一种细胞因子融合抗体的制备及其应用
【专利摘要】本发明属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种靶向人血管内皮生长因子(VEGFR2，亦称KDR)的抗体JZB00与干扰素α(IFNα)的融合抗体JZA01、其制备方法及用途。本发明还公开了JZA01的重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列。本发明还提供了JZA01重链及轻链基因的构建方法，转染CHO细胞，有限稀释法挑取单克隆，后通过真核细胞分泌表达、亲和层析纯化获得融合抗体。本发明的融合抗体可特异性结合于VEGFR2，可以抑制肿瘤新生血管的生成，偶联的干扰素部分还可以发挥直接的肿瘤杀伤作用和免疫调节作用，同时不产生毒副作用，从而更好地抑制肿瘤的生长。该融合抗体在体外可以抑制人静脉内皮细胞(HUVEC)及部分肿瘤细胞的增殖。
【专利说明】
一种细胞因子融合抗体的制备及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与人VEGFR2特异结合的高亲和力全人 源融合抗体，该抗体以全人源的抗VEGFR2的全长抗体和IFNa为基础，通过基因重组构建成 融合基因，利用柔性肽将两段蛋白连接起来。该抗体一方面能抑制人血管内皮生长因子受 体2的活化，从而抑制肿瘤新生血管的生成，另一方面靶向作用使IFN富集于肿瘤及肿瘤新 生血管部位，发挥直接的肿瘤杀伤作用和免疫调节作用，且不产生毒副作用，是一种具有抗 血管生成活性和抗肿瘤活性的基因工程抗体。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞的发生发展离不开新生血管的营养供给，而新生血管的生长离不开各种 细胞因子及其受体的相互作用。现有研究表明，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体 (VEGF/VEGFR)信号通路对于新生血管的生成具有关键性的调节作用。VEGFR2作为VEGF的主 要受体，调节血管内皮细胞的增殖、存活、迀移和通透性的改变。
[0003]人血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2， 也称为VEGFR2或KDR、Flk-l，本文称作"VEGFR2"）是230kDa的跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸 激酶超家族，是血管生长因子(VEGF)的主要功能受体，主要分布在血管内皮细胞和淋巴内 皮细胞中，VEGF刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通过结合和 激活VEGFR2来实现，同时VEGFR2在一些肿瘤细胞表面也有表达。VEGFR2是一种III型的跨膜 蛋白激酶，人类的VEGFR2基因位于染色体4ql l_ql2，编码全长受体的1356个氨基酸，VEGFR2 在细胞内部时被翻译为约有150kDa，且没有明显糖基化的蛋白质，然后经过一系列的糖基 化处理，成熟时约有230kDa，表达在胞膜上。VEGFR2由于涉及到肿瘤形成，已经成为抗肿瘤 治疗的特异性靶目标。
[0003] 靶向VEGFR2药物主要有两类:一类是直接作用于受体细胞内区段以防止信号传导 的合成的酪氨酸激酶抑制剂(1'1(1)，主要包括31111；[1：；[11；[13、061'；[1：；[11；[13等 ；另一类是阻断配体 结合到受体胞外功能域的单克隆抗体(mAb)，包括雷莫卢单抗(Ramucirumab)等。
[0004] 雷莫卢单抗(Ramu cirumab)，商品名Cyramza)是抗人VEGFR2的人源化IgGl单克隆 抗体，它于2014年被美国食品药品管理局批准用于治疗晚期胃癌或胃食管结合部腺癌。 [000 5]干扰素（interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是 一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。干扰素具有广谱的抗病毒、抗肿瘤活性，同时 还可增强自然杀伤细胞(NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用， 是目前主要的抗肿瘤生物制品之一。但是干扰素因半衰期短、系统性毒副作用强等缺点限 制了其在临床上的应用。目前市场上已上市了一些长效干扰素，虽能提高干扰素的体内半 衰期，但并不能很好的降低其系统性毒副作用。借助基因重组技术将干扰素与靶向VEGFR2 的全长抗体偶联，既可以延长干扰素体内半衰期，同时可以借助抗体的靶向作用将干扰素 富集于肿瘤及肿瘤新生血管部位，降低其系统毒副作用，令其更有效地发挥抗肿瘤及免疫 调节作用，产生一种新型的具有抗血管生成活性和抗肿瘤活性的融合抗体。
【发明内容】
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人VEGFR2的融合抗体。本发 明蛋白的特征为特异性结合人VEGFR2胞外区，在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的 增殖及部分肿瘤细胞的增值。
[0008] 技术方案
[0009] 一种全人源的抗VEGFR2的融合抗体，其特征在于：以抗VEGFR2的全长抗体JZB00和 IFNa蛋白为基础，通过基因重组技术以柔性肽将两者连接。
[0010] 其中一条链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNa蛋白以柔性肽连接组成，其氨基 酸序列为SEQ N0.1;另一条为抗VEGFR2的全长抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ N0.2。
