一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法。所述筛选毕赤酵母启动子的系统包括毕赤酵母菌株和质粒载体，所述的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C?末端ω肽；所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶N?末端α肽的核苷酸序列；所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID NO：5。本发明的有益效果如下：本发明筛选毕赤酵母启动子的系统在培养平板通过筛查蓝色毕赤酵母菌落就可以很方便的筛选到启动子序列。由于采用平板上直接观察颜色的方法进行筛选，因此，该方法除简便外，还非常高效。
【专利说明】
一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方 法。
【背景技术】
[0002] 巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统由于其具有高表达、低成本、遗传操 作简单、表达外源蛋白能进行有限的加工修饰等优点，现已经成为重要的外源蛋白表达系 统，特别是在表达真核生物蛋白上显示出了极其诱人的应用前景。外源基因在毕赤酵母中 表达首先需要启动子驱动基因的转录。目前在毕赤酵母中广泛使用的驱动外源基因表达的 启动子为A0X1和GAP启动子。如要在毕赤酵母中同时表达多个外源蛋白，显然可供选择的启 动子数很少。目前研究已涉及将宿主细胞作为微工厂生产有应用价值的代谢产物，这要求 将整个代谢途径中的所有酶都在宿主细胞中表达，因此需要多个不同的启动子来驱动不同 基因的表达。就表达一种蛋白而言，Α0Χ1和GAP启动子也各自有其缺点:GAP启动子为组成型 启动子，不利于表达对毕赤酵母细胞有毒害的蛋白；A0X1启动子为诱导型启动子，但其诱导 剂为甲醇。在生产外源蛋白时如有甲醇残留，将会对人体产生毒害。另外，甲醇为易燃易爆 物品，对生产也有一定的安全隐患。因此，急需建立一种有效的方法分离和鉴定更多的毕赤 酵母启动子，以期使外源基因在毕赤酵母中表达选择启动子时具有更多的灵活性，并且可 以使毕赤酵母同时利用不同的启动子表达多个外源基因。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供共一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法。
[0004] 本发明提供的技术方案为：提供一种筛选毕赤酵母启动子的系统，包括毕赤酵母 菌株和质粒载体，所述的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C-末端ω肽，所述的β半乳糖苷 酶C-末端ω肽序列为SEQ ID Ν0:1;
[0005] 所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶Ν-末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷 酶Ν-末端α肽序列为SEQ ID Ν0:3;
[0006] 所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列 为SEQ ID N0:5,所述Linker DNA序列连接在编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列的 5'端。
[0007] 优选的，上述的筛选毕赤酵母启动子的系统中，编码所述β半乳糖苷酶c-末端ω肽 的核苷酸序列为SEQ ID Ν0:2。
[0008] 优选的，上述的筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，编码所述的β半乳糖苷 酶Ν-末端α肽的核苷酸序列为SEQ ID Ν0:4。
[0009] 本发明提供的另一技术方案为:提供一种利用上述筛选毕赤酵母启动子的系统筛 选毕赤酵母启动子的方法，将待筛选毕赤酵母基因组DNA和所述质粒载体进行酶切后连接， 所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行培养，提取培养后菌体的质粒，将所述质粒导 入所述毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株进行培养至菌落出现，若出现蓝色菌落，则待筛选 毕赤酵母基因组DNA含有启动子活性的基因组DNA片段。
[0010]本发明的有益效果如下：1、本发明筛选毕赤酵母启动子的系统利用β半乳糖苷酶 作为报告蛋白检测毕赤酵母启动子序列，如果有启动子序列存在，将会驱动β半乳糖苷酶基 因的表达。β半乳糖苷酶分解无色底物分子5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)产生 不溶性的蓝色不溶产物。在培养平板通过筛查蓝色毕赤酵母菌落就可以很方便的筛选到启 动子序列。由于采用平板上直接观察颜色的方法进行筛选，因此，该方法除简便外，还非常 高效。2、本发明筛选毕赤酵母启动子的系统中用于筛选毕赤酵母启动子的质粒载体只含有 编码β半乳糖苷酶N-末端α肽序列。由于编码β半乳糖苷酶N-末端α肽序列较小，筛选启动子 的质粒载体可以插入更大的毕赤酵母基因组DNA片段。因此，本发明的另一个优点在于适合 筛选大片段的毕赤酵母启动子序列。
【具体实施方式】
[0011]为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 详予说明。
