用于自动生成遗传修饰的t细胞的方法

用于自动生成遗传修饰的t细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品，b)通过离心制备细胞样品，c)磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，d)利用调节剂活化富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，e)遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，f)遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞在培养室中扩增，g)洗涤培养的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，其特征在于所有步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。
【专利说明】
用于自动生成遗传修饰的T细胞的方法
技术领域
[0001 ]本发明设及修饰的T细胞的自动生成。
【背景技术】
[0002] 目前临床产生基因修饰的T细胞是一个复杂的过程，其一般开始于获得患者的外 周血单核细胞(PBMC)。现有方案W白细胞分离步骤为特征，其为了增加的细胞产率而W最 初的更麻烦的处理为代价(与较小量的抽血相反）dPBMC常常在用病毒或非病毒载体基因修 饰之前进行T细胞富集和激活。然后扩增修饰的T细胞W达到治疗所需的细胞数量，在运之 后，细胞在回输前进行最终配制和/或冷冻保存。必须对细胞产物进行多项质量控制检验， 并必须满足所有发布的标准和优良制造规范(GMP)指南。迄今为止，利用基因修饰的T细胞 的过继细胞转移(ACT)主要由通过现有的装置和基础设施开发了其用于小规模临床试验的 生产方法的研究人员实施。运样的个性化治疗是复杂的:该细胞生产方法是费力的，因为它 包含许多(开放的)操作步骤(例如，密度梯度细胞加工、基因修饰、洗涂、喂养等等），其需要 来自经历深度训练的专业熟练的操作人员的介入。失败率可能由于生产运些复杂的产物对 于清洁室人员的高技能和时间要求而是高的。此外，具有清洁室的专用基础设施和所有必 需的仪器必须到位、合格和是功能性的W确保净化和无菌的密闭。运些要求将此类临床制 造限制于全世界的数量有限的机构。运反过来限制了运行的次数，和因此限制了可W在任 何给定时间服务的患者数目。运种不利的商业分配模式阻碍了投资并因此阻碍了广泛发展 对于需要的患者的有希望的疗法化aiser AD，&ncer Gene HierapyUOlS)，！-?)。
[0003] 因此，在本领域中需要用于生成临床使用的基因修饰的T细胞的方法，其更稳健且 不依赖于操作者的技能。

【发明内容】

[0004] 通常，难W使生物学过程自动化，特别是在必须将多个过程相结合W产生复杂的 产品例如基因修饰的T细胞的时候。因此，令人惊讶地发现，在适合于在封闭的符合GMP的环 境(封闭的和无菌的细胞培养系统）中的细胞处理的装置中实施产生遗传修饰的T细胞的自 动化过程是稳健的并且产生与非自动化过程相比相同的或甚至更高量的适合于临床应用 的遗传修饰T细胞。本发明公开了如何获得更高的转导效率和稳健的临床相关数量的基因 修饰T细胞的生产，运是由于自动化固有的较少操作和细胞的更"柔和"的操作。
[000引在封闭的符合GMP的系统中可W用例如C1 iniMACS的odigy 和相关的管道组 (Miltenyi Biotec GmbH,Germany)进行细胞处理。所述CliniMACS Prodigy'".提供用于细 胞处理应用的灵活的平台，从而能够实现不同细胞类型的磁性分离W及细胞处理方案。样 品处理系统的细节也公开于W02009/072003中。
[0006]本发明的方法包括自动化的细胞制备，T细胞、T细胞亚群或T细胞祖细胞的选择 (分离），所述细胞的活化，所述细胞的扩增，所述细胞的转导，和所述细胞的配制(洗涂），例 如，用于随后临床使用。
【附图说明】
[0007]图1:来自代表性的自动化T细胞富集的结果。
[000引图2:自动化T细胞活化。
[0009] 图3:允许基因修饰T细胞的自动化生产的软件架构的示意图。
[0010] 图4A，B，C:基因工程化T细胞的生产过程中培养物振摇的影响。
[0011] 图5:细胞培养物的密度与施加到培养物的振摇类型的影响之间的关系。
[0012] 图6:自动化生产运行的在线监控。
[0013] 图7A，B:手动的相对于自动化的条件的转导效率。
[0014] 图8:自动化T细胞生产的稳健性。
[0015] 图9A，B:在第0天使用振摇条件的自动化生产。
[0016] 图10:在自动化生产过程中细胞培养物的组成。
【具体实施方式】
[0017] 用于生产基因修饰的T细胞的现有技术包括使用大量的装置来执行生产基因修饰 的T细胞的小步骤。许多步骤需要人工干预，因而增加了错误的风险。运里，使用单次使用的 封闭的和无菌的管道组和编程的软件在单个装置中执行所有步骤，例如，使用CliniMACS Prodigy K'。令人惊异的是，本发明的方法相比于手动过程导致所生产的T细胞的更高转导 效率和该基因修饰T细胞的更高的转基因表达（图8)。而且可W在不到2周内稳健地产生大 量具有高存活力的T细胞（图8和6)。与本文公开的本发明方法相关的运些优点依赖于整个 过程中高度保持的环境(溫度和气体），因为细胞并不需要从培养箱移出例如用于取样（否 则其将导致培养物溫度的强降低），并且由于细胞在管道组中溫和的处理和操作和不存在 手动移液和/或使用产生难W控制强度和标准化的剪切力并且对细胞和处理有害的注射 器。
[0018] 在一个方面，本发明提供了一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细 胞祖细胞的自动化过程(方法），其包括W下步骤：
[0019] a)提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品；
[0020] b)通过离屯、制备该细胞样品；
[0021 ] C)磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；
[0022] d)使用调节剂活化富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；
[0023 ] e)遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；
[0024] f)在培养室中扩增该遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；
[0025] g)洗涂培养的T细胞，
[0026] 其特征在于，所有的步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。
[0027] 所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的磁性分离可通过使用对于该T细胞、T 细胞亚群和/或T细胞祖细胞表面上的细胞表面标志物特异性的抗原结合分子进行，例如标 志物 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD27、CD45RA、CD45R0、CD62L、CD95、CD127、CD137、a/e TCR、丫作1'〇?、(：〇?7、？0-1或1^曰的。
