一株重组大肠杆菌及其在制备具有人血型b抗原活性的n?糖蛋白中的应用
【专利摘要】本发明公开了一株重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CEBO86，是将构建的重组质粒pACT3?PglB和pBAD24?malEM共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中获得，该重组大肠杆菌的基因型为CLM24/p?pglB+p?malEM，有能同时表达PglB和malEM基因的功能。利用本发明所述重组大肠杆菌能够发酵制备具有人血型B抗原活性的N?糖蛋白，且生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可实现N?糖蛋白的大规模生产；制备获得的N?糖蛋白具有良好的B抗原活性，可高效吸附人血浆中的抗B抗体，为通用血产品的制备提供新的选择方案，同时，可用于血型不兼容的器官移植，具有良好的工业开发和应用前景。
【专利说明】
一株重组大肠杆菌及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖 蛋白中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一株重组大肠杆菌及其应用，尤其涉及一株重组大肠杆菌CEB086及其 在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用；属于生物技术、基因工程和微生物发酵 领域。
【背景技术】
[0002] ΑΒ0血型系统是人类血型系统中最重要的一类。根据红细胞所含的特殊的抗原不 同，该系统分为A、B、AB和0四种血型。该血型系统是由A、B两种抗原决定，它们是一种多糖抗 原，在血小板以及内皮细胞上有分布。血型不相容是因为人体内产生有相应的抗体来对抗A 或B抗原。这些抗体就像血凝素，它们能够引起血细胞凝集而消融，在大量输血或者进行器 官移植过程甚至会造成死亡。移除血浆里的抗A或B抗体可克服因为不同血型之间进行的器 官移植而引起的超敏排斥，因此，适时移除血浆里的抗A或B抗体是一种有效并切实可行的 抗凝集和排异方法。目前，已有多种方法可去除血浆中抗A或抗B抗体，其主要根据这些抗体 与相应抗原的特异性结合，利用免疫吸附的方式除去相应的抗体或者是抗体生成细胞，可 用于ΑΒ0血型不合型的器官移植。常用的免疫吸附是将A或B血型抗原通过配糖类物质连接 到琼脂糖基质上。值得一提的是，A或B血型抗原不仅仅很难获取，而且很难固定化，使得整 个方法造价相当昂贵以致不能在资源匮乏、收入低下的国家得到很好地应用。因此亟需找 到一种费用低、效率高的具有人血型抗原活性的糖抗原的生产方法。
[0003] 目前，A、B血型抗原多数都是通过化学方法和生物酶法合成。其血型抗原糖链的化 学合成不仅需要复杂的保护和去保护的操作，步骤繁杂，立体专一性不易控制，而且产率 低。同时酶法合成中所用的相关糖基转移酶较难大批量获取，并且，酶促反应中活化的糖供 体价格昂贵，这为血型糖抗原的酶法合成增加了困难。经检索，利用重组大肠杆菌制备具有 人血型B抗原活性的N-糖蛋白（大肠杆菌086: H7N-糖蛋白）以及利用N-糖蛋白在去除血浆B 抗体中的应用的文献还未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其在制备 具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。
[0005] 研究证明，大肠杆菌086:B7的0抗原与人B血型抗原结构相似，具有人B血型抗原活 性（图1)。本发明的技术方案基于空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途 径相似的特点，采用在大肠杆菌086 :H7中过量表达来源于大肠杆菌中的malE基因（来源NEB 公司的质粒pMAL_p5X)突变体和来源于空肠弯曲菌的pglB基因 （PglB NCBI-GenelD : 905417)，构建获得基因型为086 Δ waal/p-malEM+p-PglB的重组大肠杆菌，并且在改良LB培 养基中发酵生产具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白。
[0006] 本发明所述的重组大肠杆菌菌株命名为重组大肠杆菌CEB086,其特征在于:所述 重组大肠杆菌由如下方法制得：
[0007] 构建含有PglB基因的pACT3-PglB的重组质粒和含有malEM基因的pBAD24-malE%9 重组质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3-PglB和pBAD24-malE M共转化已缺失waal基因 的大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malEM基因的重组大肠杆菌，其基因型为 CLM24/p-pglB+p_malEM，该菌株即为重组大肠杆菌CEB086;
[0008] 其中，所述malEMS因来源于质粒PMAL-P5X，所述PglB基因来源于空肠弯曲杆菌 NCTC 11168；
[0009] 上述malEM基因为malE基因突变体，是通过在malE基因的3'末端插入一段核苷酸 序列如SEQ ID No. 1所示的表达糖基化序列的基因所得；
