玉米胚乳蛋白体的分离方法
【专利摘要】本发明涉及一种玉米胚乳蛋白体的分离方法。步骤如下：将授粉20?25天的新鲜玉米籽粒液氮研磨至粉末，重悬于溶液A(10 mM Tris?HCl pH 8.5,10 mM KCl,5 mM MgCl2,7.2% sucrose,add 1 mM DTT,1mM PMSF and 罗氏混合蛋白酶抑制剂)，300 g离心30分钟去除细胞碎片，上清经2轮粗级不连续蔗糖密度梯度(1.0 M/L→1.5 M/L→2.0 M/L)离心，取1.5 M→2.0 M蔗糖界面的组分2倍溶液B(10 mM Tris?HCl pH 8.5,10 mM KCl)稀释后，经2轮细级不连续蔗糖密度梯度(40% w/w → 45% → 50% → 55% → 60%)离心，取50%?55%之间的组分2倍溶液B稀释后，经30?60%连续密度梯度离心，收集第14层组分10倍溶液B稀释，13 000 rpm 离心15 min去除蔗糖后，得到高纯活性蛋白体。本方法提取纯度极高且保持生物活性，为利用蛋白体生物反应器生产活性物质提供了重要技术手段。
【专利说明】
玉米胚乳蛋白体的分离方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种玉米胚乳蛋白体的分离方法。
技术背景
[0002]玉米(Zeaffiajs)是一年生禾本科草本植物，是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物。玉米不仅是人们的口粮和“饲料之王”，也是重要工业原料，可加工成的工业产品达3000多种。就玉米利用而言，大体经历了作为人类口粮、牲畜饲料和工业生产原料的三个阶段，口粮消费占玉米总消费的比重大约在5%左右。玉米是三大粮食品种之一，为解决人类的温饱问题起到很大作用。时至今日，玉米仍然是全世界各国人民餐桌上不可或缺的食品。
[0003]玉米胚乳中的储藏物质对籽粒表型和萌发具有重要影响，玉米的储存物质主要有蛋白、油脂和淀粉。而醇溶蛋白是玉米胚乳发育过程中主要的储藏蛋白，约占玉米总蛋白的60%_70%。醇溶蛋白是玉米籽粒的储存蛋白，在胚乳发育时期，醇溶蛋白合成于多聚核糖体并被转运到内质网内腔进行组装形成蛋白体。在发育的胚乳中蛋白体逐渐增大，这反映了细胞成熟的过程。
[0004]植物种子中的贮藏蛋白可以方便的折叠、装配和稳定装配形成一个独特的细胞器，即蛋白质。蛋白体是在内质网腔内合成的，高尔基体在储藏蛋白合成中发挥重要作用。在种子萌发时，蛋白体肿胀融合，引起细胞产生中央液泡，能保持膜的完整性。蛋白体可以看成是液泡膜起源于内质网的一个例证。在玉米中，蛋白体直接在胚乳细胞的内质网腔内形成，玉米醇溶蛋白占种子总蛋白总量一半以上。醇溶蛋白组成蛋白体具有时空差异。糊粉层中的蛋白体是最小的并含有很少量或者不含α-醇溶蛋白醇溶蛋白和γ -醇溶蛋白。细胞中远离糊粉层的蛋白体则是逐渐增大的。在较大的蛋白体的内部，醇溶蛋白的内腔是融合在一起的。玉米OjOag1Ue和突变体表现出一种籽粒不透明、柔软、粉质的表型，研究发现opawe和突变可以有效改变籽粒中蛋白的种类和氨基酸的含量，有利于提尚轩粒的品质。
[0005]重组蛋白体系统能够简单高效生产高纯度且具有活性的蛋白质后其他物质。例如，溶酶体贮积症是一种适合于酶替代治疗法的罕见遗传性疾病。现在发展植物酶替代法治疗溶酶体贮积病等黏多糖贮积症，可以通过基因靶标机制在玉米种子胚乳中表达α-L-艾杜糖苷酸酶。在分别使用调节(5'和3,-UTR)和γ-醇溶蛋白的信号肽编码序列的情况下，免疫定位，细胞组分分离和原位RT-PCR都表明，α-L-艾杜糖苷酸酶和其mRNA都定位在内质网(ER)衍生性蛋白质体和蛋白体-ER区域。以这种方法制得的a-L-艾杜糖苷酸酶具有高活性，适合于体外磷酸化。这种以胚乳蛋白体系统生产活性物质的方法已得到广泛重视，也被视为一种潜在的生产治疗性蛋白的重要方法。此外该种蛋白体表面具有较高的抗酶消化能力，保证生物活性物质在胃肠道中免受酶消化，提高药物活性。但是，目前还缺乏分离高纯度活性胚乳蛋白体的技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于提供一种玉米胚乳蛋白体的分离方法。
