一种空间甲基杆菌lct?s10?2的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株“神舟九号”飞船返回舱中分离得到下行菌株空间甲基杆菌LCT?S10?2，为好氧细菌，短杆状的革兰氏染色可变菌种（图1），化能异养菌，兼性甲基营养菌和罕有兼性甲烷营养菌，菌株生长缓慢。对该菌进行16S rRNA测序，鉴定其为甲基杆菌属成员。进行了全基因组测序分析，其基因组大小为4.57Mbp，GC含量为66.84%，预测基因数4946个，LCT?S10?2的蛋白被分类注释为20类COG家族。LCT?S10?2菌在环氧树脂、硫化天然橡胶表面能生长，有腐蚀生物膜生成；在酯类聚氨酯、醚类聚氨酯、聚乙烯醇缩甲醛表面不能生长，无腐蚀生物膜生成。对研究密闭飞行器内微生物种类分布、耐腐蚀材料的选择等提供了一定帮助。CGMCC 1257620160601
【专利说明】
一种空间甲基杆菌LCT-S10-2
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域;更具体地，本发明涉及空间甲基杆菌LCT-S10-2及其生 物学特性、全基因组学测序。
【背景技术】
[0002] 随着航天技术的发展，人类的外太空探索活动越来越频繁。在地面上微生物几乎 无处不在，大多数存在于人类皮肤、口腔、鼻咽部和胃肠道。尽管载人飞船及内部物品等经 过严格的真空消毒，载人航天器密闭环境条件下仍然容易滋生细菌和真菌等微生物，这些 微生物能在密闭舱室内的金属、高分子复合材料等表面形成生物膜，它们的生长繁殖和代 谢会对材料产生腐蚀，严重威胁空间站的长期在轨运行安全，缩短空间站的服役时间。研究 密闭航天器内的微生物种类对于航天器内微生物的安全防护具有重要的意义。
[0003] 早期人们对许多环境微生物的认识仅来自于对16S rRNA的研究，一些重要的遗传 信息很难获得。现在越来越多的新的培养和分子生物学方法，例如基因组学、蛋白质组学、 宏基因组学等，被用来研究新获得微生物的潜在特征和功能等。
[0004] 随着人类基因组计划的实施和进行，生物体基因组研究已经成为生命科学研究的 前沿领域，而与之相对应的微生物基因组研究正在广泛开展。细菌是微生物的一种，其基因 组小、操作简单且实验周期短，其研究的工作可为人类基因组研究提供有益的参考；同时随 着测序技术的更新换代和高通量测序技术的出现，细菌基因组的测序成本和所需时间已大 幅度降低。初步研究了该菌的表型及生理生化特征，对研究密闭飞行器内微生物种类分布、 材料的微生物腐蚀等提供了帮助。
【发明内容】
[0005] 本发明的菌株LCT-S10-2为"神舟九号"飞船的返回舱内冷凝水分离得到。
[0006] 本发明提供的该菌株，其保藏号为CGMCC No. 12576。
[0007] 菌株LCT-S10-2为好氧细菌，短杆状的革兰氏染色可变菌种（图1)，化能异养菌，兼 性甲基营养菌和罕有兼性甲烷营养菌，菌株生长缓慢。菌体呈杆状，表面没有鞭毛、菌毛等 结构。LCT-S10-2菌在环氧树脂、硫化、硫化天然橡胶表面能生长，有腐蚀生物膜生成;在酯 类聚氨酯、醚类聚氨酯、聚乙烯醇缩甲醛表面不能生长，无腐蚀生物膜生成。
[0008] 所述的菌株LCT-S10-2菌株，进行全基因组测序，并进行分析，其基因组大小为 4.57Mbp，GC含量为66.84%，预测基因数4946个(表1)，310-2的蛋白被分类注释为20类〇?家 族(图2)。
[0009] 表1 Methylobacterium sp. LCT-S10-2菌株核苷酸含量和基因水平的基因组
说明：Gene Number预测结果的基因个数;Gene Length (bp)预测得到的基因总长 度；GC Content in Gene Region (%)预测基因的GC含量；Gene Length / Genome (%):基 因占组装序列的比例;Gene Average Length (bp):预测基因的平均长度。
【附图说明】
[0010] 图1 LCT-S10-2的革兰氏染色结果。
[0011] 图2 LCT-S10-2基因组20个C0G分类的基因数统计。
[0012] 图3环氧树脂为唯一碳源培养条件下LCT-S10-2的增长曲线。
