一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法
【专利摘要】一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱性胰蛋白酶进行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS）法确定最佳酶解时间，利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽。
【专利说明】
一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 慢性炎症参与人体多种疾病的发生发展，是多种疾病的致病基础。从细菌感染引 起的结核性胸膜炎、病毒感染引发的慢性乙肝，到自身免疫性的类风湿性关节炎，以及哮 喘、动脉粥样硬化等慢性疾病，都与慢性炎症息息相关。目前，临床上针对炎症的治疗药物 主要包括留体类和非留体类两种。留体类药物主要通过稳定溶酶体膜，抑制白细胞游走而 产生效果。长期服用留体类抗炎药可使人体产生激素依赖性，甚至会产生免疫抑制、影响全 身代谢的副作用。非留体类抗炎药主要通过阻断花生四烯酸形成前列腺素而发挥作用，从 而对肾及胃肠粘膜具有一定的损伤作用。长期服用抗炎症药物不仅对人体健康产生一定影 响，还需要较大的经济投入。因此，以食物为研究对象，制备出一种对人体健康无害，且价格 较为合理的抗炎症产品前景广阔。 牡蛎是世界第一大养殖贝类，其营养价值极高，具有"海中牛奶"的美誉，是我国首批列 为药食同源的保健疗效食品之一。牡蛎的蛋白质含量高达50%，而且还含有大量的氨基酸， 糖原，牛磺酸和活性微量元素，药用价值极高。研究表明，牡蛎还具有降血糖，降血脂，抗疲 劳，保肝，抗癌，抗氧化，降血压，增强免疫功能，保护血管内皮细胞等强大的生物活性功能。 近年来，针对牡蛎酶解液分离制备抗炎症活性肽也正逐步受到学者的关注。 生物活性肽在完整蛋白分子中并不显示其生物活性，只有将生物活性肽从蛋白大分 子中释放出来方可体现其生物活性功能。目前制备生物活性肽采用较多的方法为酶解法。 而对牡蛎的酶解情况，相关研究的水解酶普遍采用的是动物源的酸性胃蛋白酶与碱性胰 蛋白酶；同时牡蛎中抗氧化、降血压活性肽的制备也有研究。本发明则是以三硝基苯磺酸 (TNBS)法对牡蛎的胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液进行测定从而确定最佳酶解时间。根据文 献中关于疏水性活性肽与抗氧化活性肽的关联性，以及活性肽抗氧化水平与其抗炎症能力 的关联性，利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离。通过测定 活性肽的抗氧化能力，推测活性肽组分的抗炎症特性，从而制备一种牡蛎源的抗炎症肽。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，克服现有药物在抗炎症 方面的缺陷以及生物活性肽在制备方面的不足。 本发明的技术方案为：以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱性胰蛋白酶进 行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS)法确定最佳酶解时间，利用大孔树脂DA201-C按 照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽。 其特征工艺步骤为： (A) 去壳干制牡蛎40°C热风干燥，打磨粉碎后过80目标准筛。 (B) TNBS法测定水解度：取0. 25 mL样品或标准品于用锡箱纸包裹的离心管中；加入2 mL磷酸缓冲液，混匀，于暗室加2 mL TNBS溶液；50°C，90rpm水浴振荡I h ;加入0. 1%盐酸 4 mL，混勾，冷却至室温，静置30 min;每管取0.3 mL加入96孔板，以去离子水作空白对照， 测340 nm吸光值，计算酶解液水解度。 (C)大孔树脂吸附层析： (1) 大孔树脂预处理 95%乙醇对大孔树脂浸泡24 h ;无水乙醇对树脂颗粒冲洗数遍后加入到玻璃层析柱 中，顶空距离为12 cm ;分别以无水乙醇和去离子水洗柱；用3%的盐酸洗柱，待流出液pH约 为1时关闭，盐酸浸泡3 h后继续用3%的盐酸洗柱；去离子水洗柱至中性；用3%的氢氧化 钠洗柱，待流出液PH达约12时关闭，浸泡3 h后继续以氢氧化钠洗柱；去离子水洗柱至中 性；分别用乙醇和去离子水洗柱待用。 (2) 样品吸附层析分离 用pH=2的磷酸缓冲液对柱子酸化；加入适量酶解液样品，吸附约I. 5 h ;以pH=2的磷 酸缓冲液洗柱后对蛋白检测仪进行调零；分别用20%乙醇，40%乙醇和60%乙醇洗脱，并收 集洗脱峰；分别以无水乙醇和去离子水洗柱；对收集样品测220 nm吸光值，以无水乙醇为 对照。 本发明的优点是：本发明是通过TNBS法测定胃蛋白酶，胰蛋白酶及混合酶解液的水解 度，选择4 h作为两种酶的酶解时间；利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液 进行肽组分分离，对收集到的样品进行冷冻干燥后可得到胃蛋白酶20%乙醇浓度洗涤样品 (PEP-I)、40%乙醇浓度洗涤样品（PEP-2)、胰蛋白酶40%乙醇浓度洗涤样品（TRYP-2)及混 合酶40%乙醇浓度洗涤样品四种抗炎症肽(其中胰蛋白酶和混合酶在20%乙醇浓度收集到 的样品（TRYP-1，MIX-1)冷冻干燥后呈粘稠状，难分离则弃舍)。
