一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法
【专利摘要】一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，步骤包括：从三七种植地块中取出土壤，加蒸馏水混合并过滤，得到土壤液；从圆斑病发病的叶片上提取槭菌刺孢的分生孢子，转移到水琼脂培养基上培养，得到萌发的分生孢子；从萌发的分生孢子中提取单个分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养，得到槭菌刺孢；将槭菌刺孢放在第一培养皿中培养，得到槭菌刺孢菌饼；从槭菌刺孢菌饼上提取菌丝块置于第二培养皿中，倒入土壤液，培养得到三七圆斑病菌分生孢子。本发明的有益效果是：能够有效诱导槭菌刺孢产生可供科学研究实验所需的分生孢子，并确保实验的稳定性、可操作性和可重复性，培养周期短、产孢量大，操作简便，成本低廉，有利于推广。
【专利说明】
_种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法
技术领域
[0001]本发明属于农业种植技术领域，具体涉及一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法。
【背景技术】
[0002]三七为五加科人参属多年生草本宿根植物，是一种原产我国的名贵中药材。三七 圆斑病是三七种植过程中的一种常见的真菌病害，在传统露天荫棚的三七种植园中，当遭 遇连续阴雨天气，且气温在15°c~20°C范围时，最容易爆发圆斑病，导致大面积发生与蔓 延。一旦发病，从开始发病到发病高峰期病程短，发病迅猛、毁灭性强，常年平均发病率在 30%左右，雨季来临时若管理不善发病率可高达60%以上，严重时发病率高达70%以上，甚 至毁园，给三七种植带来巨大损失。三七圆斑病主要侵染叶片、叶柄和茎杆等地上部位，造 成叶片和叶柄脱落，也可侵染根部造成根腐。叶片发病初期叶背面呈现黄色小点，在天气潮 湿或连续阴雨天，迅速扩大成透明状圆形，发病后天气干燥时，病斑较大，圆形褐色，有明显 轮纹。茎杆受害时，受害部位呈板栗色，病部有灰白色霉层，可引起芽腐和茎基腐。
[0003] 三七圆斑病的致病菌为槭菌刺孢[Mycocentrospora acerina(Hartig) Dei ghton ]，隶属于半知菌亚门，丝孢纲，暗色孢科，菌刺孢属。槭菌刺孢菌可寄生于淡水流 域的沉水植物上也侵染陆地寄主植株引起植物病害，该菌寄主范围广泛，危害严重，在国外 主要引起三色堇叶斑病、欧芹储藏期腐烂病、胡萝卜根腐病、牛蒡溃疡病及冠腐病等病害，该 病原于上世纪90年代初传入我国，侵染药用植物细辛，引起细辛叶枯病。据调查报道1993年 开始侵染三七植株，导致三七圆斑病，此后三七圆斑病逐年扩大，目前已成为三七病害中的 重要叶部病害之一。
[0004] 三七圆斑病菌的分生孢子单生、顶侧生，倒棍棒形，具长喙，基部平截，淡褐色，大 小为54-250μπιΧ7.7-14μπι，4-16个隔，少数孢子基部有侧生的刺状附属丝。三七圆斑病菌在 PDA培养基培养上的最适宜生长温度为18°C~20 °C，光照条件下能产生玫瑰色色素，后期逐 渐变为灰色至灰黑色。三七圆斑病菌的分生孢子是病原菌形态鉴定的重要依据，也可利用 其进行室内毒力测定，筛选高效农药。
[0005] 槭菌刺孢是一种重要的病原。随着三七生产种植范围的逐年扩大，该病的发生也 愈加普遍，在化学防治方面，每年的农药施用量也出现了增加，该病原是否发生了变异未有 相关报道。目前暂无关于槭菌刺孢侵染三七的病理学报道，由于其分生孢子的人工诱导不 易，从而滞后了槭菌刺孢分类学和生物学等领域的研究进展。
[0006] 槭菌刺孢分生孢子的产生方式特殊，其分生孢子的诱导一直以来都是难题，一般 在自然发病的叶片或人工保湿培养的发病叶片上均能产生分生孢子，而在PDA培养基上培 养时，却很难产生分生孢子，这就给形态鉴定和药剂筛选带来一定困难。偶见国外学者报道 槭菌刺孢在人工培养基如(PDA、1/4H)A、V8汁培养基等)上可产生分生孢子的研究报道，但 并没有详细的描述;而国内学者则普遍认为槭菌刺孢在人工培养基上不能产生分生孢子。 虽然已有文献报道了多种产孢方法可诱导分生孢子的产生，但都存在周期长(最长可达一 个月左右）、重复性差、产孢量少等问题。
【发明内容】
[0007] 为解决现有产孢方法周期长、重复性差、产孢量少等问题，本发明的目的在于提供 一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现的：一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，步 骤包括:制作培养基和配制土壤液、分生孢子分离培养、单孢分离培养、菌饼培养、土壤液诱 导培养。