[0013] 图4 LCT-S10-2对环氧树脂腐蚀的SEM观察。
[0014] 图5酯类聚氨酯为唯一碳源培养下LCT-S10-2的增长曲线。
[0015] 图6 LCT-S10-2对酯类聚氨酯腐蚀的SEM观察。
[0016] 图7醚类聚氨酯为唯一碳源培养下LCT-S10-2的增长曲线。
[0017] 图8 LCT-S10-2对醚类聚氨酯腐蚀的SEM观察。
[0018] 图9硫化天然橡胶为唯一碳源培养下LCT-S10-2的增长曲线。
[0019] 图10 LCT-S10-2对硫化天然橡胶腐蚀的SEM观察。
[0020]图11聚乙烯醇缩甲醛为唯一碳源培养下LCT-S10-2的增长曲线。
[0021] 图12 LCT-S10-2对聚乙烯醇缩甲醛腐蚀SEM观察。
【具体实施方式】
[0022] 下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024] 实施实例一:菌株LCT-S10-2培养。
[0025]菌株LCT-S10-2为"神舟九号"飞船的返回舱内冷凝水分离得到。菌株分别于 37°C培养箱或摇床中进行静置或振荡培养，液体培养基为脑心浸出液培养基 (BHI，0xi〇d)，配方为37 g/L BHI;固体培养基为MH平板。
[0026] 实施实例二:菌株LCT-S10-2菌种鉴定。
[0027] 菌株LCT-S10-2接种至BHI液体培养基，37°C，180 rpm过夜培养，6000 rpm离 心5 min收集菌体，弃上清。利用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒（Code No . 51304，详细步骤见产品说明书）提取收集的菌体的基因组DNA。以LCT-S10-2的基因组 DNA为模板，利用细菌16s rRNA通用测序引物27F(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R (5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增其 16s rRNA片段并测序，得到其碱 基序列。
[0028] 实施实例三:菌株LCT-S10-2的革兰氏染色。
[0029] 采用革兰氏染色试剂盒(Code No. G1060，Solarbio)对LCT-S10-2菌体进行染 色。
[0030] BHI液体培养基过夜培养菌体，将菌液滴于载玻片中央，在酒精灯上略加温，使之 迅速干燥。结晶紫、沙黄染色液对干燥菌体一次染色脱色，详细步骤见产品说明书。染色完 成并晾干后，置于光学显微镜下观察染色情况。
[0031]实施实例四：菌株LCT-S10-2的电子显微镜观察。
[0032] 分别在透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜（SEM)下观察菌体形态。1ml培养 至稳定前期的菌液，6000 rpm离心5 min收集菌体，弃上清;PBS缓冲液洗涤一次后将菌体悬 浮至合适浓度。菌悬液等体积与4%多聚甲醛+0.5%戊二醛溶液混合，滴在有支持膜的铜网 上，15 min后用滤纸吸取未吸附样品；吸取磷钨酸染液小心滴在铜网上，染色1 min后用滤 纸吸取未吸附的样品；样品干燥后在Philips EM 400T型透射电子显微镜(TEM)下观察菌体 形态。首先用2.5%戊二醛、PBS缓冲液以及1%锇酸清洗菌体，乙醇梯度脱水并乙酸异戊酯置 换，样品干燥后做喷金处理(4)，处理好的样品置于FEI Quanta 200型扫描电镜下观察。 [0033]实施实例五:菌株LCT-S10-2对5种高分子材料腐蚀实验观察。
[0034]对照组：向100 mL无菌三角烧瓶中倒入40 mL无机盐基础培养基，每个培养瓶中加 入10个试样，透气膜封口，放入32°C，相对湿度为75%的恒温培养箱中。每株菌和每个材料准 备3个平行样品。设置4个时间点：1、3、6、10周取样。
[0035]实验组：向100 mL无菌三角烧瓶中倒入40 mL无机盐基础培养基，每个培养瓶中加 入10个试样，接种5 mL菌悬液，透气膜封口，放入32°C，相对湿度为75%的恒温培养箱中。每 株菌和每个材料准备3个平行样品。设置4个时间点：1、3、6、10周取样。
