一种耐酸性高温α?淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法
【专利摘要】本发明公开一种耐酸性高温α?淀粉酶的基因、工程菌及其制备方法，该耐酸性高温α?淀粉酶在pH4.2?4.6、95℃条件下较文献报道的突变体热稳定性增强，并且表达量是现有耐酸性高温α?淀粉酶的50倍，将该酶应用于化工、食品、医药等领域，可以在强酸性和高温条件下高效降解淀粉，并能简化工艺、减少环境污染，具有广阔的应用前景。同时本发明使用的这种结合结构预测的合理设计对于提高工业酶的热稳定性具有重要指导意义。
【专利说明】
一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和DNA重组技术，尤其是一种耐酸 性高温淀粉酶的基因、工程菌及其制备方法。
【背景技术】
[0002] α-淀粉酶在工业生产尤其是淀粉深加工中具有极其重要的作用。淀粉深加工通常 包括液化和糖化两个步骤。液化时，将湿淀粉颗粒与酶混匀后l〇5°C蒸汽加热，然后在90°C 水解1-1.5h，液化前将淀粉浆或玉米浆的pH值由自然的pH4.5调到pH5.8-6.2，糖化过程时 再将它降为PH4.2-4.5。而α-淀粉酶的使用受最适温度及最适反应pH局限。在工业上使用的 主要是来源于芽孢杆菌、耐高温放线菌属和高温单胞菌属的淀粉酶。目前工业上应用最 广泛的α-淀粉酶为来自地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶(BLA)，其作用条件为95°C，ρΗ6.0， 作用过程中需要添加钙离子以保持其活力及热稳定性。由于pH的调节需要添加酸碱，最后 还需要除盐，这些都会增加水蒸气和成本以及伴随pH调整不当而产生的副产物，如果使用 耐酸耐高温的淀粉酶将大大改善这一现状。
[0003] 因此，国内外许多实验室均开展了耐酸性高温α-淀粉酶的研究。早期有1981年摩 尔根从嗜中温地衣芽孢杆菌中分离得到的一种极耐高温的α-淀粉酶，其最适pH为6、最适温 度为90°C，随后即得到广泛的应用。运用基因工程手段构建耐酸性高温α_淀粉酶生产菌是 各国研究者最常用的方法。日本一项专利报道的BLA4480其最适pH为4.0-5.5，最适温度为 90-110°(：。阻也(*丨118〇11等人研究发现81^突变体]\1151'/!1133￥/附885/^209￥(了￥5￥)在?!15.0， 83°C，5mM CaCl2存在的条件下的半衰期是野生型BLA的23倍;DayAG等人在此突变基础上又 添加了两个突变位点S148N和A379S，得到的突变体(TYNSVS)被证明在pH4.85,83°C条件下 半衰期比TYSV提高了2倍。Mischa Machius等人在2003年发表的文章中介绍，在BLA中引入 H133I/N190F/A209V/Q264S/N265Y五个位点突变，使得突变体的失活温度较野生型升高13 。(:并且在85°C的半失活时间较野生型BLA增加32倍。在2003年，Nathalie Declerck等人在 BLA 中引入 H133I/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y 七个位点突变，与野生型相比， 其半失活温度升高了23°C、在85°C失活时间增加了 100倍以上。Manuel Heriberto Rivera 等人发现：引入V286Y单点突变使得突变体水解淀粉的活力较野生型提高5倍。国内也有学 者对耐酸性及耐高温α-淀粉酶开展了研究，但是获得的α-淀粉酶仍不能兼具耐热和耐酸的 特性，不能满足淀粉深加工工业的要求，因此需要开发一种在低pH和高温条件下具有高稳 定性的耐酸性高温α-淀粉酶以满足淀粉工业条件要求。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种耐酸性高温α_淀粉酶的基因、工程菌，具有良好的热稳定性，在 ρΗ4.2-4.6，95°C下保温120min残余活力仍保持在100% ;同时该耐酸性高温α-淀粉酶的表 达量较已知报道中其他耐酸性高温α-淀粉酶高。
[0005] 本发明进一步公开了一种耐酸性高温α-淀粉酶的基因、工程菌的制备方法，满足 淀粉深加工工业需求的耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌的制备。
[0006] 本发明所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶基因，其基因序列见如SEQ no. 1。
[0007] 本发明所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶工程菌，含有如权利要求1所述的耐酸性 高温淀粉酶基因。