[0012] 本发明关键构思在于:本发明筛选毕赤酵母启动子的系统利用β半乳糖苷酶作为 报告蛋白检测毕赤酵母启动子序列，如果有启动子序列存在，将会驱动β半乳糖苷酶基因的 表达。β半乳糖苷酶分解无色底物分子5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)产生不溶 性的蓝色不溶产物。在培养平板通过筛查蓝色毕赤酵母菌落就可以很方便的筛选到启动子 序列。由于采用平板上直接观察颜色的方法进行筛选，因此，该方法除简便外，还非常高效。
[0013] 本发明实施例中用到的材料与方法为：
[0014] 所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0015] 分子克隆中所用到的所有工具酶和DNA纯化试剂盒均购自TaKaRa生物公司（大连， 中国），具体反应条件和使用方法参考其商品说明书。
[0016] 商品化质粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ、pPICZ A、pGAPZ B，大肠杆菌ΤορΠ/和毕赤酵母 GS115菌株均购自Invitrogen公司，毕赤酵母具体遗传操作技术参照Invitrogen公司的操 作说明进行。
[0017] 实施例！
[0018] l、pGAPZ B-LacZco 载体的构建
[0019] β半乳糖苷酶C-末端ω肽由该酶的143-1019氨基酸组成。所述的β半乳糖苷酶C-末 端ω肽序列为SEQ ID Ν0:1，编码所述β半乳糖苷酶C-末端ω肽的核苷酸序列为SEQ ID Ν0: 2。设计合成了扩增编码β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列的PCR引物LacZ ω -F1和LacZ ω -R1，以 含有LacZ基因的质粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ为模板，使用高保真Primer Star DNA polymerase进行扩增。PCR反应条件:95°C初始变性5min;94°C变性15s，55°C退火15s，72°C 延伸3min，30个循环，最后72°C延伸lOmiruPCR反应扩增得到一条2900bp的DNA片段。用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒回收该PCR片段。
[0020] LacZ ω-FI：5'-CCGGAATTCACCATGAACTCGGCGTTTCATCTGT-3'(SEQ ID NO：6)
[0021] LacZ ω-R1：5'-CCGGAATTCTATTTTTGACACCAGACCAACTG-3'(SEQ ID NO：7)
[0022] 用限制性内切酶EcoR I分别酶切载体pGAPZ B和PCR的片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒分别进行回收，并对回收后的 DNA片段进行定量。将EcoR I酶切纯化的线性化载体pGAPZ Β和PCR产物进行连接。连接产物 转化大肠杆菌ΤορΠΤ感受态细胞，涂含25μg/ml Zeocin抗菌素的低盐LB平板（1 %蛋白胨； NaCl 0.5 % ; 0.5%酵母浸提物，1.5 %琼脂），37°C培养12-16h。挑选若干在平板上长出的菌 落，用5'A0X1通用引物和LacZco-Rl引物进行PCR鉴定，鉴定重组质粒中插入片段和方向。鉴 定正确的质粒经进一步测序测定确认没有突变后命名为pGAPZ B-LacZco。
[0023] 2、毕赤酵母菌株Gazll5co的构建及其功能
[0024] 1)、用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0质粒提取试剂盒提 取质粒pGAPZ B-LacZco。用Sal I限制性内切酶酶切质粒pGAPZ B-LacZco,使其线性化。酚/ 氯仿抽提、乙醇沉淀回收线性化质粒。取5-1 Oyg线性化的pGAPZ B-LacZc〇质粒加到80yL毕 赤酵母GS115感受态细胞中，混匀。将混有质粒的感受态细胞转入0.2mL的电转杯并置于冰 浴上。通过电转化仪将质粒导入到毕赤酵母GS115细胞中，电转化条件为：1500V，25yF，200 Ω。转化后的毕赤酵母细胞涂抹到MD筛选平板上，于30°C恒温箱中倒置培养2-4d直至菌落 出现。
[0025] MD筛选平板上长出的毕赤酵母用PCR的方法进行进一步确认编码β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列已整合到毕赤酵母的基因组上。具体方法如下：提取MD平板上长出的毕赤酵 母菌落基因组DNA。设计合成了鉴定β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列的PCR引物LacZ ω -F2和 LacZco-R2,以MD平板上长出的毕赤酵母菌落基因组DNA为模板，使用rTaq DNA聚合酶进行 扩增。？〇?反应条件：95°(：初始变性51^11;94°(：变性308,55°(：退火308,72°(：延伸458,30个循 环;最后72°C延伸TmiruPCR反应扩增得到一个600bp的DNA片段。成功整合有编码β半乳糖苷 酶C-末端ω肽序列的毕赤酵母命名为Gazll5c〇。
[0026] LacZco-F2:5，-CGGCGTTTCATCTGTGGTGC-3，（SEQ ID N0:8);
[0027] LacZco-R2:5，-GCCGTTCAGCAGCAGCAGAC-3，（SEQ ID N0:9);
[0028] 2)、毕赤酵母菌株Gazll5 ω的功能测定