[0028] 所述调节剂可W选自于激动性抗体、细胞因子、重组共刺激分子和小的药物抑制 剂。优选地，所述调节剂是与珠或纳米结构偶联的抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段。更优选 地，所述调节剂是纳米基质，该纳米基质包含:a)活动的聚合物链的基质，W及b)与所述活 动聚合物链的基质连接的抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段，其中该纳米基质的尺寸是1至 500纳米。该抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段可W连接到相同的或不同的活动聚合物链的基 质。如果抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段连接到不同的活动聚合物链的基质，微调该纳米基 质W刺激T细胞是可能的。该纳米基质可W是可生物降解的。
[0029] 此外，如在W02014/048920A1中所公开的所述小的纳米基质的无菌过滤是可能的， 其是在符合严格的GMP标准的条件下，即在封闭的和无菌的细胞培养系统中，长期的T细胞 体外增殖中的一个重要特征。
[0030] 可W通过转导、转染或电穿孔进行T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的所述遗 传修饰。
[0031] 优选地，用慢病毒、丫-逆转录病毒、a-逆转录病毒或腺病毒进行转导或用核酸 (0魁、1111?酷、11111?酷、反义核巧酸抑制剂(日]11日旨〇111^3)、00化）、蛋白质、位点特异性核酸酶(锋 指核酸酶、TALE化、CRISP/R)、自复制RNA病毒(例如马脑病病毒)或整合缺陷型慢病毒载体 进行电穿孔或转染。
[0032] 更优选地，可通过用慢病毒载体转导所述细胞进行T细胞、T细胞亚群和/或T细胞 祖细胞的所述遗传修饰。
[0033] 可通过向所述培养室添加用于细胞培养增殖的适合的细胞培养基，如TexMACS GMP培养基(Miltenyi Biotec GmbH)，来进行遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细 胞的所述扩增。
[0034] 可W通过振摇条件进行T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的所述活化、遗传修 饰和/或所述扩增。优选地，在T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的扩增过程中进行振摇。 优选地，培养室中的振摇(旋转)是通过每1-120秒，更优选每15-60秒和最优选每30秒旋转 培养室（离屯、室）用一个或两个方向上W大于(〉)〇和最大70xg之间（在具有6cm的半径的腔 室中1至lOOOrpm)，更优选一个或两个方向上W0.2和17x g之间（在具有6cm半径的腔室中 50至50化pm)，最优选两个方向上W6x g(在具有6cm半径的腔室中30化pm)的离屯、力不定时 地或周期性地发生。重要的是，可W在培养过程中对振摇条件进行适应(通常随细胞密度的 增加而增加）W最好地支持T细胞扩增。
[0(X3日]可通过使用在0.2eVml细胞至4eVml待活化细胞之间和优选在0.5eVml细胞至 2eVml和最优选le6细胞/ml的细胞密度进行所述活化。可选地，可通过使用4eVml细胞至 2eVml待激活细胞之间，和优选4e6/ml细胞至leVml之间的高细胞密度进行所述活化。
[0036] 常规地，T细胞在低T细胞密度（即< le6T细胞/ml或<2e6PBMC细胞/ml)下活化和扩 增。通常情况下，高T细胞密度(〉3e6T细胞/ml或5e6PBMC细胞/ml)不能被适当地活化。因此出 人意料的是，本发明的方法中，当高的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞密度被活化和然 后在振摇条件下扩增(可能在所述细胞的遗传修饰之前或之后）时，可W观察到协同效应。 运迅速导致非常高的遗传修饰细胞的细胞数量(参见图9)。由于例如高活化细胞数量与上 述可溶性纳米基质和扩增过程中振摇条件的组合的运种意想不到的协同效应，该自动化过 程，与本领域已知的方法相比，允许在减少的时间里（即8天，而不是14-28天)产生高数量的 修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞用于治疗。
[0037] 所述遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞可W进行遗传修饰W在它们 的细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或任何辅助分子。
[0038] 为了最终的制剂，通过离屯、和用适合后续应用（例如将所产生的细胞组合物注射 到患者内）的缓冲液替换培养基洗涂扩增的和遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖 细胞。
[0039] 当需要时，可W例如再次使用整合到使用的封闭的和无菌的细胞培养系统中的磁 性分离技术将遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞与未修饰的T细胞分离。
[0040] 在另一个方面，本发明提供了可通过本发明的方法获得的遗传修饰的T细胞、T细 胞亚群和/或T细胞祖细胞的基本上纯的组合物(参见图10)。
[0041] 在另一个方面，本发明提供了可通过本发明的方法获得的遗传修饰的T细胞、T细 胞亚群和/或T细胞祖细胞的药物组合物。
[0042] 示例性地，CliniMACSProdigy-' 和相关的管道组（Miltenyi Biotec GmbH, Germany)在本文中用作在其上实现自动化过程的封闭的细胞样品处理系统。运种系统被详 细公开于W02009/072003中。但它并不意图限于将本发明的方法用于CliniMACSP化digy? 系统。
[0043] 该CliniMACSProdigyj"系统被设计为使整个细胞产物制造过程自动化和标准 化。它将0iniMACS&分离技术(Milten}d Biotec Gm地，Germany)与广泛的传感器控制 的、细胞处理能力相结合。该装置的突出特点是：
[0044] ?能够实现标准化细胞处理和培养的一次性Centri化It?室
[0045] ?单独的或与CliniMACS'w试剂(Miltenyi Biotec GmbH)结合的细胞富集和 耗竭能力
[0046] .由于溫度和受控的二氧化碳气体交换导致的细胞培养和细胞扩增功能。
[0047] ?预定的培养基和体积的最终产品制剂
[004引 ?使用Flexible Programming Suite(FPS)和GAMP5兼容的编程语言为该装置编 程用于定制细胞处理的可能性
[0049] .用于多种应用的量身定制的管道组
[0050] T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的分离步骤可W包括一个、几个(两个或更多 个)正向的富集步骤（即T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的分离(直接磁性标记））或富 集步骤的组合。T细胞可W通过使用与颗粒（如分别对于CD4和CD8特异性的磁珠)偶联的抗 原结合分子选择用于CD4+和/或CD8巧细胞。例如通过使用标志物CD62L，可W分离T细胞亚 群，如原始和中央巧区T细胞。