[0009] 本发明优选地，步骤包括：
[0010] A.制作培养基和配制土壤液:配制水琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在 上述水琼脂培养基上涂满氯霉素；从三七种植地块中取出土壤样本，加入蒸馏水充分混合 并过滤，得到土壤液；
[0011 ] B.分生孢子分离培养:从圆斑病发病的叶片上提取槭菌刺孢的分生孢子，将分生 孢子转移到水琼脂培养基上，置于培养箱中培养，得到萌发的分生孢子；
[0012] C.单孢分离培养:从萌发的分生孢子中提取单个分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖 琼脂培养基上，置于培养箱中培养，得到槭菌刺孢；
[0013] D.菌饼培养:将槭菌刺孢放在第一培养皿中培养，待菌丝长满第一培养皿，得到槭 菌刺孢菌饼；
[0014] E. 土壤液诱导培养:从上述槭菌刺孢菌饼上提取菌丝块置于第二培养皿中，将上 述土壤液倒入第二培养皿，使土壤液在第二培养皿中的液面高度与上述菌丝块的高度一 致，将第二培养皿放入培养箱中培养得到三七圆斑病菌分生孢子。
[0015]本发明优选地，上述步骤A中的上述土壤样本为如下土壤中的任一种:三年生三七 健康植株的根际土、二年生三七健康植株的根表土、三七连作地块中再次种植的二年生三 七健康植株的根际土、三七连作地块中再次种植的二年生三七根腐植株的根表土。
[0016] 本发明优选地，上述水琼脂培养基的配制比例为:琼脂/水= 4g/100ml，水琼脂培 养基上涂抹的氯霉素浓度为:50yg/mL。
[0017] 本发明优选地，上述步骤B的培养方式为:将上述水琼脂培养基置于20摄氏度培养 箱中，黑暗培养8小时以上。
[0018] 本发明优选地，上述步骤C的培养方式为:将上述马铃薯葡萄糖琼脂培养基置于20 摄氏度培养箱中，黑暗培养8小时以上。
[0019] 本发明优选地，上述步骤D的培养温度保持在18摄氏度~20摄氏度之间。
[0020] 本发明优选地，上述步骤E的培养方式为:将上述第二培养皿置于培养箱中，温度 保持在18摄氏度~20摄氏度之间，黑暗培养15天~17天。
[0021] 本发明的原理是:种植过三七(包括2年七和3年七)的土壤(包括根表土和根际土） 中含有三七的一些根系分泌物，如皂苷类化合物、酚类物质等，即化感物质，这些化感物质 虽为微量，当足以能诱导三七圆斑病菌产生分生孢子;而圆斑病菌产生分生孢子的目的是 为了侵染寄主三七。不同类型的三七种植地块土壤含有的根系分泌物含量存在差异，因而 选取不同类型的三七种植地块土壤制成土壤混合液，由这些土壤混合液培养圆斑病菌所能 得到的分生孢子数量也会存在较大差异。不同类型的三七种植地块土壤中根系分泌物的含 量大小为:三七连作地块中再次种植的二年生三七根腐植株的根表土>二年生三七健康植 株的根表土>三年生三七健康植株的根际土>三七连作地块中再次种植的二年生三七健 康植株的根际土。
[0022]圆斑病菌在18摄氏度~20摄氏度时生长发育最快，因而在培养皿中培养圆斑病菌 时始终保持温度处于18摄氏度~20摄氏度范围内。
[0023] 在持续阴雨天气中，空气相对湿度处于80%~100%，此时的湿度条件有利于病原 菌分生孢子的萌发和扩散，且空气湿度越大，孢子分生的速度越快、数量越大，因此，在培养 皿中倒入土壤溶液时，使土壤溶液在培养皿中的液面高度与菌丝块的高度一致，也正是为 了提供充足的水分和湿度，以利于圆斑病菌的孢子分生。
[0024]在水琼脂平板上涂上50yg/mL氯霉素有利于抑制杂菌生长，便于圆斑病菌的分离， 有利于提高圆斑病菌的检出率。
[0025] 统计分生孢子的数量，通过显微镜（10倍物镜X 10倍目镜，即放大100倍)观察，计 数每个视野内的孢子数。
[0026] 本发明的有益效果是:能够有效诱导槭菌刺孢产生可供科学研究实验所需的分生 孢子，并确保实验的稳定性、可操作性和可重复性，培养周期短、产孢量大，操作简便，成本 低廉，有利于推广。
【具体实施方式】
[0027] 本发明所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，步骤包括：制作培养基和配 制土壤液、分生孢子分离培养、单孢分离培养、菌饼培养、土壤液诱导培养。
[0028] 实施例1
[0029] 步骤包括：
[0030] A.制作培养基和配制土壤液:配制水琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，水 琼脂培养基的配制比例为:琼脂/水= 4g/100ml，在水琼脂培养基上涂满50yg/mL的氯霉素； 取三七连作地块中再次种植的二年生三七根腐植株的根表土放入烧杯，往烧杯中加入蒸馏 水，用玻璃棒搅拌使烧杯中的土壤和蒸馏水充分混合，取单层滤纸过滤，得到土壤液；
