药桑中1?脱氧野尻霉素的提取方法
【专利摘要】本发明公开了药桑中1?脱氧野尻霉素的提取方法，包括以下步骤：1）将药桑干燥粉末加入乙醇，超声提取，提取后离心，得到残渣和上清液；2）重复步骤1）的提取离心过程；3）将两次上清液合并，得到药桑初提取物；4）将药桑初提取物置于离心机中再次离心，并以微孔滤膜过滤，提取得到1?脱氧野尻霉素；5）将1?脱氧野尻霉素，以6?氨基喹啉基?N?羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯试剂进行柱前衍生化，经过高效液相色谱荧光法对DNJ进行质量控制。本发明提供的药桑中DNJ的提取方法，以药桑果实为研究对象，采用单因素多水平正交试验确定药桑中DNJ的提取工艺，用高效液相色谱结合荧光检测法其中DNJ含量，为新疆药桑的药用资源开发提供理论依据。
【专利说明】药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明设及生物碱提取技术领域，具体设及药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法。
【背景技术】
[0003] 药桑在植物分类学上属黑桑种（Morus nigra Linn.)，是自然界极为罕见的稀贵 桑树半栽培半野生资源，也是我国唯一的黑桑种，栽培适应地只限于新疆。药桑中含有大量 活性物质，运些活性物质包括黄酬类化合物、多糖类化合物和生物碱等。桑树中的生物碱成 分主要是野尻霉素(nojiri-mycin)及其衍生物。野尻霉素最早于1965年从链霉菌R-468的 发酵液中分离得到，1966年结构被鉴定。随后人工合成1-脱氧野尻霉素（1-de- 0巧 nojirimyein，DNJ)，化学名为（2R，3R，4R，5S)-2-(^ 甲基）-3,4,5-Ξ径基赃晚，是一种 天然糖的结构类似物。目前文献多从桑叶及桑枝中提取DNJ用于药理研究，多药桑果实中 DNJ的提取及含量测定尚无相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了药桑中1-脱氧野尻霉素的 提取方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方 法，包括W下步骤： 1) 将药桑干燥粉末置于具塞锥形瓶中，加入乙醇，超声提取，提取后置于离屯、机中进行 离屯、，得到残渣和第一次上清液； 2) 将步骤1)得到的残渣依照步骤1)的方法再次提取一次，得到第二次上清液； 3) 将步骤1)的第一次上清液和步骤2)的第二次上清液合并，得到药桑初提取物； 4) 将步骤3)得到的药桑初提取物置于离屯、机中再次离屯、，并W微孔滤膜过滤，提取得 到1-脱氧野尻霉素； 5) 将步骤4)得到的1-脱氧野尻霉素，W6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷亚氨基甲酸醋试 剂进行柱前衍生化，经过高效液相色谱巧光法对1-脱氧野尻霉素进行质量控制。
[0006] 进一步的，上述的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，所述步骤1)和步骤2)中，超 声提取中，药桑干燥粉末或残渣与乙醇的料液比为1 g: 150ml，超声功率为150w，提取时间为 lOmin;离屯、转速为lOOOOr/min，离屯、时间为20min。
[0007] 进一步的，上述的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，所述步骤4)中，药桑初提取 物的离屯、转速为1000化/min，离屯、时间为20min;微孔滤膜的孔径为0.22皿。
[0008] 进一步的，上述的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，所述步骤5)中，柱前衍生化 的过程为:取步骤4)得到的1-脱氧野尻霉素提取液10μ1于2ml的离屯、管中，加8化1 ksB化缓 冲液，满旋30s，使提取液充分混匀于Buff er中，再加入10μ1 6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷 亚氨基甲酸醋的乙腊溶液，混匀后于室溫反应5min，用ο. 22皿的一次性针头过滤器过滤后， 取1〇μ1进样分析。
[0009] 本发明的有益效果为:本发明提供的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，从新疆 药桑优势资源入手，W药桑果实为研究对象，采用单因素多水平正交试验确定药桑中DNJ的 提取工艺，进一步用高效液相色谱结合巧光检测法其中DNJ含量，为新疆药桑的药用资源开 发提供理论依据，特别是为新疆药桑果实中DNJ含量测定填补空白。
【附图说明】
[0010] 图1为对照品和供试品的色谱结果。
[0011] 其中，A为对照品，Β为供试品。
[0012] 图2为不同提取溶剂对药桑DNJ提取的影响。
