一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂及其制备方法

一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂及其制备方法，所述制剂中含有重量比为2:2～4:1～2:1～2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌。并且最终制得的制剂(包括复合微生物粉状制剂和复合微生物液体制剂)中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量分别为：6.0×109～9.0×1010CFU/ml、6.0×109～9.0×1010CFU/ml、3.0×108～9.0×109CFU/ml和3.0×107～9.0×109CFU/ml。该复合微生物制剂活菌含量高、水分含量低，稳定性高，能够有效吸收养殖水体中的氨氮和亚硝态氮等有害物质，能够有效的对海水养殖污水进行改良。
【专利说明】
一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，涉及一种微生物制剂，具体涉及石斑鱼养殖污水改 良用复合微生物制剂，还涉及到复合微生物制剂的制备方法，包括粉状制剂和液体制剂的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会经济的发展和市场需求的增加，我国水产养殖行业正处于迅猛发展阶 段。然而，在水产业迅猛发展的同时，水产养殖业导致的养殖品种出现退化和水体污染已日 趋严重，特别是海洋近海域养殖区的高密度养殖、工业废水和生活污水的任意排放，使养殖 水域的自净与调节能力降低，水域环境恶化，赤潮频发，生态平衡和生物多样性遭到破坏。 养殖水域的水质下降不仅对环境造成了严重的污染，而且对生物体有致命的威胁，给我国 渔业经济带来了巨大损失。因此处理水产养殖污水并使其达到排放标准已是当务之急。理 论上讲，许多常规的物理、化学和生化的废水处理方法可以用于养殖废水处理，但是和生活 污水相比，海水水产养殖产生的废水具有两个明显的特点，即潜在污染物的含量低和水量 大，加之海水盐度效应以及养殖废水中污染物的主要成分、结构与常见陆源污水的差异，增 加了海水水产养殖废水的处理难度。
[0003] 石斑鱼肉质鲜美，加工出肉率可高达67%，适温范围（18 - 32°C)广，生长，适盐范 围（1 一40%。）也广，生长快，抗病能力强，现已成为我国南方主要经济养殖鱼种之一。近年 来，倡导的鱼类高产健康养殖系统更是推动了我国石斑鱼养殖的迅猛发展，使得鱼类养殖 总产量节节攀高，产生了巨大的经济效益和社会效益。然而，在石斑鱼生产实践中，仍存在 一些问题。石斑鱼养殖生产过程中产生大量的代谢产物，包括养殖动物的排泄物、残余饲 料、浮游动植物残体等。在我国，石斑鱼的养殖和其他对鱼类品种的养殖一样，基本采用"三 池合一"，即养殖鱼类的摄食、排泄及代谢产物的分解在同一个池里完成。养殖生产中每天 投喂饲料，养殖鱼类每天摄食，每天排泄、代谢产物不断积累，如果不合理的改善水质状况， 自身污染程度便会逐渐加重，引起养殖水体质量下降，水质因子变动，加剧各类病害的发 生。氨氮和亚硝酸氮是水产养殖废水中的主要污染物，也是最难以去除的物质。目前研究较 多的是泡沫分离、过滤等物理处理技术。这些物理处理设施具有造价和运行费用低等优点， 但不能去除溶解性污染物，特别是对氨氮不能有效地去除。近年来，人们借鉴畜禽养殖经 验，尝试在养殖水体中施用微生物制剂增强动物免疫力，抑制病原微生物，减少疾病的发 生，改善养殖生态环境，提高水产品产量和质量，取得了显著效果。
[0004] 早在1981年，就有学者指出抗生素之后的时代将是微生物制剂的时代，微生物制 剂一直是国内外生物学和医学领域研究的重点。目前国内外市场对微生物制剂的需求旺 盛，供不应求。我国是农业大国，水产养殖占有相当大的比重，每年消耗掉大量的微生物制 剂，市场前景非常的广大。目前，国际上先进国家的微生物制剂产品一般都含有5科10属80 余种，而且其产品的活菌数高达1〇 1()个/克。自20世纪80年代以来，我国微生态保健品的研究 和开发迅猛发展，但是无论从研究领域还是应用领域仍然存在许多问题需要解决。就水产 养殖水质改良而言，首先，单一菌种的微生物制剂不能降低氨氮和亚硝酸氮;其次，市面上 所售复合微生物制剂因菌种配伍比例不理想或者是活菌数含量低，导致这些产品不能充分 发挥不同菌种配伍降低氨氮和亚硝酸氮等方面的作用;再次，适用于水产微生物制剂的菌 种缺乏，筛选方法过于简单，适用于海水水产动物养殖的微生物制剂更是少之又少;最后， 水产微生物制剂稳定性差，产品的加工保存技术有待提高等等。

【发明内容】

[0005] 针对目前存在的情况，本发明提供一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂， 能够克服目前市售水产养殖污水单一或复合微生物制剂的缺点和不足。
[0006] 本发明还提供了石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，制得的制剂 活菌含量高、水分含量低，稳定性高。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] -种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，所述制剂中含有重量比为2:2~4:1 ~2:1~2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌。