[0007]本发明的目的之二在于提供利用蛋白体系统生产重组蛋白或活性药物的分离方法。
[0008]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种玉米胚乳蛋白体的分离方法，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.利用蔗糖不连续密度梯度离心法将蛋白体粗提物从玉米籽粒中分离出来；
b.通过蔗糖高密度不连续密度梯度和连续密度梯度法，将步骤a所得蛋白体粗提物进一步纯化；
c.通过稀释离心法将步骤b所得纯化后的蛋白体粗提物去除蔗糖获得玉米高纯度胚乳蛋白体。
[0009]上述的步骤a的具体方法为:
a-Ι.取授粉后20-25天新鲜玉米籽粒，液氮研磨至粉末，重悬于溶液A中，冰上静置15分钟，4°C，300 g离心30分钟；所述的溶液A的成分为:10 mM Tris-HCl pH 8.5,10 mMKCl, 5 mM MgCl2,7.2% sucrose,1 mM DTT,ImM PMSF 和罗氏混合蛋白酶抑制剂；
a-2.将步骤a-Ι所得上清液经粗级不连续蔗糖密度梯度，该梯度为1.0 M/L，1.5 M/L，
2.0M/L，4°C，35100 rpm超速离心I h，取梯度为1.5 M和2.0 M蔗糖界面的组分，用2倍体积的溶液B稀释后，重复该密度梯度I次获得蛋白体粗提物；所述的溶液B的成分为:10 mMTris-HCl pH 8.5和 10 mM KCl。
[0010]上述的步骤b的具体方法为:
b-Ι.将步骤a所得蛋白体粗提物用2倍体积的溶液B稀释后，经细级不连续蔗糖密度梯度，该蔗糖密度梯度为:40% w/w，45%，50%，55%和60%，4°C，35100 rpm超速离心I h，取50%-55%之间的组分用2倍体积的溶液B稀释后，重复该密度梯度I次；
b-2.将步骤b-Ι所得产物取50%-55%之间的组分2倍体积的溶液B稀释后，经30?60%界/?连续密度梯度，4°(:，35100 rpm超速离心I h，收集第14层组分。
[0011]上述的步骤c的具体方法为:将步骤b产物用1倍体积的溶液B稀释，4°C，13000rpm离心15 min去除鹿糖后，即得到玉米胚乳蛋白体。
[0012]1.0M^l.5M—2.0M不连续蔗糖密度梯度制备:先分别配制1.0M/L、1.5M/L和2.0M/L的蔗糖溶液，取Backman公司12.5ml规格的超速离心管，倾斜管壁成45°，移液器依次吸取2.0M、1.5M和1.0M的蔗糖沿管壁缓慢加入防止不同浓度的蔗糖溶液互溶，每个3mL
40% w/w 45% 50% 55% 60%不连续蔗糖密度梯度制备:先分别配制40%(w/w ),45%、50%、55%和60%的蔗糖溶液，取Backman公司12.5ml规格的超速离心管，倾斜管壁成45°，移液器依次从高浓度到低浓度吸取蔗糖溶液沿管壁缓慢加入防止不同浓度的互溶，每个2mL。
[0013]30?60% (w/w)连续鹿糖密度梯度制备:先分别配制30% (w/w )和60%的鹿糖溶液，取Backman公司12.5ml规格的超速离心管，倾斜管壁成45°，移液器依次从高浓度到低浓度吸取蔗糖溶液沿管壁缓慢加入防止不同浓度的互溶，每个4mL，将超速离心管置于调平的密度梯度制备仪(B1campGradient Master)上，选择30%—60% w/w Suc程序运行。从上到下依次收集蔗糖梯度样品，每份600 μ?，取第14层组分，10倍溶液B稀释，4°C，13 000 rpm离心15 min去除蔗糖后，即得到高纯的玉米胚乳蛋白体。