[0010] 上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌086的waaL基因而构建的大肠 杆菌工程菌，其基因型为086 Δ waal。
[0011] 进一步的，上述重组大肠杆菌CEB086的构建方法概述：
[0012] l.waaL基因的敲除
[0013] 基本方法是通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli 086中敲除基因 waaL(寡糖基转 移酶）。制得的缺失waaL基因的大肠杆菌E.coli 086AWaal，命名为CLM24。
[0014] 上述Red重组系统，是通过质粒pKD46表达菌体重组酶Gam、Bet和Exo,通过设计 带有waaL基因同源臂的引物扩增带有筛选标记卡那霉素抗性基因的重组片段。然后通过电 穿孔仪电击，将重组片段转入表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo的大肠杆菌中，重组片段在 重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原有的基因置换下来，而抗性基 因通过表达FLP内切酶，从基因组上切除掉。
[0015] 2.malEM基因和PglB基因表达载体的构建
[0016]基本方法是以空肠弯曲菌基因组为模板，克隆pglB基因，将所克隆获得的pglB基 因插入质粒PACT3中，从而获得重组表达载体p-pglB;以质粒pMAL-p5X为模板，克隆malEMS 因，将所克隆获得的malEM基因插入质粒pBAD24中，从而获得重组表达载体p-malEM。
[0017] 3. N-糖蛋白发酵重组菌株的构建
[0018]基本方法是将所构建的重组质粒p-pglB和p-malEM*转化大肠杆菌CLM24中，从而 获得过量表达malEMPpglB基因的重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CEB086。
[0019]本发明所述重组大肠杆菌CEB086在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应 用。
[0020] 具体的，利用重组大肠杆菌CEB086制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的方法 是：
[0021] 1.摇瓶培养
[0022]挑取所构建的重组菌株CEB086单菌落置装有3-5mL改良LB培养基的15mL的试管 中，其中氨苄青霉素终浓度为lOOwg/mL，壮观霉素终浓度为50yg/mL，在37°C，200-225r/ min，培养 12h。
[0023]将过夜培养的菌液按照0.5-3 % (v/v)的接种量接入装有50mL改良LB培养基的 100mL的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100yg/mL，氯霉素终浓度为25yg/mL，在37°C， 200-225r/min条件下培养。
[0024] 待菌液0D6QQ = 0.4-0.6时，按照0.5-3% (v/v)的接种量接入装有1L改良LB培养基 的3L的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100yg/mL，氯霉素终浓度为25yg/mL，在37°C， 200-225r/min条件下培养。
[0025] 待菌液0D6Q() = (). 6-0.8时，加入终浓度为0.2 % (v/v)的L-阿拉伯糖和终浓度为 100mM/L 的 IPTG，在 16-37°C，200-225r/min 条件下培养。
[0026]其中，上述加入L-阿拉伯糖后，发酵温度优选28°C。
[0027] 待培养4-6h后，补加一次终浓度为0.2%(v/v)的L-阿拉伯糖，在200-225r/min，28 °(：继续培养14-16小时。
[0028] 2. N-糖蛋白纯化
[0029] 将摇瓶发酵的菌液以10,000-12,0001'/111；[11离心5-10111；[11。离心所得沉淀用111^/1111 溶菌酶4°C处理lh。再以10,000-12,000r/min离心5-10min，收集上清用亲和镍柱纯化，收集 N-糖蛋白的洗脱液，超滤脱盐。
[0030] 检测结果:摇瓶发酵中N-糖蛋白的产量为1.5mg/L。
[0031] 本发明公开了一株重组大肠杆菌CEB086及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖 蛋白中的应用，利用本发明提供的重组大肠杆菌发酵制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋 白的生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于具有人血型B抗原的N-糖 蛋白的大规模生产；同时，本发明生产的人血型B抗原的N-糖蛋白具有良好的B抗原活性，可 高效吸附人血浆中的抗B抗体，为通用血产品的制备提供新的选择方案，同时，可用于血型 不兼容的器官移植，具有良好的工业开发和应用前景，应用价值巨大。
【附图说明】
[0032]图1.大肠杆菌086: B7的0抗原与人B血型抗原结构图。
[0033]图2.基因敲除原理步骤示意图及waal基因敲除琼脂糖凝胶电泳检测。