[0009] 优选地，前述石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂中，所述枯草芽孢杆菌、地衣 芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的重量比为2:2:1:1。
[0010] 或者，优选地，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的重量比 为2:4:2:2。
[0011] 前述石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)分别取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌在各自的培养基上 培养活化，于每管菌中分别加入5ml无菌水，制成的菌悬液分别作为一级种子，之后分别将 培养好的一级种子按质量百分比为5~8 %的接种量转移到含200ml液体种子培养基的 1000ml三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，在温度为28~37°C、振荡速度为250rpm的条件 下振荡培养16~20小时，分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌二级 种子液，备用；
[0013] ⑵以质量比为6~7:2~2.5:1~1.5的麸皮、豆饼粉和花生柏为基础混合料，向基 础混合料中添加占基础混合料质量百分比为5.0 %的葡萄糖、0.5~2 %的Ca⑶3、0.2~1 % 的MnS〇4 · H20和0.3~1%的NaCl得到固体干基;然后向固体干基中再加入1~2倍重量的无 菌水，pH值调为6.5~7.2,搅拌均匀后再将其在120~130°C高温条件下灭菌15~30min，待 冷却至室温，即可作为固体发酵培养基使用；
[0014] (3)分别将上述二级种子液均按质量百分比为5~10%的接种量接种到上述固体 发酵培养基中，充分混匀，在密闭的固体发酵罐中，湿度为28~37%、温度为36~37°C条件 下发酵，发酵时间为30~48小时，得发酵产物；
[0015] (4)在上述发酵产物中加入15~20倍重量的玉米淀粉，充分混匀，温度为50~65°C 条件下真空冷凝干燥8~15小时，得到干燥发酵产物，再粉碎，过40~60目，得到复合微生物 粉状制剂。
[0016] 其中，所述步骤(4)还可以用下述步骤代替：
[0017]以通用培养基作为稀释剂，将发酵产物稀释2~200倍;过滤，保证滤液中活菌含量 在1.0X107~109CFU/ml，再将滤液浓缩，采用转速为lOOOOrpm的离心机离心1~2分钟或者 采用4000~5000rpm的离心机离心10~30分钟，收集离心后的沉淀物，将沉淀物重新悬溶于 通用培养基中，获得浓缩液体，保证活菌含量在1. 〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得复合微生物液 体制剂；
[0018] 所述通用培养基为固体培养基，其配方为:细菌学蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、 磷酸氢二钾4g和琼脂18g，其pH为7.4;
[0019] 或液体培养基，其配方为:羧甲基纤维素钠20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化钠5g和 磷酸二氢钾lg，其pH为7.4。
[0020] 其中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所用的培养基配方均为:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化钠5g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.2±0.2,于121°C高压 灭菌备用。
[0021] 所述反硝化细菌所用的培养基为LB培养基，其配方为:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化钠5g、硝酸钠0.85g和琼脂粉20g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 压灭菌备用。
[0022] 所述乳酸菌所用的培养基为MRS培养基，其配方为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801ml、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 〇.25g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉上加热煮沸保 证其完全溶解，然后加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=6.2 ±0.2，121°C高压灭菌备用。