[0014]本发明方法能提取纯度极高且保持了生物活性的蛋白体，为利用蛋白体生物反应器生产活性物质提供了重要的技术手段。
【附图说明】
[0015]图1蛋白体粗级提取和纯化的流程示意图；
图2蛋白体的提取和纯化过程中个步骤的照片；
图3在30%-60%的连续密度梯度中，各个细胞器的分布情况，选取各个细胞器Marker蛋白抗体的Western Blot检测图；
图4 ER特异性染料染色后，40%445%450%^55%460%不连续蔗糖密度梯度各个组分中蛋白体的富集情况(灰白色斑点为蛋白体);
图5罗丹明B乙酯特异染色后，连续蔗糖密度梯度各个组分中蛋白体的富集情况(灰白色斑点为蛋白体)。
[0016]图6显微镜检测蛋白体纯度。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,3rd ed.)或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular B1logy—A Laboratory Manual, Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]实施例1
1)取授粉后20天W22玉米籽粒，液氮研磨至粉末，取1g重悬于溶液A，冰上静置15分钟，40C，300 g离心30分钟，去除细胞碎片等杂质；
2)上清经粗级不连续蔗糖密度梯度(1.0M/L—1.5 M/L—2.0 M/L)，4°C，35100 rpm超速离心I 11，取1.5 M—2.0 M蔗糖界面的组分2倍溶液B(10 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mMKCl)稀释后，重复该密度梯度一次；
3)取1.5M—2.0 M蔗糖界面的组分2倍溶液B稀释后，经细级不连续蔗糖密度梯度(40%w/w 45% 50% 55% 60%),4°C,35100 rpm超速离心I h，取50%_55%之间的组分2倍溶液B稀释后，重复该密度梯度一次；
4)取50%-55%之间的组分2倍溶液B稀释后，经30-60%(w/w)连续密度梯度，4°C，35100rpm超速离心I h，收集第14层组分；
5)10倍溶液B稀释，4°C，13000 rpm离心15 min去除蔗糖后，即得到高纯的活性蛋白体。
[0019]实施例2
I)取授粉后25天B73玉米籽粒，液氮研磨至粉末，取1g重悬于溶液A，冰上静置15分钟，40C，300 g离心30分钟，去除细胞碎片等杂质； 2)上清经粗级不连续蔗糖密度梯度(1.0M/L—1.5 M/L—2.0 M/L)，4°C，35100 rpm超速离心I 11，取1.5 M—2.0 M蔗糖界面的组分2倍溶液B(10 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mMKCl)稀释后，重复该密度梯度一次；
3)取1.5M—2.0 M蔗糖界面的组分2倍溶液B稀释后，经细级不连续蔗糖密度梯度(40%w/w 45% 50% 55% 60%),4°C,35100 rpm超速离心I h，取50%_55%之间的组分2倍溶液B稀释后，重复该密度梯度一次；
4)取50%-55%之间的组分2倍溶液B稀释后，经30-60%(w/w)连续密度梯度，4°C，35100rpm超速离心I h，收集第14层组分；
5)10倍溶液B稀释，4°C，13000 rpm离心15 min去除蔗糖后，即得到高纯的活性蛋白体。
[0020]实施例3
1)连续蔗糖密度梯度离心后，从上到下依次收集样品，每份600yl，采用甲醇-氯仿抽提方法去除样品中高密度蔗糖；
2)取上述处理的蛋白质样品进行SDS-PAGE，将蛋白电转至硝酸纤维素膜上；
3)分别取蛋白体、内质网、线粒体和过氧化物酶体Marker蛋白的抗体WesternBlot检测上述处理得到的蛋白样品；