[0029] 构建能表达β半乳糖苷酶Ν-末端α肽的表达载体pPICZ A-LacZaj半乳糖苷酶Ν-末 端a肽由该酶的1-142氨基酸组成。所述β半乳糖苷酶Ν-末端a肽序列为SEQ ID Ν0:3,编码β 半乳糖苷酶Ν-末端a肽的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
[0030] 设计合成了扩增编码β半乳糖苷酶N-末端a肽序列的PCR引物LacZa-F和LacZa-R， 以含有LacZ基因的质粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ为模板，使用高保真Primer Star DNA polymerase进行扩增。PCR反应条件:95°C初始变性5min;94°C变性15s，58°C退火15s，72°C 延伸308,30个循环；最后72°(：延伸71^11。？〇?反应扩增得到一个442&?的0嫩片段。用了31^1^ MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒回收该PCR片段。
[0031] LacZa-F:5，-CCGGAATTCACCATGATAGATCCCGTCG-3，（SEQ ID N0:10);
[0032] LacZa-R:5，-CGGAATTCTTAAACGCCATCAAAAATAATT-3，（SEQ ID NO:11);
[0033] 用限制性内切酶EcoR I分别酶切载体pPICZ A和PCR片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒分别进行回收，并对回收后的 DNA片段进行定量。将EcoR I酶切纯化的线性化载体pPICZ A和PCR产物进行连接。连接产物 转化大肠杆菌ΤορΠΤ感受态细胞，涂含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板，37°C培养12-16h。挑 选若干不平板上长出的菌落，用5'A0X1通用引物和LacZa-R引物进行PCR鉴定，鉴定重组质 粒中插入片段和方向。鉴定正确的质粒经进一步测序测定确认没有突变后命名为pPICZ A- LacZa〇
[0034]用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0质粒提取试剂盒提取 质粒pPICZ A-LacZa。用Sac I限制性内切酶酶切质粒pPICZ A-LacZa，使其线性化，酚/氯仿 抽提、乙醇沉淀回收线性化质粒。取5-10yg线性化的pPICZ A-LacZa质粒加到80yL毕赤酵母 Gaz 115 ω感受态细胞中，混匀。将混有质粒的感受态细胞转入〇 . 2mL的电转杯并置于冰浴 上。通过电转化仪将质粒导入到毕赤酵母6&2115〇细胞中（150(^，25以？，200 0)。转化后的 毕赤酵母细胞涂抹到含320yg/mL X-Gal和100μg/ml Zeocin抗生素的YH)平板上，于30°C恒 温箱中倒置培养2-4d直至菌落出现。在含X-gal的YH)板上长蓝色菌落则表明Gaz 115 ω有功 能。
[0035]实施例2毕赤酵母启动子的筛选
[0036] l、pNP-LacZa 载体的构建
[0037] 用Bgl II和EcoR I双酶切质粒pPICZA，去除pPICZA质粒上的A0X1启动子序列。用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒回收大分子 量质粒DNA片段（即去除A0X1启动子序列质粒片段），并对回收后的DNA片段进行定量。设计 合成了两条寡聚脱氧核苷酸单链Oligo 1和Oligo 2。将Oligo 1和Oligo 2进行退火形成 Linker DNA序列。用于筛选毕赤酵母启动子的质粒载体在含有一段用于毕赤酵母基因组 DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID N0:5,所述的SEQ ID N0:5序列连接在所述的 SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的5'端。退火体系：1μ1 Oligo 1(100μΜ)、1μ1 Oligo 2(100 μΜ)、1μ1 10XT4DNA连接酶缓冲液和7μ1 ddH20。退火参数：95°C5min，然后温度以1-5°C/ min的速度下降到室温。将退火的Linker DNA序列与上述Bglll和EcoR I双酶切回收纯化的 去除了A0X1启动子序列的质粒片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌ΤορΠΤ感受态细胞， 涂含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板，37°C培养12-16h。挑选若干个平板上长出的菌落，进行 测序确认Linker DNA序列成功连接到去除A0X1启动子序列的pPICZA载体上，构建的质粒命 名为pNP。
[0038] 以含有LacZ基因的质粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ为模板，用实施例1中设计合成的PCR 引物LacZa-Fl和LacZa-Rl扩增LacZa片段。使用高保真Primer Star DNA聚合酶进行扩增。 卩〇?反应条件:95°(：初始变性51^11;94°(：变性158,58°(：退火158,72°(：延伸3〇8,30个循环 ;最 后72°C延伸TmiruPCR反应扩增得到一个442bp的DNA片段。TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒回收该PCR片段。