[0023] 采用涂板的方法确定枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌浓度。将 上述各菌种各取1克放入150ml锥形瓶中，向其中加入100ml无菌水，这可以视为菌种被稀释 了 100倍的菌落母液。将母液置于200r/min的摇床上振荡30min，使菌种混合均勾。把振荡后 的菌种母液移入无菌操作台中，并取其上清液0.5ml于10ml离心管中，而后向其中加入 4.5ml无菌水，将离心管盖上盖，在漩涡仪上振荡10秒，使其混合均匀，此即为母液被稀释10 倍。重复此操作，逐级稀释，一直稀释到1010,取0.1ml各梯度的稀释液于相应菌种的培养基 内，用玻璃刮刀涂抹均匀，每个浓度梯度取3个重复。涂板完成以后将培养基倒置放于30°C 的恒温培养箱中培养24小时。观察培养基中菌落的生长情况，如果24小时后细菌长势不明 显可适当延长培养时间。直到培养基平板上的菌落清晰可见为止。
[0024] 最终制得的制剂(包括复合微生物粉状制剂和复合微生物液体制剂）中枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量分别为:6.0 X 109~9.0 X 101()CFU/ml、 6 · 0 X 109~9 · 0 X 1010CFU/ml、3 · 0 X 108~9 · 0 X 109CFU/ml和3 · 0 X 107~9 · 0 X 109CFU/ml。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] (1)本发明通过采用4种不同的微生物菌种混合使用，并且采用合适的比例，能够 有效的对海水养殖污水进行改良，通过实验证明具有较好的改良效果；
[0027] (2)该海水养殖污水改良用复合微生物制剂活菌含量高、水分含量低，稳定性高， 是一种能够利用并吸收养殖水体中的氨氮和亚硝态氮等有害物质等益生功能的多种益生 菌以及其分泌的酶、氨基酸生物素等有益因子的复合微生物制剂；
[0028] (3)该复合微生物制剂所用原料国内市场均有销售、来源稳定、价格便宜，生产工 艺简单，可操作性强；
[0029] (4)该复合微生物制剂应市场需求，可制成粉状剂型和液体剂型。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更 透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0033] 如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"或"包括"为一开放式用语，故应 解释成"包含但不限定于"。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃 以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权 利要求所界定者为准。
[0034] 实施例1
[0035] -种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，所述制剂中含有重量比为2: 2:1:1 的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌。
[0036] 石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0037] (1)分别取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌在各自的培养基上 培养活化，于每管菌中分别加入5ml无菌水，制成的菌悬液分别作为一级种子，之后分别将 培养好的一级种子按质量百分比为5 %的接种量转移到含200ml液体种子培养基的1000ml 三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，在温度为28°C、振荡速度为250rpm的条件下振荡培养 20小时，分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌二级种子液，备用；
[0038] 其中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所用的培养基配方均为:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化钠 5g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.2±0.2,于121°C高压 灭菌备用。
[0039]所述反硝化细菌所用的培养基为LB培养基，其配方为:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化钠5g、硝酸钠0.85g和琼脂粉20g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 压灭菌备用。
[0040]所述乳酸菌所用的培养基为MRS培养基，其配方为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801ml、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 〇.25g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉上加热煮沸保 证其完全溶解，然后加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=6.2 ±0.2，121°C高压灭菌备用； [0041 ] (2)以质量比为6: 2 :1的麸皮、豆饼粉和花生柏为基础混合料，向基础混合料中添 加占基础混合料质量百分比为5.0 %的葡萄糖、0.5 %的CaC03、1 %的MnS〇4 · H20和1 %的 NaCl得到固体干基;然后向固体干基中再加入1倍重量的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀后 再将其在120°C高温条件下灭菌30min，待冷却至室温，即可作为固体发酵培养基使用；