4)一抗孵育两小时，TBST洗膜，6次，每次5分钟；
5)二抗孵育两小时，TBST洗膜，6次，每次5分钟，压片显影，结果参见图3。
[0021 ] 实施例4
1)分别取40%—45%—50%—55%—60%不连续蔗糖密度梯度各个组分用ER特异性荧光染料进行30分钟染色后置于Confocul下观察，结果参见图4，图中红色的荧光小点为被荧光染料特异染色的蛋白体；
2)分别取连续蔗糖密度梯度各个组分用蛋白体特异性荧光染料罗丹明B乙酯进行染色30分钟后置于Confocul下观察，结果参见图5，图中绿色的荧光小点为被荧光染料特异染色的蛋白体。
[0022]3)取最终收集的连续密度第14层组分，碱性品红染色，显微镜观察如图6所示。
[0023]4)进一步对图6中的蛋白体进行纯度分析，共随机选取相同大小10个视野进行统计分析，其中平均蛋白体体数目为59个，平均杂质信号为4，计算纯度为93.6。
【主权项】
1.玉米胚乳蛋白体的分离方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.利用蔗糖不连续密度梯度离心法将蛋白体粗提物从玉米籽粒中分离出来； b.通过蔗糖高密度不连续密度梯度和连续密度梯度法，将步骤a所得蛋白体粗提物进一步纯化； c.通过稀释离心法将步骤b所得纯化后的蛋白体粗提物去除蔗糖获得玉米高纯度胚乳蛋白体。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述的步骤a的具体方法为: a-Ι.取授粉后20-25天新鲜玉米籽粒，液氮研磨至粉末，重悬于溶液A中，冰上静置15分钟，4°C，300 g离心30分钟；所述的溶液A的成分为:10 mM Tris-HCl pH 8.5,10 mMKCl, 5 mM MgCl2,7.2% sucrose,1 mM DTT,ImM PMSF 和罗氏混合蛋白酶抑制剂； a-2.将步骤a-1所得上清液经粗级不连续蔗糖密度梯度，该梯度为1.0 M/L，1.5 M/L，2.0M/L，4°C，35100 rpm超速离心I h，取梯度为1.5 M和2.0 M蔗糖界面的组分，用2倍体积的溶液B稀释后，重复该密度梯度I次获得蛋白体粗提物；所述的溶液B的成分为:10 mMTris-HCl pH 8.5和 10 mM KCl。3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述的步骤b的具体方法为: b-Ι.将步骤a所得蛋白体粗提物用2倍体积的溶液B稀释后，经细级不连续蔗糖密度梯度，该蔗糖密度梯度为:40% w/w，45%，50%，55%和60%，4°C，35100 rpm超速离心I h，取50%-55%之间的组分用2倍体积的溶液B稀释后，重复该密度梯度I次； b-2.将步骤b-1所得产物取50%-55%之间的组分2倍体积的溶液B稀释后，经30?60%界/?连续密度梯度，4°(:，35100 rpm超速离心I h，收集第14层组分。4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述的步骤c的具体方法为:将步骤b产物用10倍体积的溶液B稀释，4°C，13 000 rpm离心15 min去除鹿糖后，即得到玉米胚乳蛋白体。
【文档编号】C07K1/14GK106084019SQ201610277276
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月1日 公开号201610277276.3, CN 106084019 A, CN 106084019A, CN 201610277276, CN-A-106084019, CN106084019 A, CN106084019A, CN201610277276, CN201610277276.3
【发明人】王桂凤, 王佳佳, 孙晓亮, 韩亮, 王刚, 宋任涛
【申请人】上海大学