[0008] 而且，所述工程菌的宿主细胞为短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
[0009] 而且，所述工程菌为胞外蛋白酶缺失的短小芽孢杆菌Brevibacillus choshinensis sp3
[0010] 而且，所述工程菌中的表达载体为PNY326。
[0011] 本发明所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶，具有权利要求1所述的基因编码的蛋白 序列。
[0012] 而且，所述的耐酸性高温α-淀粉酶在ΡΗ4.2-4.6，95°C条件下具有高的热稳定性。
[0013] 而且，所述的耐酸性高温α-淀粉酶在工程菌中表达量高。
[0014] 本发明所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于:步骤如下：
[0015] 1)出发序列为耐高温α-淀粉酶(BLA)基因；所述BLA基因序列见如SEQ ηο·2;
[0016] 2)根据文献报道的BLA突变位点，构建了五个具有耐酸耐高温特性的BLA突变体：
[0017] BLA-L134R/S320A(简写为 BLA-4480)、
[0018] BLA-M15T/H133Y/L134R/N188S/A209V/S320A(简写为BLA-m6)、
[0019] BLA-M15T/H133Y/L134R/S148N/N188S/A209V/S320A/A379S(简写为 BLA-m8)、
[0020] BLA-H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A(简写为 BLA-m7)、
[0021] BLA-H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A(简写为 BLA-m9)；
[0022] 3)分别对这五个BLA突变体进行表达纯化，测定其在pH4.5条件下的热稳定性；
[0023] 4)利用SWISS-MODEL软件对上述五个BLA突变体及耐高温α-淀粉酶进行结构模 拟，获得其空间结构，对其进行结构分析和动力学模拟分析；
[0024] 5)通过对淀粉酶结构分析、分子动力学模拟分析及热稳定性分析结果，确定构建 耐酸性高温α_淀粉酶基因的突变位点；
[0025] 6)设计突变引物，将BLA基因进行定点突变，突变位点为权利要求10(5)所述位点， 获得耐酸性高温淀粉酶基因；
[0026] 7)将上述耐酸性高温α-淀粉酶基因与表达载体ΡΝΥ326连接、构建获得带有耐酸性 高温淀粉酶基因的重组载体；
[0027] 8)将含有耐酸性高温α_淀粉酶基因的重组载体转化入宿主菌株短小芽孢杆菌中， 构建获得重组菌株；
[0028] 9)将重组菌株进行分泌表达，获得耐酸性高温α-淀粉酶；
[0029] 10)对耐高温α-淀粉酶及耐酸性高温α-淀粉酶的酶学性质和热稳定性进行分析验 证。
[0030] 本发明的积极效果如下：提供了一种新的耐酸性高温α-淀粉酶基因、工程菌及耐 酸性高温α-淀粉酶，该耐酸性高温α-淀粉酶在ΡΗ4.2-4.6、95°C条件下较文献报道的突变体 热稳定性增强，并且表达量是现有耐酸性高温α-淀粉酶的50倍，将该酶应用于化工、食品、 医药等领域，可以在强酸性和高温条件下高效降解淀粉，并能简化工艺、减少环境污染，具 有广阔的应用前景。同时本发明使用的这种结合结构预测的合理设计对于提高工业酶的热 稳定性具有重要指导意义。
【附图说明】
[0031] 图1:ρΝΥ326载体质粒图谱；
[0032]图2 :BLA的3D空间结构及突变位点示意图；
[0033]图3:突变前后，淀粉酶热稳定性变化趋势。
【具体实施方式】
[0034]为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而 非对本发明的任何形式的限制。
[0035] 实施例1:
[0036]耐酸性高温α-淀粉酶基因的构建 [0037] 1、BLA突变体的构建
[0038]根据文献报道的BLA突变位点，设计相应的定点突变引物(表1 )，以BLA为出发序 列，采用全质粒PCR的方法构建五个BLA突变体，将这五种突变体在同一表达载体。同一宿 主细胞中进行表达，获得五种突变耐酸性高温淀粉酶；
[0039] 2、BLA突变体的酶学性质测定及分析
[0040] 根据酶学性质分析发现，BLA_m9和BLA_m6在ρΗ4.5的条件下热稳定性最好，BLA_m9 在pH4.0-5.0的范围内具有较高比活力，耐酸性好；