[0039] LacZa-FI：5'-CCGGAATTCACCATGATAGATCCCGTCG-3'(SEQ ID NO：12)；
[0040] LacZa-Rl:5 '-CGGAATTCTTAAACGCCATCAAAAATAATT-3 '（SEQ ID NO:13);
[0041 ] 用限制性内切酶EcoR I分别酶切载体pNP和PCR扩增片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒分别进行回收，并对回收后的 DNA片段进行定量。将EcoR I酶切纯化后的线性化载体pNP和PCR片段进行连接。连接产物转 化大肠杆菌ΤορΠ /感受态细胞，涂含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板，37°C培养12-16h。设计 合成鉴定上游引物KS-F。挑选若干个平板上长出的菌落，用KS-F引物和LacZa-Rl引物进行 PCR鉴定，鉴定重组质粒中插入片段和方向。鉴定正确的质粒经进一步测序确认没有突变后 命名为pNP-LacZa。
[0042] KS-F：5'-CCTCGAGGTCGACGGTATCG-3'(SEQ ID NO：14)；
[0043] 2、毕赤酵母启动子的筛选
[0044] 提取毕赤酵母GS115基因组DNA。用限制性内切酶Bgl II分别酶切质粒pNP-LacZa 和毕赤酵母GS115基因组DNA，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒进行回收纯化，并对回收后的DNA片段进行定量。将酶切后的基因组 DNA和线性化的质粒pNP-LacZa进行连接，连接产物转化大肠杆菌ΤορΠΤ感受态细胞，涂含 25μg/ml Zeocin的低盐LB平板，37°C培养12-16h。用lml的低盐LB液体培养基将平板上长出 的菌落收集。收集到的菌落在含25μg/ml Zeocin的100ml低盐LB液体培养基中37°C培养12-16h。用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0质粒提取试剂盒提取培养 后菌体的质粒。这些重组质粒含有不同毕赤酵母GS115基因组DNA片段的混合物。用限制性 内切酶Pst I或SnaBI酶切线性化质粒，酸/氯仿抽提、乙醇沉淀回收线性化质粒。取5-10yg 线性化的质粒加到80yL毕赤酵母Gazll5co感受态细胞中，混匀。将混有质粒的感受态细胞 转入0.2mL的电转杯并置于冰浴上。通过电转化仪将质粒导入到毕赤酵母Gazl 15 ω细胞中 (1500V，25yF，200 Q )。转化后的毕赤酵母细胞涂抹到含320yg/mL X-Gal和100μΙ/ml Zeocin抗生素的YH)平板上，于30°C恒温箱中倒置培养2-4d直至菌落出现。
[0045]若在含X-gal的YH)板上长蓝色菌落，则表明转化到该菌落的pNP-LacZa质粒上连 接上了含有启动子活性的基因组DNA片段。用引物KS-F对该菌落基因组进行测序，确定具有 启动子活性基因组DNA片段序列。
[0046]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，包括毕赤酵母菌株和质粒载体，所述 的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C-末端ω肽，所述的β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列为 SEQ ID N0：1； 所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷酶N-末端α肽序列为SEQ ID NO:3; 所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID NO:5,所述Linker DNA序列连接在编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列的5'端。2. 根据权利要求1所述的筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，编码所述β半乳糖 苷酶C-末端ω肽的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。3. 根据权利要求1所述的筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，编码所述β半乳糖 苷酶Ν-末端α肽的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。4. 根据权利要求1所述的筛选毕赤酵母启动子的系统筛选毕赤酵母启动子的方法，其 特征在于，将待筛选毕赤酵母基因组DNA和所述质粒载体进行酶切后连接，所得连接产物转 化大肠杆菌感受态细胞，进行培养，提取培养后所得菌体的质粒，将所述质粒导入所述毕赤 酵母菌株，培养毕赤酵母菌株至菌落出现，若出现蓝色菌落，则待筛选毕赤酵母基因组DNA 含有启动子活性的DNA片段。
【文档编号】C12N15/81GK106086060SQ201610414802
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610414802.6, CN 106086060 A, CN 106086060A, CN 201610414802, CN-A-106086060, CN106086060 A, CN106086060A, CN201610414802, CN201610414802.6
【发明人】黄义德, 林尧
【申请人】福建师范大学