[0042] (3)分别将上述二级种子液均按质量百分比为10%的接种量接种到上述固体发酵 培养基中，充分混匀，在密闭的固体发酵罐中，湿度为28%、温度为37°C条件下发酵，发酵时 间为30小时，得发酵产物；
[0043] (4)在上述发酵产物中加入15倍重量的玉米淀粉，充分混匀，温度为50°C条件下真 空冷凝干燥8小时，得到干燥发酵产物，再粉碎，过40目，得到复合微生物粉状制剂。
[0044] 最终制得的制剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量 分别为:6 · 0 X 109CFU/ml、2 · 0 X 101QCFU/ml、3 · 0 X 108CFU/ml和9 · 0 X 109CFU/ml。
[0045] 实施例2
[0046] -种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，所述制剂中含有重量比为2 :3 :1: 2 的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌。
[0047] 上述石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0048] (2)分别取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌在各自的培养基上 培养活化，于每管菌中分别加入5ml无菌水，制成的菌悬液分别作为一级种子，之后分别将 培养好的一级种子按质量百分比为8 %的接种量转移到含200ml液体种子培养基的1000ml 三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，在温度为37°C、振荡速度为250rpm的条件下振荡培养 16小时，分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌二级种子液，备用；
[0049] 其中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所用的培养基配方均为:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化钠5g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.2±0.2,于121°C高压 灭菌备用。
[0050] 所述反硝化细菌所用的培养基为LB培养基，其配方为:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化钠5g、硝酸钠0.85g和琼脂粉20g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 压灭菌备用。
[0051] 所述乳酸菌所用的培养基为MRS培养基，其配方为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801ml、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 〇.25g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉上加热煮沸保 证其完全溶解，然后加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=6.2 ±0.2，121°C高压灭菌备用； [0052] (2)以质量比为7 : 2.5:1.5的麸皮、豆饼粉和花生柏为基础混合料，向基础混合料 中添加占基础混合料质量百分比为5.0%的葡萄糖2 %的CaC03、0.2%的MnS〇4 · H20和0.3% 的NaCl得到固体干基;然后向固体干基中再加入2倍重量的无菌水，pH值调为7.2，搅拌均匀 后再将其在130°C高温条件下灭菌15min，待冷却至室温，即可作为固体发酵培养基使用； [0053] (3)分别将上述二级种子液均按质量百分比为10%的接种量接种到上述固体发酵 培养基中，充分混匀，在密闭的固体发酵罐中，湿度为37%、温度为36°C条件下发酵，发酵时 间为48小时，得发酵产物；
[0054] (4)在上述发酵产物中加入20倍重量的玉米淀粉，充分混匀，温度为65°C条件下真 空冷凝干燥8小时，得到干燥发酵产物，再粉碎，过60目，得到复合微生物粉状制剂。
[0055] 最终制得的制剂(包括复合微生物粉状制剂和复合微生物液体制剂）中枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量分别为：5.0 X 101()CFU/ml、5.0 X 101()CFU/ml、1 · 0 X 109CFU/ml 和3 · 0 X 107CFU/ml。
[0056] 实施例3
[0057] 一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 反硝化细菌和乳酸菌的重量比为2:4:2:2。
