一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明所提供的重组菌株是将枯草芽孢杆菌中的十个蛋白酶基因敲除或失活得到，这十个蛋白酶基因为：nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA、spollAC和srfAC。本发明通过同源重组方法进行前述10个蛋白酶基因的敲除，得到的枯草芽孢杆菌重组菌株生长快、且外源蛋白表达量高。因此，该重组菌株可作为外源蛋白高效表达的宿主。
【专利说明】
一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法与 应用。
【背景技术】
[0002] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，无致病 性，被公认为是安全菌株(GRAS) subtilis只有单层细胞外膜，生长速度快、营养需求简 单，易于存活、定殖与繁殖;具有清晰的遗产背景、良好的蛋白分泌能力及一系列高效的信 号肽，长期被用于食品发酵和重要酶制剂的生产;是原核表达系统中表达和分泌外源蛋白 的理想宿主。
[0003] B.subtilis由于自身分泌蛋白酶多，构建的表达质粒不稳定等因素的影响，使其 应用受到了一定程度的限制。对于枯草芽孢杆菌表达系统的改造，主要集中于敲除枯草芽 孢杆菌胞外蛋白酶基因。目前通过基因敲除技术，得到了DB104、DB403、WB600、WB700和 WB800等蛋白酶缺陷菌株。WB800是Wong教授实验团队对模式菌株B.subtilisl68构建的八 个蛋白酶缺陷株，敲除了中性蛋白酶(npr)、中性蛋白酶B(nprB)、碱性蛋白酶(apr)、金属蛋 白酶（mpr)、三种丝氨酸蛋白酶（bpf、epr和vpr)和胞壁蛋白酶（wprA) [WuSC，YeungJC, WongSL,etal.Functionalproduction and characterization of a fibrin-specific single-chain antibody fragment from Bacillus subtilis: effects of molecular chaperones and a wall-bound Protease on antibody fragment production!!J] .Appl.Environ.Microbiol ,2002,68:3261-269·]，使很多基因实现了稳定表达。但是WB800 生长较慢，残留的蛋白酶也能有效地降解高敏感的外源蛋白，且宿主携带了多种抗生素基 因。
[0004] 因此，有必要对枯草芽孢杆菌继续进一步改造，以期获得生长速度快，且外源蛋白 表达量高的菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种枯草芽孢杆菌重组 菌株。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌重组菌株的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种枯草芽孢杆菌重组菌株，是将枯草芽 孢杆菌中的十个蛋白酶基因敲除或失活得到，这十个蛋白酶基因为：中性蛋白酶编码基因 (nprE)、中性蛋白酶B编码基因（nprB)、碱性蛋白酶编码基因（aprE)、金属蛋白酶(mpr)、三 种丝氨酸蛋白酶编码基因（bpf、epr和vpr)、胞壁蛋白酶编码基因(wprA)、芽孢形成因子F编 码基因（spollAC)和surfactin合成酶编码基因（srfAC)。
[0009] 所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6051。
[0010] 所述的nprE的核苷酸序列如Gene ID:935981所示；所述的nprB的核苷酸序列如 Gene ID: 936384所示;所述的aprE的核苷酸序列如Gene ID: 939313所示;所述的mpr的核苷 酸序列如Gene ID:938430所示;所述的bpf的核苷酸序列如Gene ID:939695所示;所述的 epr的核苷酸序列如Gene ID:937332所示；所述的vpr的核苷酸序列如Gene ID:937291所 示;所述的wprA的核苷酸序列如Gene ID: 936350所示;所述的spol 1AC的核苷酸序列如Gene ID: 938729所示;所述的srfAC的核苷酸序列如Gene ID: 938308所示。
[0011] 所述的失活是基因不能正确转录或翻译。
[0012] 所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，是通过阻碍所述的十个蛋白酶基因转 录、正确转录或翻译的技术得到。
[0013] 所述的技术包括基因敲除技术、移码突变技术以及反义核苷酸干扰技术。
[0014] 所述的基因敲除技术优选为同源重组方法。
[0015] 所述的同源重组方法优选为包括如下步骤：
[0016] (1)分别构建十个蛋白酶基因的上游同源臂和下游同源臂，再将上游同源臂和下 游同源臂融合，得到上下游同源臂;十个蛋白酶基因为中性蛋白酶编码基因（nprE)、中性蛋 白酶B编码基因（nprB)、碱性蛋白酶编码基因（aprE)、金属蛋白酶(mpr)、三种丝氨酸蛋白酶 编码基因（bpf、epr和vpr)、胞壁蛋白酶编码基因（wprA)、芽孢形成因子F编码基因 (spollAC)和surfactin合成酶编码基因（srfAC);
[0017] (2)将十个蛋白酶基因的上下游同源臂分别克隆入温敏性质粒PKS2中，得到十个 蛋白酶基因的敲除载体：口1^2-即成、卩1(32-即池、卩1(32-&卩池、卩1(3211卩1'、卩1(32-匕卩;1^、卩1(32-epr、pKS2_vpr、pKS2_wprA、pKS2_spo11AC、pKS2_srfAC;
[0018] (3)将十个蛋白酶基因的敲除载体中的任一个转入枯草芽孢杆菌出发菌株中，经 筛选，得到重组菌1;再用另一个蛋白酶基因的敲除载体转入重组菌1，筛选，得到重组菌2; 分别在上一步得到的重组菌中转入一个未转入的蛋白酶基因的敲除载体，得到重组菌3、重 组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7、重组菌9,最后得到敲除十个蛋白酶基因的枯草芽孢杆 菌。
[0019] 所述的nprE的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示的引物扩增得到。