[0036]在各个时间点测定培养液600 nm波长下的吸光度，判断细菌利用高分子材料作为 唯一碳源的生长情况。
[0037]表面微生物膜和腐蚀形态SEM观察：在各个时间点，分别从对照组和实验组的3个 平行样中分别取出一块试样，在无菌操作台中进行。生物膜固定:将样品置于培养皿，沿壁 缓加固定液(0.1 M，pH 7.0的磷酸盐缓冲的2.5%戊二醛），将样品淹没至少5 mm，固定4 h。 脱水:从固定液中取出样品，蒸馏水清洗样品膜3次，每次15 min。依次用30%、50%、70%、85% 和95%的乙醇溶液脱水，每级15~20 min，用100%的乙醇溶液脱水2次，每次15~20 min。 干燥:将试样放入培养皿中，倒入5 mL六甲基二娃胺烧浸没3min，通风处干燥。喷金:样品做 SEM观察时，样品必须有良好的导电性，对于不导电样品，要设法使其具有导电性。完成这个 过程就要在样品表面喷镀一层导电层。对朝上面喷金处理。然后利用SEM观察。
[0038]实施实例六:菌株LCT-S10-2的基因组测序、组装及注释。
[0039] 基因组DNA样品委托安诺优达有限公司进行全基因组序列测定、基因预测、基因功 能注释、非编码RNA预测等工作，序列分析工作委托安诺优达有限公司完成。
[0040] 基因组DNA提取后进行质量鉴定，在浓度和纯度达到测序要求后进行全基因组测 序。利用Covaris进行基因组DNA片段化，构建插入片段约300-500 bp的基因组测序文库， 通过桥式PCR扩增得至ijDNA簇，然后采用Illumina Hiseq2000测序技术完成该菌株的基因组 扫描测序，获得约1 Gb的原始测序数据。Illumina HiSeq2000测序得到的原始图像数据 经过Base Calling转化为序列数据，结果以FASTQ文件格式来存储，包含测序read的序 列信息以及测序质量信息；原始数据经过预处理去除接头、引物及低质量数据后，利用 SOAPdenovo (http: //soap · genomics · org · cn/)拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数 的拼接，得到最优的组装结果，并运用GapCloser软件对组装结果进行局部内洞填充和碱 基校正；分别利用RNAmmer和tRNAscan-SE软件对基因组中包含的rRNA和tRNA进行预 测；利用Glimmer 3 · 0(http: //www. cbcb · umd · edu/sof tware/glimmer/)软件进行基因预 测;利用各种数据库进行基因功能注释和分类。
[0041] 关于保藏的LCT-S10-2菌株的说明 A. 菌种的保藏单位名称和地址 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 B. 交机构保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏机构给予的保藏号 CGMCC No.12576 D. 分类命名 甲基杆菌 Methylobacterium sp.〇
【主权项】
1. 一种"神舟九号"飞船返回舱中分离得到下行菌株空间甲基杆菌LCT-S10-2,其保藏 号为 CGMCC 12576。2. 根据权利要求1所述的一种"神舟九号"飞船返回舱中分离得到下行菌株空间甲基杆 菌LCT-S10-2，为好氧细菌，短杆状的革兰氏染色可变菌种，化能异养菌，兼性甲基营养菌和 罕有兼性甲烷营养菌，菌株生长缓慢;对该菌进行16S rRNA测序，鉴定其为甲基杆菌属成 员。3. 根据权利要求1所述的一种"神舟九号"飞船返回舱中分离得到下行菌株空间甲基杆 菌LCT-S10-2,进行全基因组测序并进行分析。4. 根据权利要求1所述的一种"神舟九号"飞船返回舱中分离得到下行菌株空间甲基杆 菌LCT-S10-2,进行高分子材料腐蚀特性试验并分析。
【文档编号】C12R1/01GK106085910SQ201610455941
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】刘长庭, 徐绸, 张学林, 周宏 , 方向群, 姜学革, 刘岩, 潘磊, 黄兵, 李佳, 余昳
【申请人】中国人民解放军总医院