Bace1剪切型高效价抗体的制备及应用
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的BACE1剪切型高效价抗体及应用。利用基因工程技术将BACE1剪切型基因克隆到原核表达载体中，酶切鉴定后用重组质粒转化大肠杆菌，IPTG诱导产生GST?BACE1146?189aa和GST?BACE1190?214aa融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。这两种抗BACE1剪切型多克隆抗体效价与特异性良好，可以应用于细胞中BACE1不同剪切型52KD、49KD的检测以及四种剪切型的区分，并能有效检出BACE1剪切型在不同细胞中的差异表达，对于系统研究BACE1功能及其在AD中的作用机制意义重大。
【专利说明】
BACE1剪切型高效价抗体的制备及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制备 GST-BACE1融合蛋白的多克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默症(Alzheimer ' s disease， AD)，俗称老年痴呆症，是一种以进行性认 知障碍和记忆力损害为主的致死性中枢神经退行性疾病，AD主要病理特征之一是在神经细 胞外由β淀粉样蛋白（Αβ)形成的淀粉样斑块（amyloid plaque)，Αβ是由APP(Amyloid Precursor Protein)在β剪切酶(BACE1)和γ剪切酶复合物的相继作用下产生。
[0003] BACE1蛋白又称β位点ΑΡΡ裂解酶1，是一种膜结合的天冬氨酸蛋白酶，是裂解ΑΡΡ产 生Αβ的关键酶，它在多种组织中都有表达，在脑和胰腺中表达最高。在神经元中的BACE1活 性较高，而胰腺中高表达的BACE1是缺失了外显子3的无活性片段，这种缺失了部分外显子 的表达方式被称为选择性剪切。根据现有的文献报道，BACE1的选择性剪切存在A、B、C、D四 种长型，分别为55KD、52KD、49KD和47KD。迄今为止，关于这几种剪切型的功能以及与Αβ的作 用机制和与AD的关系，还没有更多的报道和研究，但由于四种剪切型的大小接近，为其研究 造成很大困难，所以急需可以分别这几种剪切型的技术手段。
[0004] 对于一种新的蛋白质的功能的研究，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测 和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗 原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的BACE1蛋白高效价抗体用于检测49KD和52KD 两种剪切型，可以有效地分辨这两种剪切型，对于系统研究BACE1作用机制意义重大，为开 发治疗AD的药物提供了依据和线索。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是建立一种能够用于BACE1蛋白49KD和52KD两种剪切型的检测的模 型，为从蛋白水平深入研究BACE1剪切型的蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
[0006] 用于区分BACE1四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的2个抗体片段分别为： BACE1146-l89aa(insertl)，BACEl19(^2 14aa(insert2)【图l】。BACEl146-l89aa可用于识别BACEl剪切 型55KD和可用于识别BACE1剪切型55KD和49KD。
[0007] BACE1 剪切型 55KD 可同时被 BACE1146-识另lj;BACEl 剪切型 52KD 只 可被BACE1146-18-识别；BACE1剪切型49KD只可被别；BACE1剪切型47KD既不 能被BACEll46-189aa识别，又不能被BACEll90-214aa识别。
[0008]
[0009]注:表中" V "表示包含该片段且能被该片段识别，" X"表示不包含该片段且不能 被该片段识别；
[0010] 根据此原理，我们从Genebank中获取这两个片段的序列，制备用于检测BACE1-一 49KD和BACE1--52KD两种剪切型的蛋白高效价抗体。利用基因工程技术，将BACE1蛋白N端 第190个氨基酸至214个氨基酸（insert 2)、第146至189个氨基酸（insert 1)对应的DNA片 段克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌 BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导产生GST-BACEl19()-214 aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用Pr01e inA/G将 其纯化，获得2个多克隆抗体，分别能够检测BACE1的49KD和52KD两种剪切型，并且采用 ELISA和Western blot检测证明这两个抗体的效价及特异性均很高。
[0011] 本发明的GST-BACE119Q-madPGST-BACElws-I8 9aa融合蛋白是将利用特殊序列构建 GST-BACE119Q-214aJPGST-BACE 1W6-18^融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特 异性的GST-BACE119Q-maJPGST-BACElws-18^融合蛋白，这两段氨基酸序列以及对应的核苷 酸序列分别为：
[0012] 190-214AA(75bp)
[0013] 氨基酸序列：
[0014]
[0021] 碱基序列：
[0022；
[0023] 这种GST-BACE1·-m^GST-BACElws-i89aa融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下 步骤：
[0024]第一步，克隆载体的构建
[0025] 从人BACE1基因全长上应用PCR技术以pCDNA3.1-Flag-BACEl为模板，扩增得到的 目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。 [0026] 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建
[0027] 将克隆质粒和质粒pGEX-4T-l双酶切后，利用回收试剂盒获得BACEl19Q-214 a3P BACEImhs^基因片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重 组体，并且测序进一步确定。
[0028] 第三步，GST-BACE119Q-maJPGST-BACElws-i 89aa融合蛋白的诱导表达和纯化
[0029]重组质粒 PGEX-4T-1 /BACE119Q-214aJPPGEX-4T-1 /BACE1W6-i89aa 转化大肠杆菌 BL21， 利用 IPTG诱导，GST-BACE119Q-214aJPGST-BACE 1W6-18^融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴 定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-S印harose 4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。
[0030] 第四步，兔抗BACE119Q-maJPBACElws-I89aa抗血清的制备及纯化