[0020] 所述的nprE的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15所示的引物扩增得到。
[0021] 所述的nprB的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17所示的引物扩增得到。
[0022]所述的nprB的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 19所示的引物扩增得到。
[0023]所述的aprE的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的引物扩增得到。
[0024]所述的aprE的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的引物扩增得到。
[0025]所述的mpr的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示的引物扩增得到。
[0026] 所述的mpr的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示的引物扩增得到。
[0027] 所述的bpf的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的引物扩增得到。
[0028] 所述的bpf的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示的引物扩增得到。
[0029] 所述的epr的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示的引物扩增得到。
[0030] 所述的epr的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的引物扩增得到。
[0031] 所述的vpr的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示的引物扩增得到。
[0032] 所述的vpr的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示的引物扩增得到。
[0033] 所述的wprA的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示的引物扩增得到。
[0034] 所述的wprA的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示的引物扩增得到。
[0035] 所述的spollAC的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示的引物扩增得到。
[0036] 所述的spollAC的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的引物扩增得到。
[0037] 所述的srfAC的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示的引物扩增得到。
[0038] 所述的srfAC的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51所示的引物扩增得到。
[0039] 所述的融合的步骤优选如下：以上游同源臂和下游同源臂为模板，以扩增上游同 源臂的上游引物和扩增下游同源臂的下游引物为引物对扩增，得到上下游同源臂。
[0040] 所述的nprE的上下游同源臂的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0041 ] 所述的nprB的上下游同源臂的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0042] 所述的aprE的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0043] 所述的mpr的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0044] 所述的bpf的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0045] 所述的epr的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.6所示。
[0046] 所述的vpr的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.7所示。
[0047] 所述的wprA的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.8所示。
[0048] 所述的spollAC的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.9所示。
[0049] 所述的srfAC的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0050] 所述将十个蛋白酶基因的上下游同源臂分别克隆入温敏性质粒pKS2中是将所述 的十个蛋白酶基因的上下游同源臂克隆入温敏性质粒PKS2中的EcoRV酶切位点。
[0051 ]所述的枯草芽孢杆菌出发菌株优选为枯草芽孢杆菌ATCC6051。
[0052]所述的重组菌1优选为缺失nprE基因的枯草芽孢杆菌。
[0053]所述的重组菌2优选为缺失nprE、nprB基因的枯草芽孢杆菌。
[0054]所述的重组菌3优选为缺失nprE、nprB、aprE基因的枯草芽孢杆菌。
[0055] 所述的重组菌4优选为缺失nprE、nprB、aprE、mpr基因的枯草芽孢杆菌。
[0056] 所述的重组菌5优选为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf基因的枯草芽孢杆菌。
[0057] 所述的重组菌6优选为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr基因的枯草芽孢杆菌。
[0058] 所述的重组菌7优选为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr基因的枯草芽孢杆 菌。