[0013] 图3为不同料液比对药桑DNJ提取的影响。
[0014] 图4为不同时间对药桑DNJ提取的影响。
[0015] 图5为不同功率对药桑DNJ提取的影响。
[0016] 图6为提取次数对药桑DNJ提取的影响。
【具体实施方式】 [0017]实施例1: 1、 仪器与试剂： 1.1材料与试剂： 药桑在成熟期采自喀什市20120810-1，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为药桑 黑桑种。
[0018] 试剂：1-脱氧野尻霉素（中国药品生物制品检定所，批号:MUST-11050502);盐酸； 正下醇;冰乙酸；乙酸锭(分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷亚 氨基甲酸醋(AQC)衍生试剂(Waters公司）甲醇；乙腊(Fisher);超纯水(艾科）； 1.2仪器： 高效液相色谱仪LC-20AB(日本岛津，配有RF-20A巧光检测器，Lcsolution色谱工作 站），岛津色谱柱化impack VP-0DS，（4.6mm X 250mm，5皿，）；高功率数控超声波清洗器化Q- 500阳型，昆山市超声仪器有限公司）；PH计(雷磁PHSJ-3巧；离屯、机(TMk5A，上海菲恰尔分 析仪器有限公司）;分析天平(BS110S ); 2. DNJ对照品溶液的配制及衍生化： 2.1DNJ对照品溶液的配制： 精密称定DNJ标准品5. OOmg于5ml容量瓶中，加入水定容至刻度，摇匀得Img/mL的DNJ标 准液，备用。
[0019] 2.2 DNJ的衍生化： 取上述样品提取液1〇μ1于2ml的离屯、管中，加8化1 k浊化缓冲液，满旋30s，使样品充分 混匀于Buffer中，再加入ΙΟμΙ AQC乙腊溶液，混匀后于室溫反应5min，用0.22um的一次性针 头过滤器过滤后，取1〇μ1进样分析。
[0020] 3供试品溶液的制备及衍生化： 3.1供试品溶液的制备： 精密称定药桑干燥粉末0.1 g至具塞锥形瓶中，精密加入乙醇15ml，超声（150w)，lOmin， 冷却，置离屯、机转速1000化/min离屯、20min，取上清液。残渣按上述方法再提取一次，合并 上清液，备用。药桑提取液转移至离屯、管中，置离屯、机转速l〇〇(K)r/min离屯、20min，用0.22μ m微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
[0021] 4方法与结果： 4.1吸收波长的选择： 取对照品衍生后的反应液，用K3BO3扩大10倍体积于微量比色皿中在200-700皿波长范 围内扫描，结果在250nm波长处有最大吸收。
[0022] 4.2色谱条件： 采用岛津HPLC巧光法测定，色谱柱：岛津化impack ODS cl8(4.6巧50mm，5皿）;流动相： 0.02mmol/L乙酸锭(Ph6.5):乙腊(体积比为90 :10);最大激发波长为250皿;最大发射波 长为395 nm。流速为1. 0 mL/ min,进样量为ΙΟμΙ。结果如图1所示。
[0023] 4.3 DNJ提取的单因素考察： 4.3.1提取溶剂的考察： 称取药桑粉末9份，每份O.lg，置于具塞锥形瓶，分为Α、ΒΧΞ组，每组3份。A组每份加 20ml水，B组每份加20ml 65%乙醇，C组每份加20ml 0.05的盐酸溶液，密塞，称重，置超声波 清洗仪中超声提取20min，功率200W，离屯、巧000 r/min，离屯、lOmin)，将滤渣进行二次提取， 条件同第一次，合并两次滤液，冷却至室溫，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，过〇.22um 微孔滤膜。
[0024] 按3.3.2色谱条件项下色谱条件进行测定，比较不同溶剂对DNJ提取的影响。结果 如图2和表1所示，65%乙醇的提取率最高。
[0025]
[0026] 4.3.2溶剂量的考察： 称取药桑粉末15份，每份0.1 g，分为5组，每组3份，每组依次加65%乙醇5ml、10ml、15ml、 20ml、25ml，将提取次数固定为1次，提取时间固定为20min，密塞，称重，置超声波清洗仪中 超声提取20min，冷却至室溫，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.22um微孔滤 膜，按3.3.2色谱条件项下色谱条件进行测定，考察不同料液比对DNJ提取的影响。如表2和 图3所示，料液比对DNJ的提取率有一定影响，乙醇的用量太小会影响DNJ的提取，乙醇的用 量太大会造成浪费，当加15ml乙醇提取后DNJ含量反而减少。
[0027]
[002引4.3.3提取时间的考察： 称取药桑粉末15份，每份0.1 g，分为5组，每组3份，每组按10、20、30、40、50min提取，将 乙醇量固定为20ml，提取次数固定为1次，提取液冷却至室溫，再称定重量，用乙醇补足减失 的重量，摇匀，过0.22um微孔滤膜，按3.3.2色谱条件项下色谱条件进行测定，考察不同提 取时间对DNJ提取的影响。如表3和图4所示，DNJ的提取率随提取时间的增加而增加，但提取 时间增加到30minW后，DNJ提取含量变化不大。