[0051] T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的分离步骤也可W包括T细胞的负向富集(非 T细胞的直接标记）或待从制剂移除的细胞亚群的耗竭。例如，可W经由CD19标志物从淋己 瘤患者材料移除B细胞。也可W分别利用标志物CD25和CD14移除抑制性细胞如调节T细胞 (CD25高）、单核细胞(CD14)。
[0052] 可W通过使用转导增强试剂增强T细胞的病毒转导，特别是选自于多阳离子试剂 (聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、带有净正电荷的肤）、泊洛沙姆、粘附分子如纤连蛋 白或修饰的纤连蛋白（Retronectin)或蛋白质祀向结构域，如抗体、抗体复合物、磁性颗粒 的转导增强试剂。
[0053] 转导增强剂可W提供于溶液中、涂布在培养室上或涂覆在存在于培养室内的悬浮 液/溶液中的载体物质上。
[0054] 离屯、室和培养室可W是相同的。离屯、室和培养室可W在各种条件下使用：例如，对 于分离或转导，可W施加高转速（即高g-力），而例如培养步骤可W利用缓慢转动或甚至W 空转状态进行。在本发明的另一种变型中，腔室W来回振荡方式改变旋转方向，其导致该腔 室的振摇和维持细胞在悬浮中。因此，在本发明的方法中，可W在离屯、或培养室的稳定的或 振摇的状态下进行T细胞的活化、基因修饰和/或培养步骤。
[0055] 图1示出了代表性自动化T细胞富集的结果。将8e9总细胞的白细胞分离通过无菌 接合于安装到CliniMACSPfodigyV'上的管道组而连接。将细胞洗涂并用CD4和 CDSCliniMACS试剂进行标记。标记的T细胞特别地通过磁性富集与其余的细胞分离。在富集 之前和之后细胞用抗CD3、CD14和CD20的巧光色素结合的抗体标记，并通过流式细胞术进行 分析。上部点图显示了富集前的细胞组成和下部的点图代表富集后T细胞的纯度(94.7%)。
[0056] 图2示出了自动化的T细胞活化。在第0天，将le8的富集T细胞自动采样到在 CliniMACSProdigyii'装置上的管道组的腔室中。在同一天，T细胞用MACS GMP TransAct CD3/CD28试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)的活化试剂解育，运导致早期活化标志物CD25和 CD69的上调。该图表示活化前(顶部）和提供活化试剂24小时后（底部）来自对活性T细胞进 行口控的代表性流式细胞分析的结果，并显示出CD25和CD69的强上调。
[0057] 图3示出了实现自动化基因修饰T细胞的生产的软件架构的示意图：为了执行基因 工程化的T细胞的自动化生产，意思是为了能够使复杂的生物学过程自动化，重要的是建立 能够接受如细胞数量、流速、体积、溫度、％C〇2、培养物运动、解育时间、培养基交换等的参 数的软件。但是为了开发的目的，该程序必须是灵活的W用于临床使用，输入参数的数目必 须减少，并且过程中的变化必须消除。因此，我们描述了其中首先在所谓的活动矩阵 (activity matrix)中建立培养参数、必须采取行动时的时间和日期的程序。该活动矩阵提 供了用于程序在后台运行的指导。该后台程序作为控制培养的基本功能的培养循环（中屯、 方框)发挥作用，其中可W在规定的时间激活"卫星程序"，如"转导"、"试剂洗涂"、"喂养"。 一旦卫星程序完成，中屯、培养循环重新开始。培养循环和卫星程序参数在生产过程开始时 在活动矩阵中定义(未示出输入部件）。虽然创建程序对于执行本文所公开的方法的自动化 程序是重要的，但运一程序的实施可W由本领域的技术人员执行而无需创造性劳动。但是 必须特别地实施参数输入和程序的发展(如振摇模式、时间和频率获得稳健的和功能性 的自动化过程(意味着能够用高度可变的输入材料如来自不同医学适应症的患者的细胞产 生可靠的和可再现的结果的过程）。
[005引图4示出了基因工程化的T细胞的生产过程中培养物振摇的影响。在CliniMACS Prodigy?上的自动化CD6化阳性细胞富集后，le8的富集T细胞被引入室中，用MACS GMP lYansAct CD3/CD28试剂盒(Miltenyi Biotec Gm地)活化，用编码针对CD20的嵌合抗原受 体的慢病毒载体进行基因修饰。最初的4-5天在稳态培养条件下进行。然后使培养物经历3 种不同类型的不定时振摇模式。A)1型，每30秒（s)，在一个方向上l(K)rpm持续2秒，B)从第5 天至第9天1型。在第9天，激活2型(每30秒，在一个方向上30化pm持续2秒)或C)从第5天至第 9天1型。在第9天，激活3型(每30秒，在两个方向上3(K)rpm持续2秒）dX轴表示培养天数。左侧 的Y轴显示T细胞扩增(方块），细胞密度（圆形，le6细胞/ml)和总细胞计数(S角形，X le8细 胞）。右侧的Y轴显示指定类型的振摇速度。如可W在C)中看出的，改变振摇条件的参数导致 提高的细胞生产量。
[0059] 图5示出了细胞培养物密度和施加于培养物的振摇类型的效应之间的关系。从采 用如图4中所描述的类似条件进行的几个实验的结果，可W观察到，当用高于2e6细胞/ml和 优选高于4e6细胞/ml的密度进行培养时，更稳健的振摇类型（例如，3型）将产生更好的结 果。X轴代表培养物被设置为250ml后的天数，在所有的情况下，开始培养后和初始T细胞活 化8天。巧自代表T细胞密度(1 e6细胞/ml)。
[0060] 图6显示了自动化生产运行的在线监控。为了确保T细胞是在最佳条件下进行培 养，重要的是能够在生产运行期间采样培养物W监控关键参数。运里所描述的自动化过程 允许使用者在任何时间采集培养基的样品至专用采样袋中。然后可W远程地测量如细胞密 度、葡萄糖、抑值等的参数。该图描绘了使用GMP TexMACS培养基(Miltenyi Biotec Gm地） 在ciiniMACSProdigyit'中执行的典型运行的在线监测值。X轴代表W天数计的时间。左侧 的Y轴表示葡萄糖值角形，g/ml)、pH值（空屯、菱形）。右侧的Y轴表示存活力（实屯、菱 形，％ )和实验的振摇速度(虚线，巧m)。
[0061] 图7示出了在手动相对于自动化条件的转导效率。采用如图4中所描述的类似条 件。在第1天用MACS GMP TransAct CD3/CD28试剂盒刺激le8T的富集T细胞并用编码抗CD20 嵌合抗原受体的le8转导单位的慢病毒载体进行转导。与自动化的生存过程平行，进行手动 生产运行。转导后7天，通过流式细胞术分析样品W测定A)转导的T细胞的频率和B)CAR表达 的平均巧光强度。如可W看到的，表达转基因的细胞的百分比W及转基因表达的水平在自 动化生产过程中转导的T细胞中更高。
[0062] 图8示出了自动化T细胞生产的稳健性。所有的线条代表用不同的供体进行的独立 的自动化生产运行。如图4中所述地进行实验。X轴描绘W天数计的时间和Y轴是在不同的天 数测定的绝对细胞计数。如可W看到的，该自动化生产过程非常稳健并且由单个运行导致 非常类似的结果。
[0063] 图9示出了第0天使用振摇条件的自动化生产。血液成分分离术分离出CD4/CD8阳 性细胞，并在CliniMACSProdigy"平台上W不同的设置培养。在第0天将高于4e8细胞密度 的富集T细胞接种于lOOml(A)或200ml(B)总体积中并立即在3型振摇条件下进行培养。在第 2天细胞稀释在100ml中，并从第4天开始每天进行培养基替换直至培养结束。在第6天停止 W200ml(B)开始的培养，在第8天终止WlOOml(A)开始的培养。令人惊讶地，结果表明，有可 能在培养开始时激活和扩增T细胞而没有稳态阶段的活化。在运样的动态条件下，有可能非 常迅速地产生大量T细胞（即图9A中第8天的2.8e9T细胞，相对于图4C中第8天的1.8e9总细 胞)。
