一种在有机相中酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种在有机相中酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法，属于食品、生物和化工技术领域。本发明方法以丙酸和香叶醇为原料，脂肪酶为催化剂合成丙酸香叶酯；所述方法，是先使原料在酶的催化下间歇反应，当间歇反应达到稳定后，使原料以一定的流量进入反应器进行连续反应。本发明方法连续反应时间达到初始启动时间的3倍以上，其酯化率依然能达到60％以上，而且在反应的过程中不需要添加脱水剂。
【专利说明】
一种在有机相中酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种在有机相中酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法，属于食品、生物 和化工技术领域。
【背景技术】
[0002] 香叶醇是一种非环单萜醇类化合物，短链脂肪酸的萜烯酯在食品、化妆品以及医 药产业中作为香料和风味化合物有着重要作用，在这些酯中，乙酸、丙酸、丁酸的无环萜烯 醇酯（香叶醇酯、香茅醇酯）最重要。萜烯醇短链脂肪酸酯类是重要的香料成分，已广泛用于 饮食、化妆品领域。丙酸香叶酯具有新鲜而又甜润的果香和玫瑰香气，主要用作薰衣草、香 叶天兰葵、玫瑰、栀子等香精的调和香料。
[0003] 风味酯的合成通常是通过化学合成、从天然物质中提取以及发酵合成的方式获 得。化学合成方法通常需要高温或者高压，不利于一些不稳定底物进行酯化反应，且若这些 酯化产物作为食品添加剂，通常会有残留的化学杂质，获得理想产物的产率较低。生物发酵 合成法的弱点在于发酵产物中酯的浓度和产量都很低。脂肪酶作为一种多用性生物催化 剂，可用于一系列反应中，比如酯化反应，酰胺化作用以及水解反应等，它们在有机溶剂或 者高温等不利条件也具有较好的稳定性。
[0004] 目前市售的产品基本上是化学合成的，反应是在高温、高压下进行，而且产物为复 杂的混合物，要得到高纯度的产品需进行繁杂的分离工作，产品往往具有较深的色泽。利用 脂肪酶作为工业催化剂在有机溶剂中合成酯类物质其反应条件温和，专一性强产率较高， 生产条件安全。另一方面，从生物技术方面看，相比于水相介质，在有机溶剂中水解酶(脂肪 酶、酯酶、蛋白酶)可以有效进行合成反应，使该反应的平衡位置向高产率的合成产物方向 移动，具有很多潜在优势。
[0005] 近年来，国内外一些研究者对短链无环萜烯醇酯的酶法合成工艺研究逐渐增多。 Paroul等人于2010年报道了用脂肪酶催化合成丙酸香叶酯，Nicoletti等人于2014年报道 了将脂肪酶固定化并用于合成丙酸香叶酯的研究，Mohamad等人于2015年尝试将脂肪酶固 定化于碳纳米管上后合成丙酸香叶酯，这些研究均取得良好的效果，但均以间歇方式进行。 到目前为止，尚未有在有机相中利用酶法催化连续合成丙酸香叶酯的报道，
[0006] 连续合成与间歇合成相比具有明显的优势。首先，连续合成的生产效率大大高于 间歇合成;其次，间歇合成时需添加脱水剂以维持酶的微水环境;最后，用固定化酶连续合 成还省去了将酶与反应物分离的操作。因此，连续合成适用于大规模工业化生产。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明设计了一种适合脂肪酶催化连续合成的反应器，并提 供了一种连续合成风味化合物丙酸香叶酯的方法。本发明的方法反应条件温和、反应效率 高，可以实现工业规模生产，优于化学法和间歇生产。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法，所述方法是 以丙酸和香叶醇为原料，脂肪酶为催化剂合成丙酸香叶酯;所述方法，是先使原料在酶的催 化下间歇反应，当间歇反应达到稳定后，使原料以一定的流量进入反应器进行连续反应。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述原料中，香叶醇浓度为10-40mmol/L，香叶醇与 丙酸摩尔比为1:1-4:1。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，香叶醇浓度为20-40mmol/L，香叶醇与丙酸摩尔比为 1:卜2:1〇