[0029]
[0030] 4.3.4提取功率的考察 称取药桑粉末9份，每份0.1 g，分3组，将乙醇量固定为20ml，提取时间固定为lOmin，提 取次数固定为1次，在实验室条件下，选择了60W、10抓、150WJ00W和250W 5个功率进行超声 提取，提取液冷却至室溫，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.22um微孔滤膜， 按3.3.2色谱条件项下色谱条件进行测定，考察不同提取功率对DNJ提取的影响，结果如表4 和图5所示。当超声仪的工作频率为150W时，提取率最高。
[0031]
[0032] 4.3.5提取次数的考察 称取药桑粉末3份，每份0.1 g，提取时间固定为20min，第一次提取加乙醇10ml，第二次 提取加乙醇10ml，第Ξ次提取加乙醇10ml，每次提取液单独测量，提取液冷却至室溫，再称 定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，置离屯、机SOOOr/min离屯、lOmin，过0.22um微孔滤膜， 按3.3.2色谱条件项下色谱条件进行测定，考察不同提取次数对DNJ提取的影响。如表5和 图6所示，DNJ的提取率随提取次数的增加而增加，但提取次数增加到2次W后，DNJ含量变化 不明显。
[0033]
[0034] 4.4正交试验 根据单因素试验的结果，选择影响DNJ提取效果各因素中有意义的水平做正交试验，对 结果进行极差分析，W确定最佳提取条件。W提取时间(A)、提取次数(B)、料液比(C)、功 率(D) 4个因素，每个因素选用3个水平，用L9(34)正交表进行试验。因素水平见表6,正交设 计及数据处理如表7所示。
[0035]
[0036]
[0037]
[0038] 由表7可看出，影响DNJ得率的因素主次顺序为:料液比、超声功率、提取次数和超 声时间。较佳的工艺条件为A3C2化Bi，即料液比1:150,超声功率150W，提取次数2次，超声时 间lOmin。
[0039] 4.5最佳提取工艺条件的验证： 按上述最佳提取工艺条件A3C2化Bi进行3次验证试验，其结果如表8所示。
[0040]
[0041] 由验证结果可知，按最佳工艺条件提取得到的DNJ含量均高于其它各正交试验值， 同时其RSD=1.46%(n=3)，说明此工艺条件稳定、可行。
[0042] 最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将药桑干燥粉末置于具塞锥形瓶中，加入乙醇，超声提取，提取后置于离心机中进行 离心，得到残渣和第一次上清液； 2) 将步骤1)得到的残渣依照步骤1)的方法再次提取一次，得到第二次上清液； 3 )将步骤1)的第一次上清液和步骤2 )的第二次上清液合并，得到药桑初提取物； 4) 将步骤3)得到的药桑初提取物置于离心机中再次离心，并以微孔滤膜过滤，提取得 到1-脱氧野尻霉素； 5) 将步骤4)得到的1-脱氧野尻霉素，以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯试 剂进行柱前衍生化，经过高效液相色谱荧光法对1-脱氧野尻霉素进行质量控制。2. 根据权利要求1所述的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，所述步骤1) 和步骤2)中，超声提取中，药桑干燥粉末或残渣与乙醇的料液比为lg: 150ml，超声功率为 150w，提取时间为lOmin;离心转速为10000r/min，离心时间为20min。3. 根据权利要求1所述的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，所述步骤4) 中，药桑初提取物的离心转速为l〇〇〇〇r/min，离心时间为20min;微孔滤膜的孔径为0.22μπι。4. 根据权利要求1所述的药桑中1-脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，所述步骤5) 中，柱前衍生化的过程为:取步骤4)得到的1-脱氧野尻霉素提取液10μ1于2ml的离心管中， 加80μ1 k3B03缓冲液，涡旋30s，使提取液充分混匀于Buffer中，再加入10μ1 6-氨基喹啉基-Ν-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯的乙腈溶液，混匀后于室温反应5min，用0.22μπι的一次性针头 过滤器过滤后，取1〇μ1进样分析。
【文档编号】C07D211/46GK106083697SQ201610491943
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】马晓丽, 张晖, 宋峰峰, 李新霞, 孙莲
【申请人】新疆医科大学