[0064] 图10示出了自动化生产过程中细胞培养物的组成。将来自健康供体的血沉栋黄层 连接到安装于CliniMACSPro如上的管道组TS520(Miltenyi Biotec GmbH)，用 CliniMCS CD6化试剂富集原始和中央记忆T细胞亚群。le8的富集CD6化细胞被置于培养室 中，活化，在第1天用编码绿色巧光蛋白（GFP)的慢病毒载体转导，并用在本发明中描述的方 法扩增。该图表示所示的细胞亚群的频率(从条形的底部到顶部:T细胞、B细胞、单核细胞、 NK细胞、NK T细胞和粒细胞）。如可W看到的，在培养的11天后和在最终收获样品中，细胞产 物含有95% W上的T细胞。
[00化]实施方式
[0066] 在本发明的一个实施方式中，将例如含有目的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细 胞的患者样品引入到封闭的和无菌的培养系统如CliniMACS Prodigy'''的腔室中。将样品 离屯、，优选使用光密度的相检测，去除过量的红细胞，使用例如CliniMCS缓冲液(Miltenyi Biotec Gm地)洗涂细胞样品W避免细胞聚集，并用磁性细胞分离试剂如CliniMACS CD4和 CD8试剂(Miltenyi Biotec Gm地)磁性标记。在标记后，将细胞洗涂，通过集成的磁性细胞 选择柱磁性富集，和然后返回到细胞培养室。
[0067] 在细胞培养室中，可W在稳定或振摇培养条件下用一种能够诱导T细胞扩增的试 剂或该试剂的组合来活化T细胞，如激动性抗体(例如，抗-CD3和抗-CD28)、细胞因子(例如 比-化、比-2、IL-4、比-6、IL-7、n^-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、IL- 35、TGF-b、IFNa、IFN 丫、TNFa)、重组蛋白、共刺激分子、凝集素、离子载体、合成分子、抗原呈 递细胞(APC)、人造APC或喂养细胞。运些活化试剂可W在溶液中提供、涂布在培养室上或涂 覆在存在于培养室内的悬浮液/溶液中的载体物质上或在大颗粒上。
[0068] 可W在稳定或振摇培养条件下培养T细胞。培养一段时间后，病毒载体被添加到培 养腔室和细胞被转导。进一步的细胞培养期之后，细胞可W被再次转导或充分洗涂和收获 (配制）。在体内输送基因修饰的T细胞产物之前，可W将该细胞洗涂、浓缩并再悬浮于符合 用于体内输注的临床要求的缓冲液中。上面提到的所有步骤是自动化执行的。
[0069] 在本发明的一个实施方式中，通过使抗体偶联的磁珠与T细胞、T细胞亚群和/或T 细胞祖细胞的表面上存在的细胞表面标志物结合来标记该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖 细胞，和通过磁性分离(正向富集)来富集标记的细胞。
[0070] 在本发明的另一个实施方式中，通过使抗体偶联的磁珠与T细胞或限定的细胞亚 群的表面上不存在的细胞表面标志物结合和通过磁性分离耗竭标记的细胞(负向富集)来 富集T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞。
[0071] 在本发明的进一步的实施方式中，除了T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞外的 第一富集外，遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞在第二富集步骤中通过在培 养之前或之后磁性标记遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞和磁性分离W在通 过本发明的方法得到的最终获得的细胞组合物中获得更高频率的遗传修饰的T细胞、T细胞 亚群和/或T细胞祖细胞来富集。例如，如果遗传修饰的细胞是表达CAR或TCR的T细胞，那么 可W通过使用与磁性颗粒偶联的对于遗传修饰T细胞的细胞表面上重组表达的CAR或TCR特 异性的抗原结合分子来进行第二分离步骤。
[0072] 在本发明的一个优选的实施方式中，提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细 胞的细胞样品，例如来自患者的全血。所述样品被连接到封闭的和无菌的细胞培养系统，例 如，将样品经由管道组连接到ciiniMACSProdigyK"装置。通过在该装置的离屯、室中的离屯、 制备细胞样品，导致红细胞和血小板与包括T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的其它细 胞分离。T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的磁性分离通过使用与磁性颗粒偶联的对于T 细胞、T细胞亚群和/或T细胞的祖细胞的标志物如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD27、 CD45RA、CD45R0、CD62L、CD95、CD127、CD137、a/eTCR、丫作1'〇?、(：〇?7，？0-1或1^3的特异性的抗 体禪合进行。通过使标记的细胞引导通过该装置的具有分离柱的磁性单元导致所述的T细 胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的富集。在将分离的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞 移动至该装置的培养室（其可W与离屯、室相同）之后，所述细胞W〇.5eVml细胞至2eVml使 用调节剂激活的细胞的给定密度设置在例如由抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段已经连接于 在其上的活动聚合物链组成和且大小在1至500纳米之间的纳米基质上。在T细胞、T细胞亚 群和/或T细胞祖细胞的所述活化之后，在装置的培养室中进行所述细胞的遗传修饰，例如， 它们用包含编码CAR的多核巧酸序列的慢病毒载体转导。在T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖 细胞的遗传修饰后，所述细胞在振摇条件下在培养中扩增。可W在允许细胞悬浮的条件下 (且如本文中公开的），通过培养室的不定时的或周期性的离屯、（在运种情况下培养室与离 屯、室相同）进行振摇。最后，通过离屯、洗涂培养的细胞，从而允许用适合于后续应用（例如， 将所产生的细胞组合物输注到患者中）的缓冲液替换培养基。
[0073] 在本发明的一个实施方式中，在生产过程结束时获得较高纯度的转导的T细胞，例 如，在它们的细胞表面上表达转基因如CAR或TCR的T细胞，运是由于特异性富集基因修饰的 T细胞的附加细胞选择步骤，其优选使用涂覆有针对由转基因编码的表面分子的抗体的磁 性颗粒进行。该富集步骤优选通过再次使用该装置的磁性分离单元W自动化方式进行，并 且在最终制剂之前完成。
[0074] 优选地，所使用的选择剂可W在运种第二富集后和在应用到患者或下游应用之前 从所选择的细胞的表面完全除去。
[0075] 在本发明的另一个实施方式中，有可能通过在悬浮状态下活化T细胞W较高的细 胞密度开始该自动化生产过程。当可W从起始材料获得足够数量的祀T细胞、T细胞亚群和/ 或T细胞祖细胞时，有可能在振摇条件下直接用4e6至le7T细胞的高细胞密度开始自动化生 产过程，例如在允许细胞悬浮而用于在培养开始时活化细胞的条件下对培养室使用不定时 的或周期性的离屯、（在此情况下培养室与离屯、室相同）dT细胞可W使用慢病毒载体进一步 修饰，并在悬浮中扩增。在本发明的运个实施方式中，优选地，在如本文所公开的方法的活 化、遗传修饰和扩增步骤过程中保持振摇条件W保持高密度细胞培养物在悬浮中。运种替 代方式的优点是可能在更短的时间段(通常为1周，相对于10-14天）内获得大的细胞数量。