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述催化剂的添加量为4-12U/mL。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度30°C-50°C，或者30°C-40°C。
[0013]在本发明的一种实施方式中，所述间歇反应的反应时间为4. Oh以上，可以是4.5h 或者4.5h以上。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述间歇反应的时间为4_6h。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述连续反应的时间达到初始启动时间（以间歇模 式从开始反应到达到稳定酯化率的时间）的3倍以上。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述流量应使物料在反应器内的平均停留时间为4-6h〇
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述反应是以有机溶剂为反应介质。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为异辛烷。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法，具体是:香 叶醇的浓度为10-40mmol/L，香叶醇与丙酸摩尔比为1:1-4:1，加酶量为4-12U/mL，反应温度 30°C-50°C，间歇反应4-6h后原料以一定流量进入反应器进行连续反应，使物料在反应器内 的平均停留时间为4-6h。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法，具体是:反 应器体积为25mL，香叶醇的浓度为30mmol/L，丙酸浓度为20mmol/L，加酶量为9U/mL，反应温 度35°C，间歇反应4.5h后原料以0.10mL/min流量进入反应器进行连续反应。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为固定化酶，固定化酶装载在袋状容器 中，反应底物和溶剂可以进出袋状容器与酶充分反应，而固定化酶不会从袋状容器中流出。 这样的方法方便酶与反应液的分离，而且固定化酶可以重复使用。当然，酶也可以不装载在 袋状容器中或者采用游离酶，可以采用离心或者其他方式将酶与反应液进行分离。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述反应是在连续搅拌式酶反应器中进行。
[0023] 本发明的第二个目的是提供一种连续搅拌式酶反应器，所述反应器包括原料液容 器、控温反应室、快速混合装置、产物容器;控温反应室顶部留有孔，通过进料管道和出料管 道分别与原料液容器、产物容器连接;所述控温反应室内部装载催化剂。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述控温反应室内含有催化剂固载装置，催化剂装 载于催化剂固载装置中。
[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述催化剂固载装置为滤布袋，反应液可以透过滤 布袋与催化剂充分接触、反应，而催化剂被限制于滤布袋中，以实现反应物与催化剂的分 离。
[0026]在本发明的一种实施方式中，所述控温反应室的容积为25mL。
[0027]在本发明的一种实施方式中，所述快速混合装置为磁力搅拌器，控制控温反应室 内的反应液混合。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，所述进料管道上含有进料栗。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，所述出料管道上还连接有在线检测器，以监测反应 物的浓度。
[0030] 在本发明的一种实施方式中，所述出料管道与在线检测器连接的管道上设置有止 水夹。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] (1)本发明采用连续搅拌式酶反应器装置连续合成丙酸香叶酯的方法可以大大提 高产物的产量和反应的效率，而且在反应的过程中不需要添加脱水剂。采用本发明的方法， 连续反应时间达到初始启动时间的3倍以上，其酯化率依然能达到60 %以上。