[0031] 以纯化的BACE119q-maJPBACElws-i89aa融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫 用500yg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取 耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500yg纯化的GST-BACElumajPGST-BACEl^-isw融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉 注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后lwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当 抗体效价达到1:100000时，颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗BACE1血清，准备蛋 白A sepharose CL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱， 达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检 测其效价及特异性，结果显示这两种抗体可特异性的与BACE1剪切型蛋白结合。
[0032] 利用MCEl19()-214aa和MCEl146-l89 aa蛋白片段氨基酸基因序列成功地构建631'_ BACE119Q-madPGST-BACElws-18!^融合蛋白原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的 GST-BACE119q-214a3PGST-BACElM6-189时融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗631'_ BACE119Q-majPGST-BACEln189aa融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价 及特异性，结果表明抗体效价高达1:100000且特异性良好。
[0033]抗体可应用于细胞中BACE1剪切型蛋白的检测并能有效检出BACE1剪切型蛋白在 不同组织及细胞株中的差异表达，对于进一步探究BACE1选择性剪切的功能以及与Αβ产生 机制的相关性上很有帮助，对于系统研究BACE1剪切型蛋白功能及其在阿尔兹海默症中作 用机制意义重大，同时我们制备的抗体为检测不同疾病条件下不同BACE1的剪切型表达并 以此判定BACE1蛋白表达与疾病的关系奠定了基础。
【附图说明】：
[0034]图1为抗体设计模式图
[0035]图2为PCR扩增出的BACE1基因片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0036] 图3为重组GST载体琼脂糖凝胶电泳图；
[0037] 图 4 为GST 及GST-BACE1 融合蛋白 SDS-PAGE 图；
[0038] 图 5 为ProteinA/G纯化后的 BACE1 抗体 SDS-PAGE 图；
[0039]图6为间接ELI SA法测定抗体的效价；
[0040] 图7为抗血清特异性的Westernblot分析。
[0041 ]图8为细胞中过表达不同剪切型的突变质粒，抗体Westernblot分析
【具体实施方式】：
[0042]实施例 1:抗GST-BACE119Q-maJPGST-BACElws-i89aa 剪切型血清的在制备 [0043] 1、PCR-PMD18-T/BACE119Q-maJPBACElws-1893重组质粒的构建
[0044] BACE1 基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM 001207048。以pCDNA3.1-Flag-BACE1 为模板，190-214aa上游引物为GGA TCC ATG CCT GAC GAC TCC CTG GAG CCT TTC TTT GAC TCT CTG GTAAAG(含Bamhl酶切位点）；下游引物为5'-CTC GAG CTA CTG CAG GGA GGA GAG GTT GGGAAC GTG GGT CTG CTT TAC CAG(含Xhol酶切位点）<a46-189aa上游引物 为5'-GGATCC ATG GTA AGC ATC CCC CAT GGC(含Bamhl酶切位点）；下游引物为5'-CTC GAG CTA CCT GGC AAT CTC AGC ΑΤΑ(含Xhol酶切位点）。应用PCR成功扩增出了BACE1基因上25 个和44个氨基酸对应75bp和132bp的DNA序列【图2】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接， 将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5a中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提 重组质粒后，以BamH I和Xhol I双酶切鉴定。
[0045] 2、原核表达载体pGEX-4T-l的构建
[0046] 将含有BACE1基因片段的pMD18-T质粒经BamHI和Xhol双酶切后，利用回收试剂盒 获得BACE119Q-maJPBACEl^-1893基因片段，同时用相同的酶处理质粒PGEX-4T-1。然后将回 收的BACE1 -214aJPBACE 1W6-i89a基因片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下 于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体，结果显示该BACE1基因两个片段均正确【图3】。
[0047] 3、GST-BACE119q-m^PGST-BACElws-i89a 融合蛋白的诱导表达和纯化 [0048] 重组质粒PGEX-4T-1/BACE1剪切型转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培 养基中，37°C振摇培养过夜。次日，将培养物按1:50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继 续在37°C摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5~0.6时，加入IPTG至终浓度为 0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C继续培养4~5h。离心收集菌体，以SDS-PAGE 进行鉴定GST-BACE119Q-n^JPGST-BACElwe-1893融合蛋白的表达【图4】，并优化表达条件，进 行大量扩增诱导。以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液 的沉淀。用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4°C离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1 (含20mM谷胱甘肽、50mM TrisCl，pH=8·0)洗脱， 收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴 定纯化产物【图5】。
[0049] 4、兔抗 BACE1190-214aa 和 BACE1146-189a 抗血清的制备
