性的（图10B和D)光感 受器细胞。
[0281] 实施例12:由视网膜球体产生无长突细胞、神经节细胞
[0282] 通过实施例7所述的方法，由通过实施例4所述的方法制备的睫状缘区样结构形成 原代视网膜球体和次生性视网膜球体。将得到的次生性视网膜球体接种在用聚-D-赖氨酸 和层粘连蛋白包被的细胞培养皿中，在无血清培养基（作为补充了 bFGF( 20ng/ml)、EGF (20ng/ml)、B27 (50-倍稀释的）的DMEM/F-12培养基的培养基）中培养2天，并且在含血清培 养基(作为补充了 10%胎牛血清、B27、0.5iiM视黄酸aOOiiM牛横酸和lOiiM DAPT的DMEM/F-12 培养基的培养基）中在40%化，5%C02,37°C的条件下培养10天。将得到的细胞用低聚甲醒固 定，并且观察显示Rax基因的表达的GFP巧光图像（图11B)、用针对巧视网膜蛋白（其是一种 无长突细胞标志物）的抗体的免疫染色图像（图11A)和各自使用针对化x6与化JU其是神经 节细胞的共阳性标志物）的抗体的免疫染色图像(图11C和D)。结果显示在图11中。发现可W 由上述次生性视网膜球体分化出巧视网膜蛋白阳性的无长突细胞（图11A，B)W及Pax6和 化J1阳性的神经节细胞(图11C，D)。
[0283] 实施例13:从由SSEA1阳性细胞形成的视网膜球体产生光感受器细胞、无长突细胞 和神经节细胞
[0284] 通过由实施例7所述的方法培养按照实施例8所述的方法用细胞分选仪分选的Rax 阳性和SSEA-1阳性细胞级分，由通过实施例4所述的方法制备的睫状缘区样结构形成视网 膜球体。将得到的视网膜球体各自接种在用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的细胞培养皿 中，在无血清培养基（作为补充了bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、B27 (50-倍稀释的）的 DMEM/F-12培养基的培养基）中培养2天，并且在含血清培养基(作为补充了 10%胎牛血清、 B27、0.5础视黄酸，lOOiiM牛横酸和10咖DAPT的DMEM/F-12培养基的培养基）中在40%〇2， 5%C02,37°C的条件下培养10天。将得到的细胞用低聚甲醒固定，并且观察显示Rax基因的 表达的GFP巧光图像(图12B，F)和使用针对W下各项的抗体的免疫染色图像:一种光感受器 细胞标志物，Crx(图12A)，一种无长突细胞标志物，巧视网膜蛋白（图12E)，作为神经节细胞 的共阳性标志物的化x6和化J1(图12C和D)。结果显示在图12中。发现可W由上述视网膜球 体分化出Rax阳性和阳性光感受器细胞（图12A，B，箭头），巧视网膜蛋白阳性的无长突细 胞(图12E，F，箭头似及化x6与l\ijl阳性的神经节细胞(图12C，D，箭头）。
[0285] 实施例14:从由包含睫状缘区样结构的细胞团聚体分离的睫状缘区样结构收集 SSEA-1阳性细胞和由所收集的细胞形成视网膜球体
[0286] 将通过实施例1的方法制备的在自悬浮培养开始起的第24天的细胞团聚体在不含 作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的含血清培养基(作为补充了 10%胎 牛血清、1 % N2补充剂、0.5測视黄酸和1 OOiiM牛横酸的DMEM/F-12培养基的培养基）中在40 % 化条件下进一步悬浮培养55天，即，直至从悬浮培养开始起的第79天。从得到的在自悬浮培 养开始起的第79天的细胞团聚体上切下睫状缘区样结构，并且通过与实施例4的方法类似 的方法分散在包含木瓜蛋白酶的分散液中，W产生细胞悬浮液。在细胞存活时，将得到的细 胞悬浮液(未分选的级分）用磁珠标记的抗-SSEA-1抗体（由Miltenyi Biotec制备)免疫染 色，并且用磁力细胞分离装置(MACS,由Miltenyi Biotec制造川欠集SSEA-1阳性细胞级分和 SSEA-1阴性细胞级分。
[0287] 将得到的SSEA-1阳性细胞级分和SSEA-1阴性细胞级分各自通过实施例8所述的方 法通过FACS进行分析，并且发现包含在SSEA-1阳性细胞级分中的细胞有64 %是SSEA-1阳性 细胞，而包含在SSEA-1阴性细胞级分中的细胞有5 %是SSEA-1阳性细胞。发现从包含睫状缘 区样结构的细胞团聚体收集前述睫状缘区样结构，并且将它们分散，然后从得到的细胞悬 浮液收集SSEA-1阳性细胞级分，能够导致产生具有约64%的纯度的SSEA-1阳性细胞。
[0288] 通过实施例7所述的方法，培养前述未分选的级分、SSEA-1阳性细胞级分和SSEA-1 阴性细胞级分，形成视网膜球体。所形成的视网膜球体是Rax阳性的（图13B)，并且无色素沉 积（图13A)。形成的视网膜球体的数目显示在图13C中。发现，与由未分选的级分形成的视网 膜球体的数目（图13C，"未分选的"）相比，由SSEA-1阴性细胞级分形成的视网膜球体的数目 较少（图13C，"SSEAr")，由SSEA-1阳性细胞级分形成的视网膜球体的数目较高（图13C， "SSEA1"'）。发现，与由SSEA-1阴性细胞级分形成的视网膜球体相比，由SSEA-1阳性细胞级 分形成的视网膜球体具有更大的尺寸。观察到，由SEA-1阳性细胞级分形成的视网膜球体包 含80%W上的Rax阳性和SSEA-1阳性细胞。
[0289] 发现，与SSEA-1阴性细胞级分相比，由上述方法产生的SSEA-1阳性细胞级分包含 更高数目的具有自我复制能力的细胞。
[0290] 本申请基于在日本提交的专利申请号2014-006464(申请日：2014年1月17日），所 述申请的内容完整地结合于此。
[0巧1][工业实用性]