[0058]上述石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0059] (3)分别取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌在各自的培养基上 培养活化，于每管菌中分别加入5ml无菌水，制成的菌悬液分别作为一级种子，之后分别将 培养好的一级种子按质量百分比为6 %的接种量转移到含200ml液体种子培养基的1000ml 三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，在温度为30°C、振荡速度为250rpm的条件下振荡培养 18小时，分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌二级种子液，备用；
[0060] 其中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所用的培养基配方均为:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化钠5g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.2±0.2,于121°C高压 灭菌备用。
[0061] 所述反硝化细菌所用的培养基为LB培养基，其配方为:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化钠5g、硝酸钠0.85g和琼脂粉20g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 压灭菌备用。
[0062] 所述乳酸菌所用的培养基为MRS培养基，其配方为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801ml、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 〇.25g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉上加热煮沸保 证其完全溶解，然后加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=6.2 ±0.2，121°C高压灭菌备用；
[0063] (2)以质量比为7 : 2.2:1.2的麸皮、豆饼粉和花生柏为基础混合料，向基础混合料 中添加占基础混合料质量百分比为5.0%的葡萄糖、1%的Ca⑶ 3、0.5%的MnS〇4 · H20和 0.5 %的NaCl得到固体干基;然后向固体干基中再加入1.5倍重量的无菌水，pH值调为7，搅 拌均匀后再将其在125°C高温条件下灭菌20min，待冷却至室温，即可作为固体发酵培养基 使用；
[0064] (3)分别将上述二级种子液均按质量百分比为8%的接种量接种到上述固体发酵 培养基中，充分混匀，在密闭的固体发酵罐中，湿度为30%、温度为36°C条件下发酵，发酵时 间为36小时，得发酵产物；
[0065] (4)以通用培养基（固体培养基，其配方为:细菌学蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、 磷酸氢二钾4g和琼脂18g，其pH为7.4;)作为稀释剂，将发酵产物稀释100倍;过滤，保证滤液 中活菌含量在1.0X107~l〇9CFU/ml，再将滤液浓缩，采用转速为lOOOOrpm的离心机离心2分 钟或者采用5000rpm的离心机离心10分钟，收集离心后的沉淀物，将沉淀物重新悬溶于通用 培养基中，获得浓缩液体，保证活菌含量在1 .〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得复合微生物液体制 剂。
[0066] 最终制得的制剂(包括复合微生物粉状制剂和复合微生物液体制剂）中枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量分别为：4.0 X 101()CFU/ml、9.0 X 1010CFU/ml、9 · 0 X 109CFU/ml和5 · 0 X 108CFU/ml。
[0067] 实施例4
[0068] -种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，所述制剂中含有重量比为2:4:1:2 的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌。
[0069] 上述石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0070] (4)分别取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌在各自的培养基上 培养活化，于每管菌中分别加入5ml无菌水，制成的菌悬液分别作为一级种子，之后分别将 培养好的一级种子按质量百分比为7 %的接种量转移到含200ml液体种子培养基的1000ml 三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，在温度为35°C、振荡速度为250rpm的条件下振荡培养 18小时，分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌二级种子液，备用；