[0011] -种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的融合抗体。
[0012] 一种表达载体，含有上述的核酸。
[0013] -种重组宿主细胞，含上述的表达载体。
[0014] 上述任一项的抗体或抗体片段的应用，选择性地与VEGFR2结合或抑制VEGFR2与 VEGFR2配体的结合或中和VEGFR2。
[00?5]上述任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。
[0016]上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。
[0017 ]上述任一项的抗体或抗体片段的突变体。
[0018] 靶向VEGFR2融合抗体在肿瘤治疗方面的应用。
[0019] 发明进一步说明：
[0020] 本发明中全人源抗VEGFR2融合抗体重链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNa以 柔性肽(GGGGS)连接，轻链为抗VEGFR2的全长抗体的轻链。
[0021] 含有本发明血管内皮生长因子受体2融合抗体基因的表达载体和宿主细胞属于本 发明的保护范围。扩增本发明融合抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之 内。
[0022] 本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗血管内皮生长因子受体2 抗体的方法。
[0023] Western Blot鉴定分离纯化得到的JZA01;流式检测JZA01与高表达VEGFR2细胞株 HUVEC的结合;检测融合抗体加对人静脉内皮细胞HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用。 [0024]本发明得到的抗血管内皮生长因子受体2与人静脉内皮细胞HUVEC表面血管内皮 生长因子受体2具有高特异性结合，体外抑制HUVEC及部分肿瘤细胞生长实验结果表明，本 发明得到的融合抗体可以明显抑制HUVEC及部分肿瘤细胞的生长。本发明为治疗和诊断以 血管内皮生长因子受体2抗原的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗 法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。
【附图说明】 图1是JZA01基因重组分析图，重组基因包括重链基因大小约为1932bp，轻链基因大小 约为762bp。 图2是SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的JZAO1通过ProteinA亲和层析柱进行分 离纯化的结果。A为JZA01非还原电泳，B为JZA01还原电泳。 图3是纯化后的JZAOlWestern Blot鉴定图，A为非还原型，检测抗体为anti-human(H& 1)-册？;13为还原型，一抗为3111:;[-111111^11]^_，检测抗体为册?标记的羊抗鼠抗体 ;(]为还原 型，检测抗体为 anti-human(H&L)_HRP〇 图4是JZA01与HUVEC细胞流式结合图，描述JZA01与内皮细胞表面抗原的结合情况，结 合率约为39%，与母体单抗JZB00相当。 图5是一曲线图，描述JZA01对HUVEC细胞的生长抑制作用。 图6是一曲线图，描述JZA01对MDA-MB-231、HepG2、U937和NCI-N87四种肿瘤细胞的生长 抑制作用。
[0007] 本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人VEGFR2的融合抗体。本发 明蛋白的特征为特异性结合人VEGFR2胞外区，在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的 增殖及部分肿瘤细胞的增值。
[0008] 技术方案
[0009] 一种全人源的抗VEGFR2的融合抗体，其特征在于：以抗VEGFR2的全长抗体JZB00和 IFNa蛋白为基础，通过基因重组技术以柔性肽将两者连接。
[0010] 其中一条链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNa蛋白以柔性肽连接组成，其氨基 酸序列为SEQ N0.1;另一条为抗VEGFR2的全长抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ N0.2。
[0011] -种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的融合抗体。
[0012] 一种表达载体，含有上述的核酸。
[0013] -种重组宿主细胞，含上述的表达载体。
[0014] 上述任一项的抗体或抗体片段的应用，选择性地与VEGFR2结合或抑制VEGFR2与 VEGFR2配体的结合或中和VEGFR2。
[00?5]上述任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。
[0016]上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。
[0017 ]上述任一项的抗体或抗体片段的突变体。
[0018] 靶向VEGFR2融合抗体在肿瘤治疗方面的应用。
[0019] 发明进一步说明：