[0076] 在本发明的一个实施方式中，可W通过使用慢病毒载体来进行T细胞、T细胞亚群 和/或T细胞祖细胞的遗传修饰步骤。具有VSVG假型的慢病毒载体使得能够在自动化生产方 法条件下有效转导。但是该方法完全适合使用任何类型的慢病毒载体（如用于麻疹病毒 (ML-LV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性逆转录病毒(RD114)、拂拂内源性逆转录病毒 (BaEV)衍生的假型包膜）。可W使用其它病毒载体诸如丫或a逆转录病毒载体。当使用本发 明中描述的自动化生产需要时，可添加转导增强试剂。
[0077] 室义
[0078] 除非另外定义，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人 员通常所理解的相同的含义。
[0079] 术语"封闭的细胞样品处理系统"和"封闭的和无菌的（细胞培养)系统"可W互换 使用。
[0080] 如本文所用的术语"封闭的细胞样品处理系统"是指，在进行培养处理如引入新材 料(例如通过转导）和进行细胞培养步骤如细胞增殖、分化、活化和/或分离时，降低细胞培 养物污染的风险的任何封闭的系统。运样的系统允许在GMP或GMP样（"无菌的"）条件下操 作，产生临床上适用的细胞组合物。本文示例性地使用CliniMACSPr〇digyk'(Miltenyi Biotec GmbH,Ge;rmany)作为封闭的细胞样品处理系统。该系统公开于W02009/072003中。但 它不意在将本发明的方御良制于使用CliniMACSPrOdigy?'。
[0081] 可W在封闭的和无菌的系统(封闭的细胞样品处理系统）中实施本发明的方法，其 包括包含由圆筒、累，阀、磁性细胞分离柱和管道组连接的底板和盖板的离屯、室。含有T细 胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的血液样品或其他来源可W通过无菌对接或无菌接合转 移到管道组和来自管道组。合适的系统被公开在W02009/072003中。
[0082] 封闭的细胞样品处理系统可W包含多个管道组(TS)，在其中细胞通过无菌对接或 无菌接合在TS之间转移。
[0083] 该方法的不同的模块可W在不同的功能性封闭TS中进行，使得在一个管道组中产 生的一个模块的产物（细胞)通过无菌方式转移到另一管道组。例如，可W在第一管道组 (TS)TSIOO中通过Miltenyi Biotec GmbH磁性富集T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，且 含有富集T细胞的正向部分从TS100脱开连接并通过Miltenyi Biotec GmWl接合到第二管 道组TS730上用于进一步活化、修饰、培养和洗涂。
[0084] 如本文所用的术语"自动化方法"或"自动化过程"是指通过使用装置和/或计算机 和计算机软件自动化的任何过程。已经被自动化的方法(过程)需要较少的人工干预和较少 的人力时间。在某些情况下，如果本发明方法的至少一个步骤是没有任何人工支持或干预 的情况下进行，则本发明的方法是自动化的。优选地，如果如本文所公开的方法的所有步骤 (除了将新鲜试剂接入系统中之外)在没有人工支持或干预的情况下进行，则本发明的方法 是自动化的。优选地在封闭的细胞样品处理系统如本文所公开的CliniMACSProdigy'i''上 实现自动化过程。
[0085] 封闭的细胞样品处理系统可W包含a)样品处理单元，其包含被连接至具有至少一 个样品室的旋转容器(或离屯、室）的输入端口和输出端口，其中所述样品处理单元被配置为 向样品提供第一处理步骤或者旋转该容器W便向沉淀在该室中的样品施加离屯、力并分离 沉积的样品的至少第一组分和第二组分;和b)被连接到所述样品处理单元的输出端口的样 品分离单元，该样品分离单元包含分离柱支架、累和配置为至少部分地控制流过流体回路 和定位在支架中的分离柱的流体流的多个阀，其中所述分离柱被配置为分离流过该柱的样 品的标记的和未标记的组分。
[0086] 所述旋转容器也可被用作溫度控制的细胞解育和培养室（中屯、培养单元= CCU)。 该室可用限定的气体混合物充满，该气体混合物由连接的气体混合单元提供(例如，使用加 压的至气/化/C〇2或化/CO2/O2)。
[0087] 可W在过程开始之前将所有的试剂连接到封闭系统。运包括所有的缓冲液、溶液、 培养基和补充物、微珠，其用于在封闭的系统内的洗涂、转移、悬浮、培育、收获细胞或免疫 磁性细胞分选。可选地，运样的试剂可w在过程中的任何时间通过无菌方式接合或连接。
[0088] 包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品可W在转移袋或其他适合的 容器中提供，其可通过无菌方式连接到闭合系统。
[0089] 术语"提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品"是指提供细胞样 品，优选地，血液来源的人细胞样品。通常，细胞样品可W由来自供体或患者的血液细胞。运 种血液产物可W是全血、血沉栋黄层、白细胞分离成分、PBMC或血液产品的任何临床采样的 形式。它可W来自新鲜的或冷冻的来源。
[0090] 如本文所用的术语"通过离屯、制备细胞样品"是指通过离屯、将细胞与提供的细胞 样品的其它组分(例如，非细胞组分)分离。该离屯、步骤可W包括一个、多个或所有的W下方 面:梯度分离、红细胞减少、血小板去除和细胞洗涂。
[0091] 术语"洗涂"是指替换细胞保持于其中的培养基或缓冲液。上清液的替换可W是部 分的（例如除去50%的培养基，并添加50%的新鲜培养基）（运常常被应用于稀释或喂养的 目的）或完全的。可W组合几个洗涂步骤W便获得细胞保持于其中的原始培养基的更充分 的替换。洗涂步骤通常设及通过离屯、力使细胞沉淀并除去上清液。在本发明的方法中，细胞 通过W例如300xg旋转腔室而沉淀，且在腔室旋转的过程中将上清液除去。培养基在旋转过 程中或在稳态下添加。
[0092] 如本文所用的术语"振摇条件"是指使得细胞培养物中的细胞保持悬浮的任何手 段。振摇可W通过旋转(或不定时离屯、)封闭的和无菌的细胞培养系统的培养室进行，并且 其中所述旋转如本文所公开的周期性地进行。该振摇也可W例如通过使用整合到闭合的和 无菌的细胞培养系统中的揽拌装置、推进装置或液体流动(例如通道)进行，其防止细胞的 沉降。
[0093] 如本文所用的术语"标志物"是指特别地由特定细胞类型表达的细胞抗原。优选 地，该标志物是细胞表面标志物W使得能够进行活细胞的富集、分离和/或检测。该标志物 可W是阳性选择标志物，例如CD4、CD8和/或CD62L，或可W是阴性选择标志物(例如，耗竭表 达〔014、〔016、〔019、〔025、〔056的细胞）。
[0094] 如本文所用的术语"表达"被定义为在细胞中通过其启动子驱动的特定核巧酸序 列的转录和/或翻译。
[0095] 如本文所用的术语"颗粒"是指固相表面，如胶体颗粒、微球、纳米颗粒或珠。用于 产生运样的颗粒的方法在本领域中是公知的。所述颗粒可W是磁性颗粒。所述颗粒可W在 溶液或悬浮液中，或它们在本发明中使用前可W是冻干状态。然后冻干的颗粒在接触关于 本发明的待处理样品之前在适合的缓冲液中重构。
[0096] 如本文所用的术语"纳米结构"是指纳米尺寸的结构，其不属于术语"颗粒"的范 围，但是在与调节剂如抗-CD3和/或抗-CD28抗体或其片段偶联时允许T细胞的多克隆刺激。