[00411 3、BLA突变体的结构分析
[0042] 通过SWISS-MODEL对BLA的五个突变体进行同源建模，构建了 BLA-4480、BLA-m6、 BLA-m7、BLA-m8、BLA-m9的模型，BLA的三级结构以及选择的突变位点如图2所示。将两个最 优稳定性的突变体的突变位点进行组很可能产生协同作用从而获得酸性条件下热稳定性 最佳的突变体，分别构建突变体BLA-m9-M15T、BLA-m9-N188S和BLA-m9-M15T/N188S的结构 模型，发现三个突变体的分子内氢键总数较BLA-m9都有所增加，这预示着蛋白整体稳定性 的提高;分子动力学模拟结果显示BLA-m9-M15T在300K和370K的RMSD差值较BLA-m9小，同样 预示着其在高温下的结构稳定性；
[0043] 4、耐酸性高温α-淀粉酶的突变位点的确立
[0044] 通过对BLA突变体的结构分析结合pH4.5、95°C条件下的热稳定性分析，确定了以 BLA-m9为模板的耐酸性高温α-淀粉酶的两个突变位点M15T和N188S(突变组合BLA-M15T/ H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A、BLA-H133I/L134R/H156Y/ A181T/N188S/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A和BLA-M15T/H133I/L134R/H156Y/A181T/ N188S/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A)；
[0045] 5、耐酸性高温α-淀粉酶基因的构建
[0046] 根据确定的耐酸性高温α-淀粉酶的突变位点，根据BLA-m9的基因序列，设计相应 的定点突变引物(表1);
[0047] 采用pfu酶利用全质粒PCR的方法对BLA-m9进行突变，获得BLA-m9-M15T，BLA-m9- N188S，BLA-m9-M15T/N188S三个突变体的PCR产物;将全质粒PCR产物用Dpn I进行模板消 化;将消化掉模板后的全质粒PCR产物，电转入短小芽孢杆菌感受态细胞中，扩培增幅获得 含有耐酸性高温淀粉酶基因的质粒。
[0048] 实施例2:
[0049] 耐酸性高温α-淀粉酶工程菌的制备
[0050] 1.构建重组表达质粒
[00511将突变质粒上的目的片段用Pst I和Hind III进行双酶切，酶切反应体系：10yL质 粒+lyL Pst I+lyL Hind III+10yL buffer+15yL ddH20,反应条件：37°C，3h;将酶切目的 片段用胶回收试剂盒进行纯化回收；
[0052] 将pNY326载体质粒（图1)用Pst I和Hind III进行双酶切和去磷酸化处理，酶切反 应体系：10yL质粒+lyL Pst I+lyL Hind III+10yL buffer+15yL ddH20,反应条件：37°C， 3h; pNY酶切片段用碱性磷酸酶(CIAP)进行磷酸化处理，反应体系：20yL双酶切反应液+2yL CIAP+3yL buffer+5yL ddH20，反应条件：37°C，3h;将磷酸化处理后的pNY酶切片段用胶回 收试剂盒进行纯化回收；
[0053]将胶回收后的目的片段和的PNY326片段进行连接，方法如下：目的片段胶回收产 物3yL、载体胶回收产物2yL、solution I lyL依次混匀，4°C过夜连接；
[0054]将连接产物转化进入短小芽孢杆菌感受态细胞，按下述方法进行操作：
[0055] ①准备100yL感受态细胞与5yL质粒DNA(约100ng)冰浴，将质粒加至感受态中轻柔 混匀;将混合液加入到1mm冰浴预冷的电击杯中，冰浴1 〇min;设置参数1400V、5ms进行电击； [0056] ②电击后迅速转移入lmL MT培养基充分混匀，于30°C，150rpm培养3h;取100yL细 胞培养液涂布于淀粉MTNm平板，剩余培养液5000rpm离心10min后弃掉部分上清，留约100yL 液体重悬后涂布于淀粉MTNm平板;平板37 °C恒温倒置培养过夜；
[0057]③挑取带透明圈的单菌落，获得耐酸性高温α-淀粉酶重组菌株，即为耐酸性高温 α_淀粉酶工程菌。
[0058] 实施例3:
[0059]耐酸性高温α-淀粉酶的制备
[0060] 按照下述方法表达纯化耐酸性高温α-淀粉酶:将耐酸性高温α-淀粉酶重组菌株接 种于20mLMTNm培养基中，37 °C，180rpm恒温振荡培养约12h，至0D600为1.0获得种子液;将种 子液以2%的接种量接种于含2L的TMNm培养基的5L发酵罐中，恒温30°C，转速200rpm培养 72h，通气量为lOvvm;发酵过程中实时监测pH值，自动补充酸碱维持培养液pH值在6.86左 右;培养72h后离心取上清液即为粗酶液;将粗酶液进行纯化制备获得电泳纯的耐酸性高温 α_淀粉酶；