[0033] (2)本发明方法具有反应条件温和、反应效率高等优点。在生产的工程中，由于反 应体系以有机溶剂为反应介质，生产过程中基本没有微生物的影响，且采用的溶剂为异辛 烧，可在食品工业中运用。
【附图说明】
[0034] 图1为连续搅拌式酶反应器装置。图中A:原料液容器，B产物容器，C:快速混合装 置，D:控温反应室，E:进料栗，F:催化剂，G:止水夹，H:在线检测器。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0036]本发明所用的材料、试剂、仪器和方法，如为特殊说明，均为本领域常规材料、试 剂、仪器和方法，均可通过商业渠道和现有方法获得。
[0037] (1)固定化脂肪酶活力的测定
[0038]以正庚烷为溶剂，分别取1.2mol/L的辛酸和乙醇溶液各0.5mL于5mL离心管中，混 合均匀后加入0.1 Og固定化酶，在35°C水浴摇床中反应30min，振荡速率200r/min，反应结束 后从上清液中取IOOyU反应液中加入IOOyL己醇为内标，用气相色谱检测生成的辛酸乙酯。 [0039]脂肪酶活单位定义:在35°C下，Imin内生成Ιμπιο?辛酸乙酯的酶量定义为一个酶活 单位(U)。
[0040] (2)丙酸香叶酯的分析检测
[00411 每隔一段时间收集一定量的流出液，8000r/min离心5min。取IOOyL收集液和相同 体积的正己醇作为内标。
[0042] 产物酯采用的气相色谱条件为：岛津GC-2014色谱仪，色谱柱为DB-Wax(30mX 0.25mm)，载气为N2,程序升温条件为100°C保留lmin，10°C/min升温至220°C保留lOmin。柱 流量1.15mL/min，分流比30:1，检测器温度260°C。进样体积lyL。
[0043] (3)酯化率的测定：
[0044] 酯化率（％ )=测得的丙酸香叶酯含量/完全酯化的丙酸香叶酯含量X 100%
[0045] 实施例1:连续搅拌式酶反应器
[0046] 本发明的连续搅拌式酶反应器，如图1所示。其主体由原料液容器(A)、产物容器 (B)、快速混合装置(C)、控温反应室(D)，进料栗(E)，催化剂固载装置(F)，止水夹(G)，在线 检测器(H)组成，其中控温反应室(D)顶部留有进、出管道链接原料液容器(A)和产物容器 (B)，内部可装载催化剂，以实现反应物与催化剂的分离。
[0047] 可选地，所述催化剂固载装置为滤布袋，反应液可以透过滤布袋与催化剂充分接 触、反应，而催化剂被限制于滤布袋中，以实现反应物与催化剂的分离。
[0048] 控温反应室，外部有恒温水浴控制反应体系水温。原料液通过进料栗进入控温反 应室中。反应体系可充满整个控温反应室，这样从进料管道进入的原料液体积与出料管道 流出的反应液体积相等。也可以在出料管道上设置出料栗，并控制出料速度与进料速度一 致。
[0049] 实施例2:连续生产工艺流程优化
[0050] 利用连续搅拌式酶反应器，以丙酸和香叶醇为原料，脂肪酶为催化剂合成丙酸香 叶酯。
[0051] 脂肪酶催化合成丙酸香叶酯的连续合成方法，本发明研究了底物摩尔比、脂肪酶 添加量、温度、流量对酯化率的影响。
[0052]连续搅拌式酶反应器的设计（图1):控温反应器的容积为25mL，将脂肪酶置于其 中，通过磁力搅拌器不断搅拌反应液，外部有恒温水浴控制反应体系水温，丙酸香叶醇反应 体系通过恒流栗进入反应器中，同时收集反应流出液。
[0053] (1)香叶醇浓度的确定:在该反应中，丙酸的反应浓度为20mmol/L，考察了香叶醇 浓度分别为20，30，40，50，60，70，80mmol/L时对酯化率的影响。结果发现当随着香叶醇浓度 增大，酯化率也相应增大，但继续增大香叶醇浓度时，反而使得酯化率下降，当反应体系中 香叶醇浓度为30mmol/L时有最大酯化率，达到70%。
[0054] (2)脂肪酶添加量的确定:该脂肪酶为固定化脂肪酶，当酶的添加量增加时，酯化 率提尚；而当添加量大于9U/mL时，酯化率不再明显提尚，综合考虑酶的价钱和催化效率考 虑，脂肪酶添加量可选用9U/mL。
[0055] (3)平均停留时间的确定:若平均停留时间太短，原料尚未充分反应，酯化率低，延 长平均停留时间会使原料反应更加充分，产物酯化率逐渐增大，当平均停留时间达到某一 值时，酯化率不再增高。实验结果表明当平均停留时间低于4h时，反应液中的丙酸香叶酯酯 化率下降，因而平均停留时间确定为4h，此时酯化率可达到70 %酯化率。