[0071] 其中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所用的培养基配方均为:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化钠5g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.2±0.2,于121°C高压 灭菌备用。
[0072]所述反硝化细菌所用的培养基为LB培养基，其配方为:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化钠5g、硝酸钠0.85g和琼脂粉20g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉 上加热煮沸保证其完全溶解，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 压灭菌备用。
[0073]所述乳酸菌所用的培养基为MRS培养基，其配方为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠 5g、葡萄糖20g、吐温801ml、柠檬酸二铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 〇.25g和琼脂粉15g。将上述各试剂准确称量后溶于适量的蒸馏水中，在电炉上加热煮沸保 证其完全溶解，然后加蒸馏水定容至l〇〇〇ml，调整其PH=6.2 ±0.2，121°C高压灭菌备用； [0074] (2)以质量比为6: 2.5:1的麸皮、豆饼粉和花生柏为基础混合料，向基础混合料中 添加占基础混合料质量百分比为5.0 %的葡萄糖、1.5 %的Ca⑶3、0.8 %的MnS〇4 · H20和 0.8 %的NaCl得到固体干基;然后向固体干基中再加入2倍重量的无菌水，pH值调为6.8，搅 拌均匀后再将其在130°C高温条件下灭菌25min，待冷却至室温，即可作为固体发酵培养基 使用；
[0075] (3)分别将上述二级种子液均按质量百分比为8%的接种量接种到上述固体发酵 培养基中，充分混匀，在密闭的固体发酵罐中，湿度为35%、温度为37°C条件下发酵，发酵时 间为42小时，得发酵产物；
[0076] (4)以通用培养基(液体培养基，其配方为:羧甲基纤维素钠20g、蛋白胨5g、酵母膏 5g、氯化钠5g和磷酸二氢钾lg，其pH为7.4)作为稀释剂，将发酵产物稀释200倍;过滤，保证 滤液中活菌含量在1.0X107~l〇9CFU/ml，再将滤液浓缩，采用转速为lOOOOrpm的离心机离 心1分钟或者采用4000rpm的离心机离心30分钟，收集离心后的沉淀物，将沉淀物重新悬溶 于通用培养基中，获得浓缩液体，保证活菌含量在1. 〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得复合微生物 液体制剂。
[0077]最终制得的制剂(包括复合微生物粉状制剂和复合微生物液体制剂）中枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量分别为：9.0X109CFU/ml、7.0X 1010CFU/ml、4 · 0 X 109CFU/ml和6 · 0 X 108CFU/ml。
[0078] 为了证明本发明的有效性，
【申请人】还进行了如下试验：
[0079] 实验一:复合微生物制剂(复合微生物粉状制剂或复合微生物液体制剂)对模拟石 斑鱼养殖污水的影响和作用
[0080] 1.试验器材：
[0081] ⑴仪器
[0082] 恒温培养箱、培养皿、漩涡仪、无菌操作台、摇床、锥形瓶、分光光度计和配套比色 皿、25ml具塞比色管、容量瓶、移液枪等。
[0083] (2)试剂
[0084]磺胺、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、硫酸铵、柠檬酸钠、氢氧化钠、苯酚溶液、亚硝铁铁 氰化钠、次氯酸钠溶液以及配制培养基所需要的各种试剂等。
[0085] 2.试验水体:室内石斑鱼高位池养殖模拟水的配制
[0086] 称取0.2463g亚硝酸钠(于110°C烘干)和0.4716g硫酸铵（于110°C烘干)溶解于少 量纯水后定容至l〇〇〇ml，得到亚硝酸盐浓度分别为50mg/L和氨氮浓度为100mg/L的储备液。 实验所用到的溶液需要在此基础上稀释50倍，得到亚硝酸盐氮和氨氮浓度如表1的水样。
[0087] 表1实验前模拟水样中各物质含量
[0088]
[0090] 3.试验方法:表2表不的各种菌种的添加量(正交因素-水平表，表中分别代表的是 四种菌种添加量g，将四种菌添加到150ml水里震荡，接着再加入到实验组里，每组模拟水的 量为5L)和表3(L9(34)正交表，表中各数据表示的各种菌种之间的比例），设1个空白对照组 (不添加菌种），共10组，每组3个平行，每天上午10点进行氨氮和亚硝酸盐的测定并记录，连 续记录6天。其中，表2中的水平1、2、3分别对应表3的编号1-3、4-6、7-9。比如编号为1的枯草 芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌、乳酸菌的比例为1:1:1:1，则对应的重量分别为2g、 28、以、18，再比如编号为2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌、乳酸菌的比例为1: 2:2:2，则对应的重量分别为2g、4g、2g、2g。