[0061] 表 1
[0062]
[0063]
[0064] 检测例1:
[0065] 实施例3制备的耐酸性高温α-淀粉酶的表达量测定
[0066]同时构建了该耐酸性高温α-淀粉酶与日本专利描述的BLA-4480描述的耐酸性高 温淀粉酶，将二者在同一研究条件下进行表达、纯化，将纯化获得的蛋白适当稀释后用 BCA试剂盒进行蛋白含量测定。该耐酸性高温α-淀粉酶的表达量(2g/L)是日本专利BLA-4480中描述耐酸性高温α-淀粉酶突变体(40mg/L)的50倍。
[0067] 检测例2:
[0068]实施例3制备的耐酸性高温α-淀粉酶酶活力测定 [0069] (1)反应体系：
[0070] 酶反应底物为0.2 %可溶性淀粉，终止反应液为0.5Μ盐酸，显色溶液为稀碘液 (10mM hand 10mM ΚΙ)，吸收波长定位595nm。
[0071] (2)标准曲线绘制：
[0072] 分别取淀粉溶液0、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、5(^1^，1^水补至5(^1^加 入缓冲溶液50yL混匀，放入50°C水浴，同时开始计时；30min后取出加入50yL的0.4M HC1终 止反应;加入50yL稀碘液显色；分别取160yL至96孔板中，用酶标仪在595nm下测吸光度值； 以A595对淀粉毫克数制作标准曲线。
[0073] (3)酶活测定步骤：
[0074] 将纯化后的酶液用缓冲溶液稀释至合适浓度;取稀释酶液50yL，加入淀粉溶液50μ L混匀，放入50°C水浴，同时开始计时；30min后取出加入50yL的0.4Μ HC1终止反应;加入50μ L稀碘液显色;分别取160yL至96孔板中，用酶标仪在595nm下测吸光度值。
[0075] (4)酶活计算
[0076] 酶活力定义:单位时间内单位体积酶液水解淀粉的毫克数定义为一个酶活单位U
[0077] 酶活力U/mL= (A595对照-A595测量)/斜率/30min/0 · 05mL*稀释倍数 [0078]比活力U/mg =酶活/蛋白浓度
[0079] 检测例2:
[0080] 实施例3制备的耐酸性高温α-淀粉酶酶学性质分析
[0081 ] (1)温度对酶活力的影响：
[0082]纯化后的酶液分别用pH为4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠(200mM)缓冲溶液稀释到合适 浓度。在不同温度（40、50、60、70、80、90°〇水浴锅中反应测定酶活力，将最高活力定为 100 %计算相对活力。
[0083] BLA-m9-M15T的最适温度较BLA的50°C升高到70°C。
[0084] (2)pH对酶活力的影响：
[0085] 纯化后的酶液分别用不同？!1(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的柠檬 酸-磷酸氢二钠(200mM)缓冲溶液稀释到合适浓度，在50°C水浴锅中反应测定酶活力，将最 高活力定为100 %计算相对活力。
[0086] BLA的最适pH为7 · 5,而BLA-m9-M15T最适pH降低为4.5。
[0087] (3)pH4.5条件下热稳定性的测定：
[0088]纯化后的酶液分别用pH为4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠(200mM)缓冲溶液稀释到合适 浓度，酶稀释液中加入终浓度为10%的糊精。将稀释后酶液分别放入95°c水浴锅水浴0、5、 10、20、30、40、60、80、100、12011^11，到时间后迅速取出、冰浴，各自测定其残余酶活力。以热 处理Omin为100%，计算相对活力，以相对活力对时间作图。
[0089] 结果如图3所示，耐高温α-淀粉酶BLA在pH4.5，95 °C条件下保温5min剩余16 %的残 余活力，保温120min仅保持1 %的残余活力，BLA-m6和BLA-m9在相同条件下保温120min保持 60%的残余活力；而制备的三个组合突变体中，稳定性最好的组合突变体BLA-M15T/H133I/ L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A 在 pH4.5,95°C 条件下保温 120min 仍 能保持100%的残余活力，另外两个突变体在相同条件下保温120min后能保持大约90%的 剩余活力，达到了在酸性条件下保持高热稳定性的目的，稳定性最好的组合突变体：