[0034]图3.p_pglB表达载体图谱。
[0035] 图44_!1^旧表达载体图谱。
[0036] 图5.SDS-PAGE分析MBP糖基化。MBP为malEM基因表达的蛋白，MBP-0PS为糖基化的 MBP。泳道1为MBP-0PS，泳道2为MBP。
[0037] 图6.Western blot分析MBP糖基化。泳道 1 为MBP-0PS，泳道2为MBP。
[0038] 图7.MALDI-T0F 分析 MBP 糖基化。
[0039]图8.MBP-0PS与人血浆中抗財允体特异性结合的ELISA检测。
[0040]图9 .MBP-0PS去除人血浆中抗B抗体及其对凝血功能的影响。
[0041 ] 图10.重组大肠杆菌CEB086表达产物示意图。
【具体实施方式】
[0042] 一般性说明：如下实施例所涉及的酶均购自Thermo公司，质粒提取试剂盒和琼脂 糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自天根公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因 测序由华大基因公司完成。质粒PBAD24来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心）；DH5a感受态 细胞购自全式金生物技术有限公司。所用人血液标本在受试者知情同意条件下取自正常成 年人。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。 [0043]所述LB培养基为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
[0044] 所述S0C培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L， MgCl2 0.203g/L，MgS〇4 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。
[0045] 所述改良LB培养基为：蛋白胨10-20g/L，酵母粉5-30g/L，甘油l-10ml/L，NaC15-10g/L〇
[0046] 实施例1、敲除大肠杆菌E.coli 086waal基因，构建大肠杆菌工程菌CLM24
[0047] (1)同源片段的克隆
[0048]利用Red重组系统对目的基因进行敲除。
[0049] 根据Genbank公布的waal基因序列设计引物如下：
[0050] pKD-waal F：
[0051 ] 5 '-TTGGAAAAGTTATCATCATTATAAAGGTAAAACATGCTAACATCCTTTAAACTTCATTC ATTGAAACCTTACACTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，
[0052] pKD-waal R：
[0053] 5 '-GAGTTTTAACTCACTTCTTAAACTTGTTTATTCTTAATTAATTGTATTGTTACGATTATT AATGACGAGTAAGAGGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3 ，
[0054] 以pKD4通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。 PCR反应体系如下：（引物浓度为20ymol/L) 1〇χ缓冲液 5μ1; 25mmol/L MgCl^ 4μΙ ； 1.0mmol/L 四神:dNTP 混合液 Ι.μL;:
[0055] 上下游引物各 ΙμL; Taq DNA 聚介_ 0.5μ1； 難 DNA ?μL； 加水补至 50μ1。
[0056] ?〇?反应条件：97°(：预变性1〇111丨11，94°(：变性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸9〇8,30个 循环后72°C延伸10min，4°C保存。通过Dpnl内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片段。 [0057] (2)电转化感受态细胞的制备
[0058] (I)挑取带有pS頂19质粒的大肠杆菌086,转入LB培养基中，同时加入100mg/L氨苄 青霉素，30 °C，200r/min，培养0D_至0.4;
[0059] (11)42。(：水浴1511^11，20(^/11^11;
[0060] (III)冰浴15min，离心菌体，然后利用10 %的甘油洗涤3次；
[00611 (IV)加入10 %的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。
[0062] (3)电转化，筛选重组子
[0063] (I)吸取8μg/ml的同源重组片段，加入100μ1的感受态细胞中，混匀后转移至预冷 的2mm电转杯中，轻甩至杯底部。调节电穿孔仪，2.5Κν，电击；
[0064] (II)加入900μ1的S0C培养基，混匀后转移至无菌ΕΡ管中，37°C，120r/min，培养lh;
[0065] (III)涂布卡那霉素抗性平板，调取重组子利用
[0066] waal test F:GGTATGTAGGGCTCCAAGAG
[0067] waal test R:AATTTGGTCCCCGAATCATC