[0091] 表2正交实验的因素-水平表
[0092]
[0093] 表3 L9(34)正交实验设计
[0094]
[0095] 4 ·试验结果
[0096] 复合微生物制剂(复合微生物粉状制剂或复合微生物液体制剂)对室内模拟养殖 污水的氨氮含量变化如表4所示，亚硝酸盐氮含量变化如表5所示。加入复合微生物制剂前， 模拟水中的氨氮含量为2.40mg/L，亚硝酸盐氮含量为1.04mg/L。
[0097] 从表4和表5中可以看出，加菌处理的水样中，其氨氮和亚硝酸盐氮的含量都有明 显的降低。就氨氮而言，第1组的降氨氮效果最为明显，在加入复合微生物制剂48小时以后， 氨氮含量下降的峰值达到了 97.5%。第3组微生物制剂对水体中的氨氮降解率次之，在加入 微生物制剂84小时后，水体中的氨氮降解了74.2%。对氨氮降解效果最不明显的是第九组 微生物制剂，在加入微生物制剂84小时后，水体中氨氮的降解率只有21 %。在向模拟水中加 入微生物制剂以后，其亚硝酸盐氮的含量一直在下降，在第6次进行水样亚硝酸盐氮含量测 定时，亚硝酸盐氮的含量降低了 93.3%。
[0098] 由此可得出，所有四个菌种(枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌） 配伍所得的复合微生物制剂对水体中的亚硝酸盐氮都具有明显的降解效果，不同配伍比例 的微生物制剂对亚硝酸盐氮的降解效果没有明显差异。
[0099] 综上所述，第1组微生物制剂（即枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸 菌按重量比2:2:1:1配伍形成)对水体中氨氮和亚硝酸盐氮的影响效果最为明显。可将其看 作是在模拟水实验条件下，得到的配伍最优的一组复合微生物制剂。
[0100] 表4模拟水样氨氮含量(mg/L)的变化
[0101]
[0102] 表5模拟水样亚硝酸盐氮含量(mg/L)变化
[0103]
[0104]
[0105] 实验二:复合微生物制剂(复合微生物粉状制剂或复合微生物液体制剂)对室外石 斑鱼高位池养殖污水的影响和作用
[0106] 1.试验水体:养殖水水样采自三亚市榆红村某石斑鱼养殖场，其盐度在35%〇左右。 采样的容器是25L的白色塑料桶，采样点为同一个虾塘的四个不同位置，共采集水样75L。采 回水样后12小时测定水体中氨氮和亚硝酸盐氮的含量，其中亚硝酸盐氮和氨氮含量含量分 别为0.13mg/L和3.12mg/L，然后分装到2000ml的烧杯中进行实验。实验共分为10组，其中1 -9组是实验组，第10组为空白对照组，对比相同的条件下进行，相同的时间间隔测定其水体 中的氨氮和亚硝酸盐氮含量的变化。
[0107] 2.试验方法:同实验一，复合微生物制剂添加量与实验1相同。
[0108] 3.试验结果
[0109] 复合微生物制剂对南美白对虾高位池养殖污水的氨氮含量变化如表6所示，亚硝 酸盐氮含量变化如表7所示。加入复合微生物制剂前水体中的氨氮含量为3.12mg/L，亚硝酸 盐氮的含量为〇.133mg/L。
[0110] 表6养殖污水中氨氮含量(mg/L)变化
[0111]
[0112] 表7养殖污水中亚硝酸盐氮含量(mg/L)变化
[0113]
[0115] *注：表示水样在比色时已经不显色
[0116] 从表6中可以看出，养殖水样的氨氮含量一直呈降低趋势。第2组实验在加入复合 微生物制剂的84小时后，水体中氨氮的降解率达到了 93.2%，是9个实验组中氨氮降解率最 高的一组。其他实验组中，只有第6组的氨氮降解率稍微低了一点，但是在加入微生物制剂 84小时后，其氨氮降解率依然高达84.0%。可见复合微生物制剂对实际养殖污水中的氨氮 降解效果比较明显，在加入微生物制剂前后，氨氮含量降低了 84.0%~93.2%。
[0117]表7表示的是养殖污水中加入复合微生物制剂前后，其亚硝酸盐氮含量的变化，从 表中可以看出，在加入微生物制剂24小时后，第1次水质测定时，其水体中的亚硝酸盐氮含 量已经极低。之后的几次水质测定实验中，在向待测液中加入磺胺和盐酸萘乙二酸钠后，待 测液已经不再显色，可近似看作水体中已经没有亚硝酸盐氮的存在或其含量极微，可忽略 不计。
[0118]综上所述，第2组微生物制剂(枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌 按照其重量比2:4:2:2进行配伍)对水体中氨氮的影响最为明显，在加入微生物制剂84小时 后，其氨氮含量下降了 93.2%。
[0119]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，其特征在于，所述制剂中含有重量比 为2:2~4:1~2:1~2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌。2. 根据权利要求1所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，其特征在于，所述枯 草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的重量比为2:2:1:1。3. 根据权利要求1所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂，其特征在于，所述枯 草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的重量比为2:4:2:2。