[0059] 所述的重组菌8优选为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wpr A基因的枯草 芽孢杆菌。
[0060] 所述的重组菌 9 优选为缺失 nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA、spollACS 因的枯草芽孢杆菌。
[0061] 所述的筛选是经过37°C升温培养和30°C降温培养，再通过PCR和测序验证，进行筛 选;优选包括如下步骤：
[0062]①将蛋白酶基因的敲除载体转入枯草芽孢杆菌得到菌液涂布于含5yg/mL红霉素 (erm)抗性的LB平板，于30°C倒置培养，得到初步确认的阳性克隆；
[0063]②挑取初步确认的阳性克隆，接种于含5yg/mL红霉素抗性的LB液体培养基中，于 30°C、200rpm培养12h，提质粒验证已转入宿主中，得到再次确认的阳性克隆；
[0064]③取1 OOyL再次确认的阳性克隆的菌液，接种于1 OmL LB液体培养基中37°C培养 12h，稀释1000倍，取100yL菌液涂布于含5yg/mL红霉素抗性的LB平板上，37 °C培养12h;
[0065] ④挑取步骤③含5yg/mL红霉素抗性的LB平板上的转化子，接种于10mL LB液体培 养基中，30 °C，200rpm培养12h;培养液稀释105倍，取100yL菌液涂布于LB固体平板上，37°C 培养12h;
[0066] ⑤挑取步骤④LB固体平板长出的单菌落同时转接于LB平板上和含5yg/mL红霉素 抗性的LB平板上，表型表现为在LB无抗平板上生长，而在LB抗性平板上不长的为疑似克隆 子，PCR进一步验证，得到重组菌。
[0067] 所述的枯草芽孢杆菌重组菌株在外源蛋白表达中的应用。
[0068] 所述的外源蛋白优选为转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTG)。
[0069] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:在对枯草芽孢杆菌的改造中，由 于改变枯草芽孢杆菌自身蛋白的表达，虽然降低了对外源蛋白的降解作用程度，但是往往 会影响到枯草芽孢杆菌的生长繁殖速度。本发明虽然失活枯草芽孢杆菌十个胞外分泌蛋白 酶基因，但是得到生长快、且外源蛋白表达量高的重组菌株。从而本发明提供的菌株可作为 外源蛋白高效表达的宿主。
【附图说明】
[0070]图1为基因敲除质粒构建不意图。
[0071] 图2为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC6051基因敲除突变株的PCR鉴定结 果图；其中，泳道1-10为B.subtilis ATCC6051、泳道11为重组菌9,泳道12为重组菌1，泳道 13为重组菌3,泳道14为重组菌10,泳道15为重组菌2,泳道16为重组菌6,泳道17为重组菌4， 泳道18为重组菌7，泳道19为重组菌8，泳道20为重组菌5，泳道Μ为DNA marker。
[0072] 图3为出发菌B.subtilis ATCC6051、重组菌Bacillus subtilis ATCC6051A10、 Bacillus subtilis ATCC6051(pBEp43-proMTG)和Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10 (pBEp43-proMTG)的生长曲线图。
[0073] 图4为SDS-PAGE蛋白电泳分析重组菌发酵液上清中转谷氨酰胺酶的分泌表达结果 图；其中，泳道 1 为Bacillus subtilis ATCC6051，泳道2为重组菌Bacillus subtilis ATCC6051Λ10，泳道3为带有pBEp43-proMTG质粒的Baci 1 lus subti 1 is ATCC6051，泳道4为 带有pBEp43-proMTG质粒的Bacillus subtilis ATCC6051A10。
【具体实施方式】
[0074] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0075] 实施例1枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC6051十个基因敲除载体的构建
[0076] 以Bacillus subtilis ATCC6051(购于NBRC，货号为NBRC 13719)的基因组DNA为 模板，分别用表1中的引物对F-X-L、R-X-L和F-X-R、R-X-R(X为待敲除基因，下同）进行扩增， 得到扩增产物X-L(待敲除基因上游同源臂)和X-R(待敲除基因下游同源臂）。
[0077] 以X-L片段和X-R片段为模板，以F-X-L和R-X-R为引物，进行融合PCR，得到相应的 十个融合产物(L+R片段）。十个融合产物分别克隆入pMD18-T载体中，经过测序，这十个融合 片段分别是具有序列表中序列1所示的核苷酸(nprE编码基因同源臂的DNA分子）、序列2所 示的核苷酸(nprB编码基因同源臂的DNA分子）、序列3所示的核苷酸(aprE编码基因同源臂 的DNA分子）、序列4所示的核苷酸(mpr编码基因同源臂的DNA分子）、序列5所示的核苷酸 (bpf编码基因同源臂的DNA分子）、序列6所示的核苷酸(epr编码基因同源臂的DNA分子）、序 列7所示的核苷酸(vpr编码基因同源臂的DNA分子）、序列8所示的核苷酸(wprA编码基因同 源臂的DNA分子）、序列9所示的核苷酸（spollAC编码基因同源臂的DNA分子)和序列10所示 的核苷酸(srfAC编码基因同源臂的DNA分子）。
[0078] 将上述融合产物分别插入温敏质粒pKS2(该质粒已在专利CN201210052578.2中公 开，是将PKS1中的三个BamM酶切位点消除而得，该载体的核苷酸序列为序列表中的序列 11)的EcoRV酶切位点，得到重组质粒pKS2-X(L+R)(见图1)，即十个基因的敲除载体 :？1(52-nprE、pKS2_nprB、pKS2_aprE、pKS2_mpr、pKS2_bpf、pKS2_epr、pKS2_vpr、pKS2_wprA、pKS2_ spollAC、pKS2_srfAC〇
[0079]表1基因敲除载体构建相关引物序列如下：
[0080]
[0081]
[0082]
[0083] PCR反应体系如下： 5XPrime STAR PCR buffer 2〇μ1 dNTP (10mM eaeh) 8M F-X-L (F-X-R) 2.μ1 R-X-L (R-X-R) 2μL