[0068]进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实waal基因已被卡那霉素抗性基因替 换。
[0069] (IV)FLP位点特异性重组
[0070]将pCP20转入卡那霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高至42°C过夜，热诱导FLP重组 酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环沾取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同 时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉素抗性平 板上不生长的已将卡那霉素抗性基因消除。利用检测引物waal test F和waal test R进行 进一步鉴定。
[0071] (V)获得敲除waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为086Awaal，命名为 大肠杆菌CLM24。结果见图2。
[0072]实施例 2、重组质粒 pACT3-pglB、pBAD24-malEM 的构建
[0073] (l)pglB基因 （PglB NCBI-GeneID:905417)表达载体的构建
[0074] 根据NCBI公布的空肠弯曲杆菌NCTC 11168基因组序列设计引物：
[0075] pglB-F:
[0076] 5 '-CACGCCATGGTCTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCC-3 '
[0077] pglB-R:
[0078] 5 '-ATTCCCGGGTCAATGATGATGATGATGATGAATTTTAAGTTTAAAAACTTTAG-3 '
[0079] 以NCTC 11168基因组为模板，PCR克隆pglB基因。PCR反应体系如下：（引物浓度为 20ymol/L) l〇x缓冲液 5μ1; 25mmol/L Mgd： 4μ!； lOmmol/L 叫种 dNT丨1 ?介液 ΙμΙ;
[0080] 上下游引物 各ΙμL; pfuDNA 災介略 0.5μ1： 模板 DNA ΙμL； 加水补至 50μ1。
[0081 ] PCR 反应条件:97°C 预变性 10min，94°C 变性 30s，50°C 退火 30s，72°C 延伸 2min，30 个 循环后72°C延伸10min，4°C保存。
[0082]将克隆的pglB基因片段分别利用限制性内切酶Smal和Sail消化处理，同时将质粒 载体PACT3也分别利用核酸内切酶Smal和Sail消化处理。将消化处理的pglB基因片段和 PACT3质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。
[0083] 连接体系为ΙΟμΙ: pglB j Wx 6μ1 ； pBAD24 錢休 2μΙ；
[0084] lOxBulTcr ΙμL； Τ4连接酶 ΙμL。
[0085] 16°C连接12h后，将10μ1的连接液转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。
[0086] 转化过程为:将10μ1的连接液加入100μΙ的DH5a感受态细胞中，混匀，冰浴30min， 42°C热击90s，冰浴2min，加入900μ1的LB培养基，37°C，lOOr/min，孵化lh，涂布氯霉素抗性 平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证pglB基因的正确。从而获 得重组质粒pACT3-pglB。
[0087] (2) ma 1EM (来源NEB公司的质粒pMAL-p5X)基因表达载体的构建
[0088] 根据NCBI公布的质粒pMAL-p5x序列设计引物：
[0089] malEM-F:
[0090] 5'-TCCCCCGGGGGAAGGAGG CATAGATTATGAAAATAAAAACAGGTGC-3'
[0091] malEM-R:
[0092] 5 '-GCGTCGACGTCTCAATGATGATGATGATGATGGGTCGCGTTCTGATCTCCTCCAGTGG CGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCTTCCAGC TGCGCGTCTTTCAGGGC -3，
[0093] 其中：上述malEM-R中含有表达糖基化序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.l 所示，具体是：
[0094] 5'-CTGGAAGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATC AGAACGCCACTGG AGGAGATCAGAACGCGACC-3，
[0095]以质粒pMAL-p5x为模板，PCR克隆malEM基因。PCR反应体系如下：（引物浓度为20μ mol/L) l〇x缓冲液 5μΙ: 25 nimol/L MgCI；i 4μΙ； 10 mmoL/L, !叫种 dNTP 混合液 .ΙμL;
[0096] 上下游引物 各丨μΙ; P/mDNA 聚合酶 0.5μΙ; 模板 DNA ΙμL； 加水补至 50μ1,:.