[0056] 优化后的丙酸香叶酯的连续合成方法：反应器体积为25mL，香叶醇的浓度为 30mmol/L，丙酸浓度为20mmol/L，加酶量为9U/mL，反应温度35°C，间歇反应4.5h后，原料以 0.10mL/min流量进入反应器，丙酸香叶酯的酯化率能连续12h维持在70%以上。
[0057] 实施例3
[0058] 反应体系的体积为25mL，原料液中丙酸浓度20mmol/L，香叶醇浓度20mmol/L，溶剂 为异辛烷，脂肪酶9U/mL，反应温度35°C，间歇反应4.5h后，原料以0. lOmL/min的流量进入反 应器中，连续反应12h。丙酸香叶酯的酯化率见表1。
[0059]表1不同连续反应时间下丙酸香叶酯的酯化率
[0061 ] 实施例4
[0062] 反应体系的体积为25mL，原料液中丙酸浓度20mmol/L，香叶醇浓度30mmol/L，溶剂 为异辛烷，脂肪酶9U/mL，反应温度35°C，间歇反应4.5h后，原料以0. lOmL/min的流量进入反 应器中，连续反应12h。丙酸香叶酯的酯化率见表2。
[0063] 表2不同连续反应时间下丙酸香叶酯的酯化率
[0065] 实施例5
[0066] 反应体系的体积为25mL，原料液中丙酸浓度20mmol/L，香叶醇浓度30mmol/L，溶剂 为异辛烷，脂肪酶6U/mL，反应温度35°C，间歇反应4.5h后，原料以O. lOmL/min的流量进入反 应器中，连续反应12h。丙酸香叶酯的酯化率见表3。
[0067]表3不同连续反应时间下丙酸香叶酯的酯化率
[0069] 实施例6
[0070] 反应体系的体积为25mL，原料液中丙酸浓度20mmol/L，香叶醇浓度40mmol/L，溶剂 为异辛烷，脂肪酶9U/mL，间歇反应4.5h后，反应温度40°C，原料以O. lOmL/min的流量进入反 应器中，连续反应12h。丙酸香叶酯的酯化率见表4。
[0071 ]表4不同连续反应时间下丙酸香叶酯的酯化率
[0073]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种酶催化连续合成丙酸香叶酯的方法，其特征在于，所述方法是以丙酸和香叶醇 为原料，脂肪酶为催化剂合成丙酸香叶酯;所述方法，是先使原料在酶的催化下间歇反应， 当间歇反应达到稳定后，使原料以一定的流量进入反应器进行连续反应。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料中香叶醇浓度为10_40mmol/L，香 叶醇与丙酸摩尔比为1:1-4:1。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化剂的添加量为4-12U/mL。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的温度30°C-50°C。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流量应保证物料在反应器内的平均停 留时间为4_6h。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间歇反应的时间为4h以上。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：香叶醇的浓度为10-40mmol/L，香叶醇与丙酸摩尔比为1:1-4:1，加酶量为4-12U/mL，反应温度30°C_50°C，间歇 反应4-6h后原料以一定流量进入反应器进行连续反应，使物料在反应器内的平均停留时间 达到4-6h;所述方法的酯化率达到60%以上，且酶能够连续20小时以上维持活力。8. 根据权利要求1-7任一所述方法得到的丙酸香叶酯。9. 一种连续搅拌式酶反应器，其特征在于，所述反应器包括原料液容器、控温反应室、 快速混合装置、产物容器;控温反应室顶部留有孔，通过进料管道和出料管道分别与原料液 容器、产物容器连接;所述控温反应室内部装载催化剂。10. 根据权利要求9所述的反应器，其特征在于，所述控温反应室内含有催化剂固载装 置，催化剂装载于催化剂固载装置中。
【文档编号】C12M1/40GK106086094SQ201610428116
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】冯骉, 唐静, 缪铭, 王璐
【申请人】江南大学