[0097] 如在W02014/048920A1 中所公开的或如在MACS GMP lYansAct CD3/CD28试剂盒 (Milten^ Biotcc Gm地，订购号170-076-140)中所给予的纳米基质是特定的纳米结构。如 本文所用的术语"纳米基质"是指包含W下组分的纳米基质：
[009引a)活动的聚合物链的基质;和
[0099] b)连接到所述活动的聚合物链的基质的一个或多个刺激剂，其向T细胞提供活化 信号；从而激活T细胞并诱导T细胞增殖，其中所述纳米基质大小为1至500纳米，优选10至 200纳米。刺激剂可W是抗-CD3和/或抗-CD28抗体或其片段。
[0100] 运些聚合物由活动的（能动的），优选高度活动的（能动的）链组成，所W该基质特 征在于不存在作为刺激剂如抗体的连接点的固体表面，并且其与当前使用的常规地具有非 柔性的硬质表面的珠或微球形成强烈对比。
[0101] 所述基质由对细胞无毒的聚合的，优选可生物降解的或生物相容的惰性材料组 成。优选该基质由亲水性聚合物链组成，其由于链的水合作用在水溶液中获得最大的移动 性。该活动基质是纳米基质的唯一的或至少主要的成分而与连接于其上的试剂无关。
[0102] 该活动基质可W是胶原蛋白、纯化的蛋白质、纯化的肤、多糖、糖胺聚糖或细胞外 基质组合物。多糖可W包括，例如，纤维素酸、淀粉、阿拉伯胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明 质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶或者藻酸盐。其它聚合物可W包括聚醋、聚酸、聚丙締酸醋、聚丙 締酷胺、聚胺、聚乙締亚胺、聚季锭盐聚合物、聚憐腊、聚乙締醇、聚乙締乙酸醋、聚乙締化咯 烧酬、嵌段共聚物或聚氨醋。优选该活动的基质是葡聚糖的聚合物。
[0103] Expamers(Stage Cell Therapeutics,Germany)是用于纳米结构的另一个实例。 运里，可溶性Str邱Tactin蛋白低聚物使用活化主配体如抗-CD3和CD28化b片段官能化用于 T细胞的多克隆刺激。StreptTactin骨架允许通过低亲和力化b片段的结合的可逆和模块化 的功能化。
[0104] 如本文所用的术语"抗原结合分子"是指优选结合细胞的期望目标分子（即抗原） 或对于其特异性的任何分子。术语"抗原结合分子"包括例如抗体或抗体片段。如本文所用 的术语"抗体"是指多克隆或单克隆抗体，其可W通过本领域技术人员公知的方法来产生。 所述抗体可W是任何物种的，例如小鼠、大鼠、绵羊、人。用于治疗目的，如果使用非人抗原 结合片段，它们可W通过本领域中已知的任何方法人源化。抗体还可W是修饰的抗体(例如 低聚物，还原的、氧化的和标记的抗体）。
[010引术语"抗体"包括完整的分子和抗体片段，例如化6、化6'^^8')2爪和单链抗体。 另外，术语"抗原结合分子"包含优先结合到细胞的期望目标分子的除抗体或抗体片段W外 的任何分子。合适的分子包括，但不限于，结合于期望的祀分子的称为适体的寡核巧酸、碳 水化合物、植物凝集素或任何其它的抗原结合蛋白（如受体-配体相互作用）。抗体和颗粒或 纳米结构之间的连接(偶联)可W是共价的或非共价的。共价键可W是，例如，与聚苯乙締珠 上的簇基基团或修饰的珠上的N出或甜2基团的连接。非共价键是，例如，通过生物素-抗生物 素蛋白或连接于抗巧光团抗体的巧光团偶联颗粒。
[0106] 关于抗原结合分子，例如抗体或其片段，的术语"特异性结合于"或"对于…特异 性"是指识别并结合样品中的特定抗原，例如CD4，但基本上不识别或结合所述样品中的其 他抗原的抗原结合分子(在抗体或其片段的情况下，指抗原结合结构域）。特异性地结合来 自一个物种的抗原的抗体或其片段的抗原结合结构域也可结合来自另一个物种的抗原。运 种跨物种的反应性不违背如本文中所用的"对于…特异性"的定义。特异性地结合于抗原例 如CD4抗原的抗体或其片段的抗原结合结构域也可W基本上结合所述抗原的不同变体(等 位基因变体、剪接变体、同种型等）。运种交叉反应性不违反该抗原结合结构域对于抗原例 如CD4特异性的定义。
[0107] -种有效的分选技术是磁性细胞分选。磁性分离细胞的方法可商购自，例如 Invitrogen，Stem cell Technologies，Cellpro，Seattle或Advanced Magnetics，Boston。 例如，单克隆抗体可W直接偶联磁性聚苯乙締颗粒如Dynal M 450或类似的磁性颗粒且用 于例如细胞分离。Dynabeads技术不是基于柱的，相反，具有连接的细胞的运些磁珠在样品 管利用液相动力学，并且细胞通过将管置于磁性支架上而分离。然而，在用于从细胞样品富 集、分选和/或检测T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的优选实施方式中，单克隆抗体结 合与具有通过例如多糖的有机涂层的胶体超顺磁微粒一起使用（磁激活细胞分选 (MACS?)技术(Miltenyi Biotec,Bergisch Glaclbach,Germany))。运些颗粒(纳米珠或 微球)可W与单克隆抗体直接偶联，或与抗免疫球蛋白、抗生物素蛋白或抗半抗原特异性微 珠结合使用。MACS?技术允许通过将细胞与用针对特定表面抗原的抗体涂覆的磁性纳 米颗粒一起解育而将它们分离。运导致表达该抗原的细胞附着于磁性纳米颗粒。之后将细 胞溶液转移至放置于强磁场中的柱上。在此步骤中，附着到纳米颗粒的细胞(表达该抗原） 停留在柱上，而其它细胞(不表达抗原)流过。用运种方法，细胞可W相对于特定抗原正向或 负向地分离。在正向选择的情况下，在从磁场移除柱后，将附着于磁柱的表达目的抗原的细 胞洗出到单独的容器中。在负向选择的情况下，使用的抗体是针对已知存在于非目的细胞 上的表面抗原。在将细胞/磁性纳米颗粒溶液应用到柱上W后，表达运些抗原的细胞结合于 柱，并收集流过的部分，因为它包含目的细胞。因为运些细胞没有通过与纳米颗粒偶联的抗 体标记，它们是"未受影响的"。该过程可W使用直接磁性标记或间接磁性标记来执行。对于 直接标记，特异性抗体直接与磁性颗粒偶联。当直接磁性标记不可能或不希望时，间接标记 是方便的替代方式。针对任何细胞表面标志物的初级抗体、特异性单克隆抗体或多克隆抗 体、初级抗体的组合可用于运种标记策略。初级抗体可W是未偶联的、生物素化的或巧光团 偶联的。然后用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或抗巧光团微珠实现磁性标记。上述过程 也可W在封闭的细胞样品处理系统如仁liniMACS'* (Miltenyi Biotec GmbH,Germany) 或CliniMACSProdigy(Miltenyi Biotec Gm地,Germany)中进行。
[0108] 如本文所用的术语"遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的基本上纯 的细胞组合物"是指用本发明的方法获得的细胞组合物中包含至少70%，更优选至少90%， 最优选至少95%的遗传修饰T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞组合物。细胞产物 的转导频率取决于用于进行基因修饰的载体的类型W及该转基因的性质。可W通过包含至 少部分地针对转基因的额外选择步骤而获得基因修饰的T细胞的更高频率。
[0109] "嵌合抗原受体"或"CAR"是指工程化的受体，其将抗原特异性移植到细胞，例如T 细胞上。本发明的CAR包含抗原结合结构域(也称为抗原祀向区域）、细胞外间隔区结构域或 较链区、跨膜结构域及至少一个细胞内信号结构域或至少一个共刺激结构域和至少一个细 胞内信号结构域。