[0084] Prime STAR ?HS DM 聚合酶 1_μ:1 枯草芽抱杆菌基因组DNA 1 μL ddH2() 66μΙ 100μΙ
[0085] PCR 程序为 98°C5min;35 个循环：98Γ3〇8,54Γ3〇8,72Γ4〇8;72Γ?Οπ?η。
[0086] 实施例2
[0087] (1)重组菌l(Bacillus subtilis ATCC6051 Δ nprE)的构建
[0088] ①将重组质粒pKS2-nprE先转入大肠杆菌TG1 (购于宝生物工程(大连)有限公司）， 提取质粒，其它重组质粒也进行相同操作。然后通过电转化方法将质粒pKS2-nprE转入 Bacillus subtilis ATCC6051 中（具体方法参考非专利文献记录Natalia P，Zakataeva, Oksana V et al.A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains[J] .Appl Microbiol Biotechnol .2010,85:1201-1209.)，于3(TC倒置培养，用5μ g/mL红霉素(erm)抗性的LB平板筛选出阳性克隆子。
[0089]②挑取抗性平板上的阳性克隆子，接种于50mL三角瓶装液量为10mL LB液体培养 基中（5yg/mL erm)，于30°C、200rpm培养12h，提质粒验证已转入宿主中，得转化菌株 Bacillus subtilis ATCC6051(pKS2_nprE)。
[0090] ③取lOOyL经过质粒鉴定后的菌液，接种于10mL LB液体培养基(无抗性）中37°C培 养12h，稀释10-3,取100yL菌液涂布于LB抗性平板上(5yg/mL erm)，37°C培养12h。
[0091] ④挑取抗性平板上的转化子，接种于10mL LB液体培养基（无抗性）中，30°C， 200rpm培养12h;培养液稀释10-5取100yL菌液涂布于LB(无抗性)固体平板上，37 °C培养12h。
[0092] ⑤无抗平板(步骤④)上长出的单菌落同时转接于LB无抗平板上和LB抗性平板上 (5yg/mL erm)，表型表现为在LB无抗平板上生长，而在LB抗性平板上不长的为疑似克隆子， 用引物F-nprE-L(SEQIDN0·12)和R-nprE-R(SEQIDN0·15)通过PCR进一步验证，PCR鉴定 结果见图2;经测序，得到重组菌1 (Bacillus subtilis ΑΤ(Χ6051 Δ nprE)。
[0093] (2)重组菌2:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 2(nprE、nprB)的构建
[0094] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌1，使用 pKS2-nprB质粒，得到重组菌2。用引物F-nprB-L(SEQIDN0·16)和R-nprB-R(SEQID N0.19)通过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2。
[0095] (3)重组菌3:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 3(nprE、nprB、aprE)的构建
[0096] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌2,使用 pKS2-aprE质粒，得到重组菌3。用引物F-aprE-L(SEQIDN0:20)和R-aprE-R(SEQIDN0: 23)通过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2。
[0097] (4)重组菌4:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ
[0098] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌3,使用 pKS2-mpr质粒，得到重组菌4。用引物F-mpr-L(SEQIDN0·24)和R-mpr-R(SEQIDN0·27)通 过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2。
[0099] (5)重组菌5:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 5(即也、即池、&卩也、111卩1'、匕卩;〇的构 建
[0100] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌4,使用 pKS2-bpf质粒，得到重组菌5。用引物F-bpf-L(SEQIDN0·28)和R-bpf-R(SEQIDN0·31)通 过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2
[0101] (6)重组菌6:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 6(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr) 的构建
[0102] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌5,使用 pKS2-印r质粒，得到重组菌6。用引物F-epr-L(SEQIDN0·32)和R-epr-R(SEQIDN0·35)通 过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2
[0103] (7)重组菌7:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 7(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、 vpr)的构建
[0104] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌6,使用 pKS2-vpr质粒，得到重组菌7。用引物F-vpr-L(SEQIDN0·36)和R-vpr-R(SEQIDN0·39)通 过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2.