4. 根据根据权利要求1~3任一项所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制 备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： (1) 分别取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌在各自的培养基上培养 活化，于每管菌中分别加入5ml无菌水，制成的菌悬液分别作为一级种子，之后分别将培养 好的一级种子按质量百分比为5~8 %的接种量转移到含200ml液体种子培养基的1000ml三 角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，在温度为28~37°C、振荡速度为250rpm的条件下振荡培 养16~20小时，分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌二级种子液， 备用； (2) 以质量比为6~7:2~2.5:1~1.5的麸皮、豆饼粉和花生柏为基础混合料，向基础混 合料中添加占基础混合料质量百分比为5.0 %的葡萄糖、0.5~2 %的Ca⑶3、0.2~1 %的 MnS〇4 · H20和0.3~1%的NaCl得到固体干基;然后向固体干基中再加入1~2倍重量的无菌 水，pH值调为6.5~7.2,搅拌均匀后再将其在120~130°C高温条件下灭菌15~30min，待冷 却至室温，即可作为固体发酵培养基使用； (3) 分别将上述二级种子液均按质量百分比为5~10%的接种量接种到上述固体发酵 培养基中，充分混匀，在密闭的固体发酵罐中，湿度为28~37%、温度为36~37°C条件下发 酵，发酵时间为30~48小时，得发酵产物； (4) 在上述发酵产物中加入15~20倍重量的玉米淀粉，充分混匀，温度为50~65°C条件 下真空冷凝干燥8~15小时，得到干燥发酵产物，再粉碎，过40~60目，得到复合微生物粉状 制剂。5. 根据权利要求4所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，其特征 在于，所述步骤(4)还可以用下述步骤代替： 以通用培养基作为稀释剂，将发酵产物稀释2~200倍;过滤，保证滤液中活菌含量在 1.0X107~109CFU/ml，再将滤液浓缩，采用转速为lOOOOrpm的离心机离心1~2分钟或者采 用4000~5000rpm的离心机离心10~30分钟，收集离心后的沉淀物，将沉淀物重新悬溶于通 用培养基中，获得浓缩液体，保证活菌含量在1 .〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得复合微生物液体 制剂； 所述通用培养基为固体培养基，其配方为:细菌学蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、磷酸 氢二钾4g和琼脂18g，其pH为7.4; 或液体培养基，其配方为:羧甲基纤维素钠20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化钠5g和磷酸 二氢钾lg，其pH为7.4。6. 根据权利要求4所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，其特征 在于，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌所用的培养基配方均为:胰蛋白胨l〇g、酵母粉5g、氯化 钠5g和琼脂粉15g。7. 根据权利要求4所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，其特征 在于，反硝化细菌所用的培养基为LB培养基，其配方为:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、 硝酸钠〇.85g和琼脂粉20g。8. 根据权利要求4所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，其特征 在于，乳酸菌所用的培养基为MRS培养基，其配方为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、磷酸 氢二钾2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温8011111、柠檬酸二铵2 8、硫酸镁0.588、硫酸锰0.258和 琼脂粉15g。9. 根据权利要求4或5所述的石斑鱼养殖污水改良用复合微生物制剂的制备方法，其特 征在于，所述制剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化细菌和乳酸菌的活菌量分别为： 6 · 0 X 109~9 · 0 X 1010CFU/ml、6 · 0 X 109~9 · 0 X 1010CFU/ml、3 · 0 X 108~9 · 0 X 109CFU/ml和 3.0X107~9.0X109CFU/ml 〇
【文档编号】C12R1/125GK106085906SQ201610424849
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】陈燕, 李成才, 黄海, 马军, 钟鸿干, 林炽贤, 陈忠萌, 杜前进, 叶风, 陈铭粤, 张杰超, 钟教豪, 张作坚, 王小美, 吴子莹
【申请人】陈燕