[0292]根据本发明，可W高纯度有效地制备具有分化成视网膜细胞的潜能和自我复制能 力的组织干细胞。
【主权项】
1. 用于制备由多能干细胞诱导分化的睫状缘区干细胞的方法，其包括下述步骤（1)或 步骤(2)或两者： (1) 悬浮培养获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细 胞由此获得视网膜球体的步骤;和 (2) 从获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞收集 阶段特异性胚胎抗原1阳性细胞的步骤。2. 根据权利要求1所述的方法，其中进行步骤（1)，并且其中所述"获得自由多能干细胞 诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过下述方式获得的细胞： 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构。3. 根据权利要求1所述的方法，其中进行步骤(2)，并且其中所述"获得自由多能干细胞 诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过下述方式获得的细胞： 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构。4. 根据权利要求1所述的方法，其中进行步骤（1)，接着进行步骤(2)，并且其中步骤（1) 中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过下 述方式获得的细胞： 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构;并且 步骤(2)中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细 胞"是通过分散步骤(1)中获得的视网膜球体获得的细胞。5. 根据权利要求1所述的方法，其中进行步骤(2)，接着进行步骤（1)，并且其中步骤(2) 中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细胞"是通过下 述方式获得的细胞： 分散由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体，或 分散分离自所述细胞团聚体的睫状缘区样结构;并且 步骤（1)中"获得自由多能干细胞诱导分化的包含睫状缘区样结构的细胞团聚体的细 胞"是通过分散步骤(2)中收集的细胞获得的细胞。6. 根据权利要求1、3、4和5中任一项所述的方法，其中所述阶段特异性胚胎抗原-1阳性 细胞还是Rax阳性的。7. 根据权利要求1、3、4、5和6中任一项所述的方法，其中所述阶段特异性胚胎抗原-1阳 性细胞是无色素沉着的。8. 根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的方法，其中步骤（1)中的悬浮培养在无血清 培养基或含血清培养基中进行，所述无血清培养基或含血清培养基各自含有选自由下述组 成的组的一种或多种物质：作用于FGF信号转导途径的物质和作用于EGF信号转导途径的物 质。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述无血清的培养基或含血清培养基进一步包含 ROCK抑制剂。10. 根据权利要求1、2、4、5、8和9中任一项所述的方法，其中所述视网膜球体是无色素 沉着的。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物多能 干细胞。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。13. 制备视网膜层特异性神经元的方法，所述方法包括下述步骤:在存在一种或多种选 自由Notch信号抑制物质、类视黄醇和牛磺酸组成的组的物质的情况下，培养通过根据权利 要求1-12中任一项所述的方法获得的睫状缘区干细胞。14. 用于由视网膜组织障碍导致的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含通过根据权利要求 1-13中任一项所述的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元。15. 用于治疗由视网膜组织障碍导致的疾病的方法，所述方法包括将有效量的通过根 据权利要求1-13中任一项所述的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元移 植到需要所述移植的受试者中。16. 通过根据权利要求1-13中任一项所述的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特 异性神经元，其用于治疗由视网膜组织障碍导致的疾病。17. 用于评价毒性或药效的试剂，所述试剂包含通过根据权利要求1-13中任一项所述 的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元。18. 评价测试物质的毒性或药效的方法，所述方法包括使通过根据权利要求1-13中任 一项所述的方法制备的睫状缘区干细胞或视网膜层特异性神经元与所述物质接触，并且测 定所述物质对所述细胞的影响。
【文档编号】C12N5/074GK106062182SQ201480076631
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年10月16日
【发明人】桑原笃, 笹井芳树
【申请人】住友化学株式会社, 国立研究开发法人理化学研究所