[0105] (8)重组菌8:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 8(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、 vpr、wprA)的构建
[0106] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌7,使用 pKS2-wprA质粒，得到重组菌8。用引物F-wprA-L(SEQ ID N0.40)和R-wprA-R(SEQ ID NO. 43)通过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2
[0107] (9)重组菌9:Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 9(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、 vpr、wprA、spoil AC)的构建
[0108] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌8,使用 pKS2-spollAC质粒，得到重组菌9。用引物F-spollAC-L(SEQ ID N0.44WPR-spollAC-R(SEQ ID NO. 47)通过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2
[0109] (10)Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vp;r、 wprA、spollAC、srfAC)的构建
[0110] 操作方法基本同步骤（1)，区别在于：出发菌株为上述步骤所得的重组菌9,使用 pKS2_aprE质粒，得到目地菌株Bacillus subtilis ATCC6051 A 10(nprE、nprB、aprE、mpr、 bpf、epr、vpr、wprA、spollAC、srfAC)。用引物F_srfAC_L(SEQ ID NO.48)和R-srfAC_R(SEQ ID NO. 51)通过PCR进一步验证，PCR鉴定结果见图2。
[0111] 实施例3转谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10(nprE、nprB、aprE、 mpr、bpf、epr、vpr、wpr A、spo 11 AC、srfAC)的表达
[0112] 以质粒pBEp43-proMTG (按CN201210052578 · 2、一株重组的枯草芽孢杆菌及其生产 转谷氨酰胺酶的方法构建得到）为表达质粒，用电转化方法转入Baci llus subtil is ATCC6051 和Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10,得到两转化菌株Bacillus subtilis ATCC6051(pBEp43-proMTG)和Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10(pBEp43-proMTG)〇
[0113] 挑取Bacillus subtilis ATCC6051(pBEp43-proMTG)和Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10(pBEp43-proMTG)的单菌落分别接种于lOmL LB培养基中（卡那霉素20yg/mL) 于37°C，200rpm活化12h，将活化的种子液接种于50mL LB培养基中（卡那霉素20yg/mL)，接 种量为1 % (体积比），于37 °C、200rpm发酵48h ;同时以出发菌株Bacillus subtilis ATCC6051和Bacillus subtilis ATCC6051 Δ 10作为对照（没有抗性的培养基，其它培养条 件一致）。分六个时间点取样，3h、6h、12h、24h、36h和48h测定0D 6QQ值，重组菌Bacillus subtilis ATCC6051 Δ10的生长速度高于出发菌Bacillus subtilis ATCC6051，而 Bacillus subtilis ATCC6051 A10(pBEp43-proMTG)的生长速度也是比Bacillus subti 1 is ATCC6051 (pBEp43-proMTG)快，且48h达到最高值（见图 3)。
[0114] 取上述48h发酵样品离心取上清液，上清液跑SDS-PAGE电泳。结果如图4所示， Bacillussubtilis ATCC6051(pBEp43-proMTG)和Bacillus subtilis ΑΤ(Χ6051Δ10 (pBEp43-pr〇MTG)的上清液显示在44-46KDa有条带和MTG蛋白大小一致；而出发菌株 Bacillus subtilis ATCC6051 和Bacillus subtilis ΑΤ(Χ6051 Δ 10在此大小范围内无条 带，且Bacillus subtilis ATCC6051 A10(pBEp43-proMTG)条带明显浓于Bacillus subtilis ATCC6051 (pBEp43_proMTG)。实验结果说明MTG 蛋白酶原在 Baci llus subtilis ATCC6051 Δ 10的表达量高于Bacillus subtilis ATCC6051(见图4)。
[0115] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌重组菌株，其特征在于：是将枯草芽孢杆菌中的十个蛋白酶基因 敲除或失活得到，这十个蛋白酶基因为:nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA、spo 11AC 和srfAC〇2. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌株，其特征在于:所述的枯草芽孢杆菌为 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is )ATCC6051 〇3. 权利要求1或所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于:是通过阻碍所 述的十个蛋白酶基因转录、正确转录或翻译的技术得到。4. 根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于:所述的技术 包括基因敲除技术、移码突变技术以及反义核苷酸干扰技术。5. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于:所述的基因 敲除技术为同源重组方法。6. 根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于:所述的同源 重组方法包括如下步骤： (1) 分别构建十个蛋白酶基因的上游同源臂和下游同源臂，再将上游同源臂和下游同 源臂融合，得到上下游同源臂；十个蛋白酶基因为nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、 wprA、spo11AC和srfAC; (2) 将十个蛋白酶基因的上下游同源臂分别克隆入温敏性质粒pKS2中，得到十个蛋白 酶基因的敲除载体：pKS2-nprE、pKS2-nprB、pKS2-aprE、pKS2-mpr、pKS2-bpf、pKS2-epr、 pKS2_vpr、pKS2-wprA、pKS2-spollAC、pKS2-srfAC; (3) 将十个蛋白酶基因的敲除载体中的任一个转入枯草芽孢杆菌出发菌株中，经筛选， 得到重组菌1;再用另一个蛋白酶基因的敲除载体转入重组菌1，筛选，得到重组菌2;分别在 上一步得到的重组菌中转入一个未转入的蛋白酶基因的敲除载体，得到重组菌3、重组菌4、 重组菌5、重组菌6、重组菌7、重组菌9，最后得到敲除十个蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌。7. 根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于： 所述的nprE的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 12 和SEQ ID NO. 13所示的引物扩增得到； 所述的nprE的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 14 和SEQ ID NO. 15所示的引物扩增得到； 所述的nprB的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 16 和SEQ ID NO. 17所示的引物扩增得到； 所述的nprB的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 18 和SEQ ID NO. 19所示的引物扩增得到； 所述的aprE的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 20 和SEQ ID NO.21所示的引物扩增得到； 所述的aprE的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 22 和SEQ ID NO.23所示的引物扩增得到； 所述的mpr的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 24和 SEQ ID NO.25所示的引物扩增得到； 所述的mpr的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 26和 SEQ ID NO.27所示的引物扩增得到； 所述的bpf的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 28和 SEQ ID NO.29所示的引物扩增得到； 所述的bpf的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 30和 SEQ ID NO.31所示的引物扩增得到； 所述的epr的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 32和 SEQ ID NO.33所示的引物扩增得到； 所述的epr的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 34和 SEQ ID NO.35所示的引物扩增得到； 所述的vpr的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 36和 SEQ ID NO.37所示的引物扩增得到； 所述的vpr的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO. 38和 SEQ ID NO.39所示的引物扩增得到； 所述的wprA的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.40 和SEQ ID NO.41所示的引物扩增得到； 所述的wprA的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.42 和SEQ ID NO.43所示的引物扩增得到； 所述的spollAC的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示的引物扩增得到； 所述的spollAC的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的引物扩增得到； 所述的srfAC的上游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.48 和SEQ ID NO.49所示的引物扩增得到； 所述的srfAC的下游同源臂是以枯草芽孢杆菌出发菌株DNA为模板，以如SEQ ID NO.50 和SEQ ID NO.51所示的引物扩增得到。8. 根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于:所述的融合 的步骤如下：以上游同源臂和下游同源臂为模板，以扩增上游同源臂的上游引物和扩增下 游同源臂的下游引物为引物对扩增，得到上下游同源臂； 所述的nprE的上下游同源臂的序列如SEQ ID N0.1所示； 所述的nprB的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.2所示； 所述的aprE的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.3所示； 所述的mpr的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示； 所述的bpf的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.5所示； 所述的epr的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.6所示； 所述的vpr的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.7所示； 所述的wprA的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.8所示； 所述的spollAC的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO.9所示； 所述的srfAC的上下游同源臂的序列如SEQ ID NO. 10所示。9. 根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于： 所述的枯草芽孢杆菌出发菌株优选为枯草芽孢杆菌ATCC6051; 所述的重组菌1为缺失nprE基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌2为缺失nprE、nprB基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌3为缺失nprE、nprB、aprE基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌4为缺失nprE、nprB、aprE、mpr基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌5为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌6为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌7为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌8为缺失nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wpr A基因的枯草芽孢杆菌； 所述的重组菌 9 为缺失 nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA、spollAC基因的枯草 牙抱杆囷。10.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌重组菌株在外源蛋白表达中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK106085937SQ201610429216
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】潘力, 刘欣, 王斌
【申请人】华南理工大学