[0020] 本发明中全人源抗VEGFR2融合抗体重链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNa以 柔性肽(GGGGS)连接，轻链为抗VEGFR2的全长抗体的轻链。
[0021] 含有本发明血管内皮生长因子受体2融合抗体基因的表达载体和宿主细胞属于本 发明的保护范围。扩增本发明融合抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之 内。
[0022] 本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗血管内皮生长因子受体2 抗体的方法。
[0023] Western Blot鉴定分离纯化得到的JZA01;流式检测JZA01与高表达VEGFR2细胞株 HUVEC的结合;检测融合抗体加对人静脉内皮细胞HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用。 [0024]本发明得到的抗血管内皮生长因子受体2与人静脉内皮细胞HUVEC表面血管内皮 生长因子受体2具有高特异性结合，体外抑制HUVEC及部分肿瘤细胞生长实验结果表明，本 发明得到的融合抗体可以明显抑制HUVEC及部分肿瘤细胞的生长。本发明为治疗和诊断以 血管内皮生长因子受体2抗原的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗 法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。
【附图说明】
[0040]实施例4抗VEGFR2融合抗体与HUVEC细胞的流式结合
[0041 ] 消化HUVEC细胞，分为1 X 106每组，1500rpm、4 °C离心5min，PBS+2 %洗三次，分别与 100nM JZA01、100nM JZB00及脱脂牛奶溶液4°C作用lh<a500rpm、4°C离心5min，PBS+2%FBS 洗三次，与Donkey Anti-Human IgG(H+L)_FITC抗体（Life Sciences)4°C作用ltulSOOrpm、 4°C离心5min，PBS+2%洗三次，最后一次离心后用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。
[0042] 实施例5抗VEGFR2融合抗体对HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用
[0043] 将细胞制备成3X104cellS/ml细胞悬液，接种96孔细胞培养板，100μ1/孔，在37°C 5 % C02培养箱中培养24h。用2 %胎牛血清培养基配制药物，共有JZA01，JZB00及IFNa三组， 每组设置2 · 5nM，5nM，1 OnM，20nM，40nM，80nM，160nM，320nM共8个浓度（0 · 0InM，0 · InM，InM， 10nM，100nM，200nM共6个浓度）。将培养的细胞弃去上清，按照分组加入药物，每孔100yL每 组药物每个浓度设置三个平行孔，继续培养72h，每孔加入1 ΙμL的MTT，37 °C继续培养4h，小 心倾去上清，每孔加入150μ1 DMS0,在酶标仪570nm/630nm波长处测定光吸收值(0D值），计 算药物对细胞增殖的抑制率。JZA01的生物活性由细胞生长的抑制率评价。抑制率=(1-实 验组0D值/对照组0D值）X 100%。
【主权项】
1. 一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的融合抗体，其特征在于： 以抗VEGFR2的全长抗体JZBOO和干扰素（IFNa)为基础，通过基因重组技术以柔性肽将 两者蛋白连接。2. 根据权利要求1所述的一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的融合抗体，其特 征在于：其中一条链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNa蛋白以柔性肽连接组成，其氨基 酸序列为SEQ N0.1;另一条链为抗VEGFR2的全长抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ N0.2。3. -种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1的一种全人源的抗人血管内皮 生长因子受体2的融合抗体。4. 一种表达载体，含有权利要求5所述的核酸。5. -种宿主细胞，含有权利要求6所述的表达载体。6. 根据权利要求1或2任一项的抗体或抗体片段的应用，其特征在于选择性地与VEGFR2 结合或抑制VEGFR2与VEGFR2配体的结合或中和VEGFR2。7. 权利要求1或2任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。8. 权利要求1或2任一项的抗体或抗体片段的偶联物。9. 权利要求1或2任一项的抗体或抗体片段的突变体。10. 权利要求1所述的融合抗体在肿瘤治疗方面的应用。
【文档编号】C07K19/00GK106065033SQ201610159826
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年3月17日 公开号201610159826.1, CN 106065033 A, CN 106065033A, CN 201610159826, CN-A-106065033, CN106065033 A, CN106065033A, CN201610159826, CN201610159826.1
【发明人】张娟, 雪莉·莫里森, 任学艳, 王旻, 李晨晨, 李昭廷, 朱怡佳
【申请人】中国药科大学