[0097] PCR 反应条件：97 °C 预变性 10min，94°C 变性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C 延伸 90s，30 个 循环后72°C延伸10min，4°C保存。
[0098] 将克隆的malEM片段分别利用核酸内切酶Sail和HindllI消化处理，同时将质粒载 体PBAD24也分别利用核酸内切酶Sal I和Hindll I消化处理。将消化处理的malEM片段和 PBAD24质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。
[0099] 连接体系为10μ1: ιηα?ΕΜ 片段 6μΙ； pBAD24_^ 休 2μΙ;
[0100] χ lOxBuiTcr ΙμL； T4连接酶 ΙμL。
[0101] 16°c连接12h后，将10μ1的连接液转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。
[0102] 转化过程为:将10μ1的连接液加入100μ1的DH5a感受态细胞中，混匀。冰浴30min， 42°C热击90s，冰浴2min，加入900μ1的LB培养基，37°C，100r/min，孵化lh，涂布氨苄青霉素 抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证malEM基因的正确。从 而获得重组质粒pBAD24-malEM。
[0103] 实施例3、构建重组大肠杆菌菌株CEB086和利用该菌株制备具有人血型B抗原活性 的N-糖蛋白的应用
[0104] (1)重组大肠杆菌菌株CEB086的构建
[0105] 制备CLM24的CaCl2化学感受态细胞50ul加入5yL的重组质粒p-pglB，混匀冰浴 30min，42°C热激90s，再冰浴2min，然后加入900ul LB培养基，37°C，120r/min恢复培养lh; 4,000r/min离心2min，倒出部分上清，将剩下的菌体涂布Cam抗生素平板，37°C培养24h后挑 取重组子验证。从而获得重组菌CLM24/p-pglB。
[0106] 向制备的CLM24/p-pglB CaCl2化学感受态细胞50yL加入5yL质粒p-malEM，混匀冰 浴30min，42°C水浴锅热激90s，冰浴2min，然后加入900yL LB培养基，37°C，120r/min恢复培 养lh;4,000r/min离心2min，倒出部分上清，将剩下的菌体涂布Amp抗生素平板，37°C培养 24h后挑取重组子验证。从而获得重组菌CLM24/p-pglB+p-malE M，命名为重组大肠杆菌 CEB086。
[0107] (2)重组大肠杆菌的发酵
[0108] 挑取所构建的重组菌株CEB086(CLM24/p-pglB+p-malEM)单菌落至装有5mL的改良 LB培养基的25mL的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100yg/mL，氯霉素终浓度为25yg/ mL，在37°C，200r/min，培养 12h。
[0109]将过夜培养的菌液按照1 % (v/v)的接种量接入装有50mL改良LB培养基的1 OOmL的 三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为l〇〇yg/mL，氯霉素终浓度为25yg/mL，在37°C，200-225r/min条件下培养。
[0110]待菌液OD600 = 0.6时，按照1 % (v/v)的接种量接入装有1L改良LB培养基的3L的三 角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为l〇〇yg/mL，氯霉素终浓度为25yg/mL，在37°C，200-225r/ min条件下培养。
[0111] 待菌液0D6q() = () . 6时，加入终浓度为0.2% (v/v)的L-阿拉伯糖和终浓度100mM/L IPTG，在28°C，200-225r/min条件下培养。
[0112] 待培养6h后，补加一次终浓度为0.2 % (v/v)的L-阿拉伯糖，在28°C，200-225r/min 条件下继续培养14h。
[0113] (3)N_糖蛋白的纯化
[0114] 取1L发酵液经10,000r/min离心10min，收集菌体并用30mL的周质空间蛋白提取液 (20mM Tris_HCl，20%(wt/vol)鹿糖，ImM EDTA，lmg/ml 溶菌酶，pH 7.5)4°C 处理菌体 lh。 12，000r/min离心30min，然后收集上清并加入到已用结合缓冲液（10mM咪唑，0.5M NaCl， 2〇1^他2冊〇4/似出?〇4缓冲液4117.4)预平衡过的51^的亲和镍柱中。经过10个柱体积的结 合缓冲液洗涤，用洗脱缓冲液（250mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Na2HP〇4/NaH2P〇4缓冲液，pH 7.4)洗脱，收集含N-糖蛋白的洗脱液。
[0115] 将含有目的蛋白的洗脱液装入截留分子量为1 OkDa超滤管，4°C 5，000g离心30min， 弃去下管液体，向套管内加满脱盐缓冲液，4°C，5，000g离心30min。重复3次，至目的蛋白浓 缩至2mL，并将咪唑充分除去。浓缩后的蛋白冻存于-70°C冰箱中。