[0110] 术语"遗传修饰的细胞"是指含有和/或表达外源基因或核酸序列，运相应地改变 细胞或其后代的基因型或表型。特别的，该术语是指细胞可W通过本领域中公知的重组方 法操作W稳定或瞬时地表达运些细胞在自然状态下不表示的肤或蛋白质（例如CAR)的事 实。细胞的遗传修饰可W包括，但不限于使用逆转录病毒载体、慢病毒载体、非整合逆转录- 或慢病毒载体、转座子、人工核酸酶(包括锋指核酸酶KTALENS或CRISPR/CAS的转染、电穿 孔、核转染、转导。
[0111] 可通过本文公开的方法获得的遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞可 w用于随后的步骤，如研究、诊断、本领域技术人员已知的药理学或临床应用。
[0112] 遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞也可W被用作疾病治疗（例如细 胞疗法)或预防中的药物组合物。该药物组合物可被移植到动物或人体中，优选人类患者 中。该药物组合物可用于治疗和/或预防哺乳动物，特别是人的疾病，其可能包括向哺乳动 物施用药物有效量的药物组合物。可适合于待治疗(或预防）的疾病的方式施用本公开 的药物组合物。施用的量和频率将由如患者的状况W及患者疾病的类型和严重程度的因素 来确定，虽然合适的剂量可W通过临床试验来确定。
[0113] 术语"治疗有效量"是指向患者提供治疗益处的量。
[0114] 通过本发明的方法获得的遗传修饰T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的组合物 可W单独施用，或作为与稀释剂和/或与其它组分如细胞因子或细胞群结合的药物组合物 施用。简要地说，本发明的药物组合物可包含本文中所描述的本发明的遗传修饰T细胞、T细 胞亚群和/或T细胞祖细胞，其与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋 形剂相结合。运样的组合物可W包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、憐酸盐缓冲盐水等;碳水 化合物如葡萄糖、甘露糖、薦糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白质；多肤或氨基酸例如甘氨酸;抗氧 化剂;馨合剂例如邸TA或谷脫甘肤;佐剂(例如，氨氧化侣）；和防腐剂。
[0115] 实施例
[0116] 实施例1:使用几种封闭的无菌管道组自动化生产基因修饰的T细胞
[0117] 通过无菌接合于安装在CliniMACSProdigy''"装置上的管道组TS100(Miltenyi Biotec GmbH)将来自供体的白细胞分离袋（100-200ml)连接。C1 iniMACS缓冲液W及 CliniMCS CD4和CD8试剂(Miltenyi Biotec GmbH)也被连接到相同的管道组。启动富集程 序。该管道组用缓冲液自动启动，然后将白细胞分离产物转移到管道组的腔室中，其在此处 用C1 iniMACS缓冲液洗涂3次W除去血清和血小板。还执行红细胞减少W除去过量的红细 胞。CliniMACS CD4和CD8试剂转移至腔室中的细胞用于CD4和CD8阳性细胞的磁性标记。在 室溫下解育30分钟后，磁性标记的细胞被自动转移到置于磁场中的柱上。标记的细胞被捕 获和非标记的细胞被洗脱在非祀细胞部分袋中。带有标记的细胞的柱被冲洗数次，之后标 记的细胞被洗脱到祀细胞部分袋中。集成在管道组中的样品袋允许获得l-2ml的样品，该样 品用于通过流式细胞术进行细胞计数和细胞纯度的远程分析(图12)。一部分富集的细胞被 转移（通过无菌接合的连接）到新安装在CliniMACSProdigy"'装置上的另一个管道组 (TS730)中。该管道组也连接到补充有IL-2的MACS GMP TexMACS培养基、MACS GMP lYansAct CD3/CD28试剂盒（全部Miltenyi Biotec Gm地)和le8的富集T细胞。启动活化程 序。富集的细胞被洗涂并再悬浮在培养基中，培养被设定在37°C，并提供5%的C〇2气体供 给。在培养平衡时，活化试剂自动添加到培养物中。24小时后，将样品分析活化标志物CD25 和CD69的上调（图2)。使用例如Terumo无菌接合器将含有病毒载体的袋无菌接合到管路组 上，用户确认在软件中要求确认病毒载体已被连接且病毒载体被转移到含有活化的T细胞 的腔室中的提示。培养5天后，T细胞被转移到5升的袋中，并被转移到Wave Bioreactor? (Life Technologies)(能够进行T细胞扩增的另一装置)上。细胞在悬浮液中再培养7天。扩 增细胞的袋被回接到01加14〔5化〇化3式@上的新管道组上。化。114〔5?1'〇出各7@允许细 胞从化自动浓度至100ml和在适合人类输注的溶液中对细胞再缓冲。
[0118] 实施例2:使用单一封闭的无菌管道组自动化生产基因修饰的T细胞
[0119] 通过无菌接合于安装在CliniMACSProdigy'"''装置上的管道组TS520(Miltenyi Biotec GmbH)将来自供体的100-200ml的血沉栋黄层袋连接。CliniMACS缓冲液W及 CliniMACS CD6化试剂、MACS GMP CD3/CD28试剂盒和含有lOng/ml的化-7和化-15的MACS GMP TexMACS培养基也被连接到TS520(全部Miltenyi Biotec GmbH)。然后活动矩阵填入自 动生产运行的活动(例如转导、喂养、洗涂、最终配制)和其参数(例如，天数、体积、溫度）。随 后，启动程序化的软件（图3)。如在实施例1中，洗涂白细胞分离成分。标记在4-8°C发生(为 了富集CD6化阳性细胞，运是重要的，因为CD6化在室溫下从细胞的表面脱落）。标记的细胞 被富集并洗脱到作为管道组的部分的再应用袋中。该程序要求样品取样(使用包括在管道 组中的采样袋）。一旦细胞密度确定，运个信息被示出在程序中W及所需数量的细胞转移回 所述室中（例如le8)。然后含有le8的富集细胞的所需体积的富集细胞自动转移到培养室 中。然后将活化试剂添加到培养物中。在第1天，含有10ml中的慢病毒载体的袋被连接到管 道组（由于病毒载体的短的半衰期，运临时地进行）。病毒载体（在运种情况下为编码 CD20CAR的慢病毒载体的（包含4-IBB和CD3zeta信号结构域））然后被转移到活化的T细胞 上。该T细胞保持在37°C和富集5%的C〇2的空气中的培养中另外2天。在第5天，用过的培养 基被自动冲洗掉并用新鲜的培养基替换。此时培养物被设置在1型振摇(低振摇）W利用振 摇室的不定时缓慢振摇而溫和地悬浮T细胞。为了用新鲜的培养基喂养细胞，每隔一天替换 一半的培养基。在第9天，振摇速度被提高到3型振摇(更剧烈的再悬浮）。在第11-13天，生产 过程达到终点，用适于人类输注的溶液（即最终的制剂缓冲液)将细胞洗涂几次，并收获在 袋中用于进一步的临床操作（图4和6)。无论是用于直接输注或用于冷冻保存。分析所生产 的基因修饰T细胞的细胞组成（图10)，其转导细胞的百分比和每转导细胞的转基因表达水 平(分别图7A和B)。
[0120] 实施例3:在振摇条件下用高密度的激活培养物开始的基因修饰T细胞的自动化生 产
[0121] 从100-200ml的白细胞成分分离开始，类似于实施例2使用安装在CliniMACS Prodig/f'上的管道组TS520富集CD4和CD8T细胞。然而在本实施例中，高密度的4e6富集T 细胞/ml被转移到封闭的无菌管道组的腔室中。在第0天，富集的T细胞被接种于100ml中（图 9A)和使用MACS GMP hansAct CD3/CD28试剂盒和200IU 化-2在MACS GMP TexMACS培养基 中在3型振摇条件下立即进行活化。100ml中的细胞在第2天稀释，和从第4天开始每天进行 培养基替换直至培养结束。培养在第8天结束。令人惊讶地，结果表明，有可能在培养开始时 活化和扩增T细胞而没有稳态阶段的活化。在运样的动态条件下，可能非常迅速地产生大量 T细胞(即，在第8天图8A中2.8e9T细胞，相对于图4C中在第8天的1.8e9总细胞）。