[0031 ] B.分生孢子分离培养:从圆斑病发病的叶片上提取槭菌刺孢的分生孢子，将分生 孢子转移到水琼脂培养基上，置于20摄氏度培养箱中黑暗培养9小时，得到萌发的分生孢 子；
[0032] C.单孢分离培养:从萌发的分生孢子中提取单个分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖 琼脂培养基上，置于20摄氏度培养箱中黑暗培养9小时，得到槭菌刺孢；
[0033] D.菌饼培养:将槭菌刺孢放在第一培养皿中培养，培养温度保持在18摄氏度，待菌 丝长满第一培养皿，得到槭菌刺孢菌饼；
[0034] E.土壤液诱导培养:从槭菌刺孢菌饼上提取菌丝块置于第二培养皿中，将土壤液 倒入第二培养皿，使土壤液在第二培养皿中的液面高度与菌丝块的高度一致，将第二培养 皿放入培养箱中黑暗培养17天，培养温度保持在18摄氏度，得到三七圆斑病菌分生孢子。 [0035]本实施例是本发明的最佳实施例，经过反复试验验证，由本实施例采用的三七圆 斑病菌分生孢子诱导方法在培养周期、产孢量、稳定性、可操作性、可重复性之间达到了最 佳的平衡状态，使培养周期短、产孢量大、实验结果稳定可靠、实验方法可操作可重复等优 点共同取得了最优化的组合效果。
[0036] 实施例2
[0037] 基于实施例1，步骤A中取用的土壤为二年生三七健康植株的根表土。
[0038] 实施例3
[0039]基于实施例1，步骤A中取用的土壤为三年生三七健康植株的根际土。
[0040] 实施例4
[00411基于实施例1，步骤A中取用的土壤为三七连作地块中再次种植的二年生三七健康 植株的根际土。
[0042] 实施例5 [0043] 步骤包括：
[0044] A.制作培养基和配制土壤液:配制水琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，水 琼脂培养基的配制比例为:琼脂/水= 4g/100ml，在水琼脂培养基上涂满50yg/mL的氯霉素； 取三七连作地块中再次种植的二年生三七根腐植株的根表土放入烧杯，往烧杯中加入蒸馏 水，用玻璃棒搅拌使烧杯中的土壤和蒸馏水充分混合，取单层滤纸过滤，得到土壤液；
[0045] B.分生孢子分离培养:从圆斑病发病的叶片上提取槭菌刺孢的分生孢子，将分生 孢子转移到水琼脂培养基上，置于20摄氏度培养箱中黑暗培养8小时，得到萌发的分生孢 子；
[0046] C.单孢分离培养:从萌发的分生孢子中提取单个分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖 琼脂培养基上，置于20摄氏度培养箱中黑暗培养8小时，得到槭菌刺孢；
[0047] D.菌饼培养:将槭菌刺孢放在第一培养皿中培养，培养温度保持在19摄氏度，待菌 丝长满第一培养皿，得到槭菌刺孢菌饼；
[0048] E.土壤液诱导培养:从槭菌刺孢菌饼上提取菌丝块置于第二培养皿中，将土壤液 倒入第二培养皿，使土壤液在第二培养皿中的液面高度与菌丝块的高度一致，将第二培养 皿放入培养箱中黑暗培养16天，培养温度保持在19摄氏度，得到三七圆斑病菌分生孢子。
[0049] 实施例6
[0050]基于实施例5,步骤A中取用的土壤为二年生三七健康植株的根表土。
[0051 ] 实施例7
[0052]基于实施例5,步骤A中取用的土壤为三年生三七健康植株的根际土。
[0053] 实施例8
[0054]基于实施例5,步骤A中取用的土壤为三七连作地块中再次种植的二年生三七健康 植株的根际土。
[0055] 实施例9 [0056] 步骤包括：
[0057] A.制作培养基和配制土壤液:配制水琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，水 琼脂培养基的配制比例为:琼脂/水= 4g/100ml，在水琼脂培养基上涂满50yg/mL的氯霉素； 取三七连作地块中再次种植的二年生三七根腐植株的根表土放入烧杯，往烧杯中加入蒸馏 水，用玻璃棒搅拌使烧杯中的土壤和蒸馏水充分混合，取单层滤纸过滤，得到土壤液；
[0058] B.分生孢子分离培养:从圆斑病发病的叶片上提取槭菌刺孢的分生孢子，将分生 孢子转移到水琼脂培养基上，置于20摄氏度培养箱中黑暗培养10小时，得到萌发的分生孢 子；
[0059] C.单孢分离培养:从萌发的分生孢子中提取单个分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖 琼脂培养基上，置于20摄氏度培养箱中黑暗培养10小时，得到槭菌刺孢；