[0050] 以纯化的GST-BACE119Q-m^PGST-BACEl^-I89a融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔， 初次免疫用500yg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。 免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500yg纯 化的GST-BACE1 19Q-madPGST-BACElws-i89a融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四 脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后lwk取耳血，用ELISA法测定抗体的 效价，当抗体效价达到1:100000时，颈动脉放血，收集血清。
[0051 ] 5、ProteinA/G 纯化抗 BACEli9Q-2i4aa 和 BACEli46-i89a 血清
[0052] 将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血 清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加 PH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的 收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色结果显示纯化效果明显，纯化后的样 品有清晰的轻、重链带。
[0053]实施例 2:GST-BACE119Q-maJPGST-BACElws-1893抗体的分析及应用 [0054] 1、GST-BACE119q-maJPGST-BACElws-189 3抗体效价的测定
[0055] 用GST-BACE119Q-maJPGST-BACElws-i89a融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为 对照，将纯化后的GST-BACE119Q-m^PGST-BACElws-1893抗体先稀释10倍再倍比稀释后，用间 接ELISA测定抗体的效价。结果显示，免疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-BACE1 19Q-214aa 和 GST-BACE1W6-1893的抗体，GST-BACE119Q-214 aJPGST-BACE 1W6-1893抗体的滴度高达 1:100000 以上【图6】。
[0056] 2、GST-BACE119〇-214a4PGST-BACE 1M6-1893抗体应用于细胞中 BACE 1 剪切型蛋白的检 测
[0057] 以可溶性GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a两段融合蛋白作免疫原而制 备的兔抗鼠 GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a两种高效价血清进行Western blot,结果发现在30KD处出现特异性的蛋白条带，结果提示抗GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a两种血清高特异性【图7】。
[0058] 收集培养的前列腺HK293T，过表达BACE1剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的突变质 粒，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5 %脱脂奶粉封闭lh，依次滴加兔抗BACE1抗体(室温 2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP(室温反应lh、PBS洗涤3次），最后加底物DAB显色，并拍照 【图8】。结果显示，我们制备的BACE1190-214aa和BACE1146-189a抗体与293T细胞株中所表 达的BACE1剪切型蛋白都发生了抗原-抗体反应，在Marker指示下的，我们的抗体1可以特异 性识别BACE1 - 49KD，抗体2可以特异性识别BACE1 - 52KD。
[0067] 146-189AA(132bp)
[0068] 氨基酸序列：
[0069]
【主权项】
1. 发明保护两种抗体共同用于BACE1四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的区分，w及 运两种抗体用于BACE1剪切型中52KD和49KD的鉴定； 用于区分BACE1四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的2个抗体片段分别为： BACEli46-i89aa( insertl)，BACE1i9〇-2i4aa(insert2);注:表中"V "表示包含该片段且能被该抗体识别，"X"表示不包含该片段且不能被该 抗体识别； 抗体84〔61146-18933可用于识别64〔61剪切型55邸和52邸，抗体84〔6119(^^?1433可用于识别 BACE1剪切型55邸和49邸； 6八〔61剪切型55脚可同时被抗体84〔61146-18933和抗体84〔6119(^^?1433识别；84〔61剪切型 52邸只可被抗体84〔61146-18933识别；BACE1剪切型49邸只可被抗体84〔6119(^_21433识别；BACE1 剪切型47邸既不能被抗体84〔61146-18933识别，又不能被抗体BACEll9(^_214aa识别； 因此运两种抗体可W用于四种剪切型55邸、52邸、49邸和47邸的区分。2. 发明保护用于识别BACE1剪切型55KD、52KD抗体BACEli46-i89aa(insedl)的氨基酸序 列和对应的核巧酸序列； 其特征是利用GST表达体系WBACE1蛋白N端第146至189个氨基酸作为特异序列制备的 GST-BACEll46-189aa 融合蛋白。 146-189氨基酸序列：3. 发明保护用于识别84061剪切型55邸、49邸抗体84〔6119(^^?1433(11136的2)的氨基酸序 列和对应的核巧酸序列； 其特征是利用GST表达体系WBACE1蛋白N端第190至214个氨基酸作为特异序列制备的 GST-BACE1i90-214aa 融合蛋白。 190-214AA氨基酸序列：4. 发明保护运种抗体制备方法； 如权利要求2、3所述的原核表达GST-BACE 1190-214aa和GST-BACE 1146-189aa融合蛋白的多克 隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-BACEll90-214aa和GST- BACEll46-189aa融合蛋白，再经免疫兔获得抗651'-84〔6119日-21433和651'-84〔61146-18933抗血清。5. 发明保护根据权利1、2、3、4所述的两种抗体在阿尔兹海默症等疾病中BACE1剪切的 鉴别、检测、治疗及应用。
【文档编号】C07K16/06GK106084057SQ201610410720
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610410720.4, CN 106084057 A, CN 106084057A, CN 201610410720, CN-A-106084057, CN106084057 A, CN106084057A, CN201610410720, CN201610410720.4
【发明人】李晓萌, 王娅, 沈晓延, 汪小莞, 李晓春, 李江
【申请人】东北师范大学