[0122] 实施例4:从冷冻的白细胞分离成分开始的基因修饰T细胞的自动化生产
[0123] 解冻来自供体的冷冻白细胞分离成分的100ml袋并转移到化MACS GMP细胞分化 袋(Miltenyi Biotec Gm地产品）中和用MACS GMP TexMACS培养基稀释至化。在37°C下在 5%的C〇2中将解冻的细胞静置48小时，然后将细胞袋连接到安装在CliniMACSProdigy? 上的封闭的无菌管道组用于自动化细胞浓缩。然后进行如在实施例2中所描述的类似的生 产过程（使用CD62L富集的T细胞）。在第12天，基因修饰的T细胞被最终配制在100ml CliniMACS缓冲液中和转移到收获袋中。通过无菌接合到安装在仁liniMACS'K'上的封闭 的无菌管道组TS100将整个袋连接。此时，用抗IgGl微珠标记基因修饰的T细胞W允许将基 因修饰的T细胞与非修饰的T细胞分离。从稀释并静置的解冻细胞至基因修饰T细胞的生产 和分离的所有步骤使用几个不同的管道组和几种不同类型的程序W自动方式进行。
【主权项】
1. 一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的方法，其包括以下 步骤： a) 提供包含Τ细胞、Τ细胞亚群和/或Τ细胞祖细胞的细胞样品； b) 通过离心制备该细胞样品； c) 磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞； d) 使用调节剂活化该富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞； e) 遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞； f) 在培养室中扩增该遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞； g) 洗涤该培养的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞； 其特征在于，所有步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述调节剂选自于激动性抗体、细胞因子、重组共 刺激分子和小的药物抑制剂。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述调节剂是与珠或纳米结构偶联的抗-CD3和 抗-CD28抗体或其片段。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述纳米结构是纳米基质，该纳米基 质包含:a)活动的聚合物链的基质，以及b)连接到所述活动的聚合物链的基质的抗-CD3和 抗-CD28抗体或其片段，其中该纳米基质的尺寸是1至500纳米。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过用慢病毒、γ-逆转录病毒、α-逆 转录病毒或腺病毒转导所述细胞，或通过电穿孔或通过核酸、蛋白质、位点特异性核酸酶、 自复制RNA病毒或整合缺陷型慢病毒载体的转染进行所述Τ细胞、Τ细胞亚群和/或Τ细胞祖 细胞的遗传修饰。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过用慢病毒载体转导所述细胞进行 所述Τ细胞、Τ细胞亚群和/或Τ细胞祖细胞的遗传修饰。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述Τ细胞、Τ细胞亚群和/或Τ细胞祖 细胞的磁性分离是通过使用对于Τ细胞、Τ细胞亚群和/或Τ细胞祖细胞表面上的细胞表面标 志物特异性的抗原结合分子进行。8. 根据权利要求7所述的方法，其中对于所述Τ细胞、Τ细胞亚群和/或Τ细胞祖细胞表面 上的细胞表面标志物特异性的抗原结合分子选自于标志物⑶2、⑶3、⑶4、⑶8、⑶25、CD28、 CD27、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD95、CD127、CD137、a/0TCR、y/STCR、CCR7、PD-GPLag3。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖 细胞的活化、遗传修饰和/或所述扩增通过振摇条件进行。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述振摇条件通过旋转所述封闭的和无菌的细胞 培养系统的所述培养室实现，并且其中所述旋转沿一个或两个方向在大于〇和最大70x g之 间用离心力每1至120秒周期性地进行。11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述振摇条件在扩增步骤f)期间实现。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述活化通过在活化过程中使用从 0.5e6/ml细胞至4e6/ml细胞之间的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞密度进行。13. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述活化通过在活化过程中使用从 4e6/ml细胞至leVml细胞之间的高T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞密度进行。14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞 祖细胞的遗传修饰是引入编码嵌合抗原受体(CAR)或Τ细胞受体(TCR)的多核苷酸序列。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖 细胞表达所述CAR或TCR，并且其中在进行步骤g)之前，在额外的磁性分离步骤中将表达所 述CAR或TCR的所述细胞与不表达所述CAR或TCR的细胞分离。
【文档编号】C12N5/10GK106062185SQ201580011158
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年4月23日 公开号201580011158.1, CN 106062185 A, CN 106062185A, CN 201580011158, CN-A-106062185, CN106062185 A, CN106062185A, CN201580011158, CN201580011158.1, PCT/2015/58817, PCT/EP/15/058817, PCT/EP/15/58817, PCT/EP/2015/058817, PCT/EP/2015/58817, PCT/EP15/058817, PCT/EP15/58817, PCT/EP15058817, PCT/EP1558817, PCT/EP2015/058817, PCT/EP2015/58817, PCT/EP2015058817, PCT/EP201558817
【发明人】A·凯泽, M·阿森马赫尔, I·约翰斯顿
【申请人】美天旎生物技术有限公司