[0116] 实施例5、N-糖蛋白的鉴定
[0117] 纯化的N-糖蛋白取样进行SDS-PAGE分析。MBP分子量在46KDa左右，与理论分子量 相符。N-糖基化的MBP形成梯状条带，主条带分子量分布于50KDa与55KDa之间。由于SDS-PAGE灵敏度有限，有些糖蛋白的条带未显出。结果见图5。
[0118]利用Western Blot鉴定N-糖蛋白，分别采用anti-His、anti_MBP、anti-〇157抗体 作为一抗，选用合适的羊抗鼠或羊抗兔作为二抗，进行检测分析。N-糖基化的MBP由于添加 了链长不等的〇-抗原而显示出分子量比非糖基化的MBP大的梯状条带，证明MBP发生糖基 化。结果见图6。
[0119] 利用MALDI-T0F对N-糖基化的MBP及MBP进行分子量的鉴定。MBP分子量为45823Da， MBP主分子量分布于48790Da附近。结果见图7。证明利用重组大肠杆菌CEB086发酵制备的蛋 白为N-糖蛋白，命名为N-糖蛋白MBP mut-〇PS。
[0120] 实施例6、N-糖蛋白的人血型B抗原活性
[0121] (1)N-糖蛋白与人抗B抗体的结合
[0122 ]不同浓度 MBP、MBP_0PS (lyg/mL，2yg/mL, 4yg/mL, 6yg/mL,8yg/mL, 1 Oyg/mL 和 12yg/ mL)包被96孔板，4°C过夜。2%BSA室温封闭2小时后，PBST(PBS，0.05%Tween-20)洗板三次， 每次5分钟。一抗(抗A/抗B抗体，稀释度为1: 20)室温孵育2小时候，PBST洗板3~5次，每次5 分钟。加入羊抗鼠 IgM(l :20000)，并室温孵育1小时。最后，加入TMB显色10~20分钟，并用1M HC1终止显色反应，酶标仪读取450nm的吸光度值。结果见图8。
[0123] (2)血浆抗B抗体滴度测定
[0124] 采用凝聚胺试验测定血清血浆B抗体滴度。血浆倍比稀释，取10支EP管，每管各加 入生理盐水l〇〇yL，在第一管加入待测血浆100yL，混匀后移出100yL，至第二管，同样操作稀 释至第10管，从第10管吸出1〇〇此暂时保留在另一支EP管仲。从第1管到到第8管的血浆稀释 度依次是：1: 2，1:4，1:8，1:16……1:1024。每管各加入2%的B红细胞悬液100yL，充分混匀； 然后，各管加入凝聚胺试剂盒中的L頂液0.7ml，混匀后各加 Polybrene溶液2滴，混匀，离心， 加 Resuspending液2滴重悬溶液，观察凝集情况，读取结果。以肉眼观察的最后一个"1+"的 凝集管作为判断的终点，终点血浆稀释度的倒数为效价。
[0125] (3)MBP_0PS吸附人血浆抗財允体
[0126] 将终浓度为0,80,160and 320yg/mL的MBPmut-〇PS与800yL血浆混合，置室温1小时 候，测定血浆中抗B抗体滴度，方法同实例6(2);并应用全自动凝血功能分析仪测定样品血 浆凝血参数。结果见图9
[0127] 根据所得吸附B抗体结果可得出结论，本发明的重组大肠杆菌CEB086生产的具有B 抗原活性的N-糖蛋白有明显吸附去除人血浆中B抗体的作用，提示通过本发明的重组大肠 杆菌可大量合成去除B抗体所需要的B抗原，为人血型B抗原的生产提供了新的选择，且其具 有成本低，产率高的特点。预示本发明的重组大肠杆菌可作为生人血型B抗原的工厂，具有 良好的应用前景。
【主权项】
1. 一株重组大肠杆菌，该菌株命名为重组大肠杆菌CEB086，其特征在于:所述重组大肠 杆菌由如下方法制得： 构建含有PglB基因的pACT3-PglB的重组质粒和含有malEM基因的pBAD24-malEM的重组 质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3-PglB和pBAD24-malEM共转化已缺失waal基因的大 肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malE M基因的重组大肠杆菌，其基因型为CLM24/p-pglB+p-malEM，该菌株即为重组大肠杆菌CEB086; 其中，所述malEMS因来源于质粒pMAL-p5X，所述PglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTC 11168； 上述malEM基因为malE基因突变体，是通过在malE基因的3'末端插入一段核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示的表达糖基化序列的基因所得； 上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌086的waaL基因而构建的大肠杆菌 工程菌，其基因型为086 Δ waal。2. 权利要求1所述重组大肠杆菌在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。
【文档编号】C12P21/00GK106085933SQ201610403292
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】陈敏, 刘现伟, 商文静, 翟亚菲
【申请人】山东大学