[0090] BLA-M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320ASP 为权 利要求书中要保护的耐酸性高温淀粉酶。
[0091] 由此说明，BLA 基因经 M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/ N265Y/S320A位点突变后，构建获得耐酸性高温α-淀粉酶基因，经克隆、酶切、连接到载体 ρΝΥ上，转化入胞外蛋白酶缺失的短小芽孢杆菌中，实现耐酸性高温α-淀粉酶的高分泌表 达，成功制备获得一种耐酸性高温淀粉酶，其在酸性条件下的热稳定性极高，可以满足一 定条件的工业需求。
【主权项】
1. 一种耐酸性高温α-淀粉酶基因，其基因序列如SEQ no. 1。2. 如权利要求1所述的耐酸性高温α-淀粉酶基因的制备方法，其特征在于：以耐高温α-淀粉酶基因为出发序列，进行如下位点突变： M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/ Q264S/N265Y/S320A得到的突变基 因。3. -种耐酸性高温α_淀粉酶的工程菌，其特征在于:含有权利要求1所述的耐酸性高温 淀粉酶基因。4. 如权利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述工程菌的宿主细胞为短小芽孢杆菌或 地衣芽孢杆菌。5. 如权利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述工程菌为胞外蛋白酶缺失的短小芽 fSIf iSl5-Tevibacillus choshinensis6. 如权利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述工程菌中的表达载体为pNY326。7. -种耐酸性高温α-淀粉酶，其特征在于：具有权利要求1所述的基因编码的蛋白序 列。8. 如权利要求7所述的耐酸性高温α-淀粉酶，其特征在于:所述α-淀粉酶在ρΗ4.2-4.6， 95°C条件下具有高的热稳定性。9. 如权利要求7所述的耐酸性高温α-淀粉酶，其特征在于:所述α-淀粉酶在权利要求3 所述的工程菌中表达量高。10. 如权利要求7所述的耐酸性高温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于:步骤如下： 1)出发序列为耐高温淀粉酶基因；其基因序列见如SEQ no.2; 2 )构建了五个耐酸性耐高温的BLA(地衣芽孢杆菌来源的耐高温α-淀粉酶)突变体： BLA-L134R/S320A； BLA-M15T/H133Y/L134R/N188S/A209V/S320A； BLA-M15T/H133Y/L134R/S148N/N188S/A209V/S320A/A379S； BLA-H133I/L134R /H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A； BLA-H133I/L134R /H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A； 3) 分别对这五个BLA突变体进行表达纯化，测定其在ρΗ4.5条件下的热稳定性； 4) 利用SWISS-MODEL软件对上述五个BLA突变体及耐高温α-淀粉酶进行结构模拟，获得 其空间结构，对其进行结构分析和动力学模拟分析； 5) 通过对淀粉酶结构分析、分子动力学模拟分析及热稳定性分析结果，确定构建耐酸 性高温α-淀粉酶基因的突变位点； 6) 设计突变引物见表1，将BLA基因进行定点突变，突变位点步骤5)所述位点，获得耐酸 性高温α-淀粉酶基因； 7) 将上述耐酸性高温α-淀粉酶基因与表达载体ΡΝΥ326连接、构建获得带有耐酸性高温 α_淀粉酶基因的重组载体； 8) 将含有耐酸性高温α-淀粉酶基因的重组载体转化入宿主菌株短小芽孢杆菌中，构建 获得重组菌株； 9 )将重组菌株进行分泌表达，获得耐酸性高温α-淀粉酶。
【文档编号】C12N1/21GK106086048SQ201610670173
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月16日 公开号201610670173.3, CN 106086048 A, CN 106086048A, CN 201610670173, CN-A-106086048, CN106086048 A, CN106086048A, CN201610670173, CN201610670173.3
【发明人】谢秋宏, 师瑞琳, 相宏宇, 刘玲
【申请人】吉林大学