[0060] D.菌饼培养:将槭菌刺孢放在第一培养皿中培养，培养温度保持在20摄氏度，待菌 丝长满第一培养皿，得到槭菌刺孢菌饼；
[0061] E. 土壤液诱导培养:从槭菌刺孢菌饼上提取菌丝块置于第二培养皿中，将土壤液 倒入第二培养皿，使土壤液在第二培养皿中的液面高度与菌丝块的高度一致，将第二培养 皿放入培养箱中黑暗培养15天，培养温度保持在20摄氏度，得到三七圆斑病菌分生孢子。
[0062] 实施例10
[0063]基于实施例9,步骤A中取用的土壤为二年生三七健康植株的根表土。
[0064] 实施例11
[0065]基于实施例9,步骤A中取用的土壤为三年生三七健康植株的根际土。
[0066] 实施例12
[0067]基于实施例9,步骤A中取用的土壤为三七连作地块中再次种植的二年生三七健康 植株的根际土。
[0068] 经过试验和数据统计，对比效果如下：
[0069]
[0070] 上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，在不脱 离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均应视为 落入要求保护的本发明范围内。
【主权项】
1. 一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:步骤包括:制作培养基和配制土 壤液、分生孢子分离培养、单孢分离培养、菌饼培养、土壤液诱导培养。2. 根据权利要求1所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于：步骤包 括： A. 制作培养基和配制土壤液:配制水琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在所述 水琼脂培养基上涂满氯霉素;从三七种植地块中取出土壤样本，加入蒸馏水充分混合并过 滤，得到土壤液； B. 分生孢子分离培养:从圆斑病发病的叶片上提取槭菌刺孢的分生孢子，将分生孢子 转移到水琼脂培养基上，置于培养箱中培养，得到萌发的分生孢子； C. 单孢分离培养:从萌发的分生孢子中提取单个分生孢子，转移到马铃薯葡萄糖琼脂 培养基上，置于培养箱中培养，得到槭菌刺孢； D. 菌饼培养:将槭菌刺孢放在第一培养皿中培养，待菌丝长满第一培养皿，得到槭菌刺 孢菌饼； E. 土壤液诱导培养:从所述槭菌刺孢菌饼上提取菌丝块置于第二培养皿中，将所述土 壤液倒入第二培养皿，使土壤液在第二培养皿中的液面高度与所述菌丝块的高度一致，将 第二培养皿放入培养箱中培养得到三七圆斑病菌分生孢子。3. 根据权利要求2所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:所述步骤 A中的所述土壤样本为如下土壤中的任一种:三年生三七健康植株的根际土、二年生三七健 康植株的根表土、三七连作地块中再次种植的二年生三七健康植株的根际土、三七连作地 块中再次种植的二年生三七根腐植株的根表土。4. 根据权利要求2所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:所述水琼 脂培养基的配制比例为:琼脂/水= 4g/100ml，水琼脂培养基上涂抹的氯霉素浓度为:50yg/ mL〇5. 根据权利要求2所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:所述步骤 B的培养方式为:将所述水琼脂培养基置于20摄氏度培养箱中，黑暗培养8小时以上。6. 根据权利要求2所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:所述步骤 C的培养方式为:将所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基置于20摄氏度培养箱中，黑暗培养8小时 以上。7. 根据权利要求2所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:所述步骤 D的培养温度保持在18摄氏度~20摄氏度之间。8. 根据权利要求2所述的一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，其特征在于:所述步骤 E的培养方式为:将所述第二培养皿置于培养箱中，温度保持在18摄氏度~20摄氏度之间， 黑暗培养15天~17天。
【文档编号】C12N3/00GK106085945SQ201610715983
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】陈中坚, 杨绍周, 王勇, 魏富刚, 余育启
【申请人】文山苗乡三七科技有限公司