【附图说明】
[0004] 图1为具体实施方案中肽组分细胞毒性的测定结果。PEP-1-1，I mg/mL的PEP-I ; PEP-1-0. 6,0· 6 mg/mL 的 PEP-I ; PEP-1-0. 2,0· 2 mg/mL 的 PEP-I; PEP-2-1，I mg/mL 的 PEP-2 ; PEP-2-0. 6,0· 6 mg/mL 的 ΡΕΡ-2 ;ΡΕΡ-2-0· 2,0· 2 mg/mL 的 PEP-2; TRYP-2-1，1 mg/mL 的 TRYP-2; TRYP-2-0. 6,0· 6 mg/mL 的 TRYP-2; TRYP-2-0. 2,0· 2 mg/mL 的 TRYP-2 ; MIX-2-l，l mg/mL 的 MIX-2; ΜΙΧ-2-0·6,0·6 mg/mL 的 MIX-2; ΜΙΧ-2-0·2,0·2 mg/mL 的 MIX-2. 图2为具体实施方案中肽组分对细胞因子TNF-α的影响。PEP-1-0. 6,0.6 mg/mL的 PEP-I ; PEP-1-0. 2,0· 2 mg/mL 的 PEP-I; PEP-2-0. 6,0· 6 mg/mL 的 ΡΕΡ-2 ;ΡΕΡ-2-0· 2,0· 2 mg/mL 的 ΡΕΡ-2; TRYP-2-0. 6,0· 6 mg/mL 的 TRYP-2; TRYP-2-0. 2,0· 2 mg/mL 的 TRYP-2 ; MIX-2-0. 6,0. 6 mg/mL 的 MIX-2 ; MIX-2-0. 2,0. 2 mg/mL 的 MIX-2. 图3为具体实施方案中肽组分对细胞因子TGF-β I的影响。PEP-1-0. 6,0. 6 mg/mL的 PEP-I ;ΡΕΡ-2-0· 6,0· 6 mg/mL 的 PEP-2 ;TRYP-2-0. 2,0· 2 mg/mL 的 TRYP-2 ;ΜΙΧ-2-0· 2,0· 2 mg/mL 的 ΜΙΧ-2.
【具体实施方式】
[0005] 实施例：细胞毒性与抗炎症实验 (1) 巨噬细胞毒性测定 (a) 溶液配制及样品准备 分别对四种肽组分样品配制三个浓度：1 mg/mL，0. 6 mg/mL和0. 2 mg/mL。 (b) 取96孔板，加入100 μ L完全培养液，按表1所不进行加样后密封，培养24 h ;样 品组、对照组、空白组分别加入10 yL不同样品和磷酸缓冲液，孵育24 h后，向培养基中加 入10 μ L的Cell Counting Kit (CCK试剂盒）溶液；孵育4 h后测450 nm波长下的吸光 值，并计算细胞活力。 表1细胞毒性测试设W (2) 抗炎实验样品制奇
将PEP-1，PEP-2, TRYP-2, MIX-2四种肽组分配制成浓度为6 mg/mL，2 mg/mL的样品； 在24孔板加入0. 6 mL细胞培养液后置于CO2细胞培养箱中培养24 h，移去细胞培养液后 再加入0. 6 mL细胞培养液，随后分别加入60 μ L样品、磷酸缓冲液、终浓度为10 ng/mL的 脂多糖，密封后于CO2培养箱培养24 h ;加入60 μ L终浓度为10 ng/mL的脂多糖溶液进行 刺激后培养6 h ;收集上清液以1000 Orpm转速离心10 min后储存于4°C冰箱待用；细胞沉 淀以4000rpm离心I min后弃上清液，储存于-80°C冰箱待用。 ⑶细胞因子TNF-α (a) 溶液配制 TNF-α 标准曲线：1000 pg/mL，500 pg/mL，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.25 pg/mL，15. 625 pg/mL共7个浓度梯度 洗液：PBS溶液，加入0· 05%吐温-20 样品：将 PEP-1，PEP-2, TRYP-2, MIX-2 四种肽组分配制成 0· 6 mg/mL，0. 2 mg/mL (b) 取96孔板，加入100 μ L捕捉抗体后密封，置于4°C冰箱过夜；倒掉液体，洗液洗涤 3次后吹干；加入200 yL稀释缓冲液，室温放置I h;洗液洗涤后，样品组、空白组、标准品 组分别加入100 yL药品、稀释缓冲液、TNF-a标准液，密封后于4°C冰箱放置过夜；倒掉 液体，以洗液洗涤3次后吹干；加入100 μ L检测抗体，密封后室温孵育I h ;洗涤3次后加 入100 μ L蛋白酶溶液，密封后室温放置30 min ;洗涤后再加入100 μ L显色液，密封后室 温孵育15 min ;加入50 μ L终止液；测450 nm，570 nm吸光值。 ⑷细胞因子TGF-β 1 (a) 采用RNeasy Mini Kit试剂盒提取RNA 取离心后的细胞沉淀，分别加入350 μ L RLT缓冲液和等体积70%乙醇；将样品和沉 淀转移至GenClean柱中，8000rpm离心15 s后弃废液；分别加700 yLRWl和500 yLRPE 缓冲液，并8000rpm离心15 s后弃废液；加入30至50 μ L DEPC处理水，8000rpm下离心1 min〇 (b) RNA反转录 按照Microtube使用说明进行 (c) real time-PCR分析TGF-β 1的转录水平 引物设计：GADPH 引物序列为（Forward :5' -CCATGGAGAAGGCTGGG-3'，Reverse : 5' -CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'）JGF-GF 的引物序列为 TGF-列为（Forward: 5' -GGCGATACCTCAGCAACCG-33, Reverse: 5' -CTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'） 反应体系：ddH20 6.2 yL;MIX 10 yL;Primer-F 0.4 yL;Primer-R 0.4 yL;Tem 3 μ L ;终体积20 μ L。 反应条件：95°C预变性5 min，随后95°C变性5 s，57°C褪火30 s，40个反应循环。随 后，95°C变性15 s，60 - 95°C变性5 s，95°C灭活酶活性。 细胞毒性实验结果分析： 细胞活力计算公式： 细胞活戈
按照细胞活力计算公式对四种肽组分的数据进行处理，其中每个肽组分设置了 I mg/ mL、0.6 mg/mL、0. 2 mg/mL三个浓度，各肽组分浓度下细胞活力值见表2。 根据实验结果，四个肽组分的每个浓度的肽组分细胞活力都达到100%以上，对巨噬细 胞均无细胞毒性作用，且对细胞增殖具有一定的促进作用。结果表明，较低浓度0.6 mg/mL 和0. 2 mg/mL在抗炎症分析中效果更佳。 圭 9 H-fr 4? /xm ^ ? '/Ι??ιΙ
注：不同字母表示显著性差异（P〈〇. 05) 肽组分对细胞因子TNF-α的影响结果分析： 按照细胞毒性实验结果，对ΡΕΡ-1、PEP-2、TRYP-2、ΜΙΧ-2四种肽组分分别测定肽浓度 为0. 6 mg/mL，0. 2 mg/mL两个浓度对细胞因子进行测定，对TNF-α的测定结果如表3所示。 表3肽组分对细胞因子TNF-a的影响
注：不同字母表示显著性差异（P〈〇. 05) 结果表明，四种肽组分均具有一定的抗炎症效果，但总平均疏水指数和抗氧化活性较 小的PEP-I对促炎症因子的抑制作用效果更明显。 从对TNF- a细胞因子的抗炎症效果来看，当肽浓度为〇. 2 mg/mL时，胰蛋白酶〉混合 酶〉胃蛋白酶。而当肽浓度为〇. 6 mg/mL时，胃蛋白酶〉混合酶〉胰蛋白酶，故浓度对活性 肽抗炎症效果存在较大影响。 肽组分对细胞因子TGF-β 1的影响结果分析： 根据四种肽组分对细胞因子TNF- a表达的影响结果，对ΡΕΡ-1、PEP-2、TRYP-2、ΜΙΧ-2 四种肽组分分别选用0. 6 mg/mL和0. 2 mg/mL刺激的细胞进行转化生长因子TGF-β 1的 转录水平分析。 实验结果表明，肽组分的溶剂磷酸缓冲液PBS对巨噬细胞具有一定的刺激性；四种肽 组分均可促进抗炎症因子TGF-β 1分泌增加，具有抗炎症的效果。对于胃蛋白酶肽组分而 言，在0. 6 mg/mL浓度时，PEP-I肽组分较PEP-2具有更好的抗炎症效果，且抗炎症效果最 好的为胃蛋白酶酶解肽组分，这与细胞因子TNF- a的测定结果相一致。
【主权项】
1. 一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱 性胰蛋白酶进行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS)法确定最佳酶解时间，利用大孔树 脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽；其特 征在于：去壳干制牡蛎热风干燥，打磨粉碎后过标准筛、用TNBS法测定水解度、大孔树脂吸 附层析分离、将层析收集到的样品进行冷冻干燥后可得到四种抗炎症肽。2. 根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：去壳干制牡 蛎30~50°C热风干燥，打磨粉碎后过60~200目标准筛。3. 根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：TNBS法测定 水解度：取〇. 25 mL样品或标准品于用锡箱纸包裹的离心管中；加入2 mL磷酸缓冲液，混 匀，于暗室加2 mL TNBS溶液；40~60°C，60~120rpm水浴振荡0. 5~2 h ;加入0. 1%盐 酸4 mL，混勾，冷却至室温，静置10~60 min ;每管取0. 3 mL加入96孔板，以去离子水作 空白对照，测340 nm吸光值，计算酶解液水解度，确定两种酶的酶解时间为4h。4. 根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：大孔树脂吸 附层析，其中大孔树脂预处理：95%乙醇对DA201-C大孔树脂浸泡12~36 h ;无水乙醇对 树脂颗粒冲洗数遍后加入到玻璃层析柱中，顶空距离为12 cm ;分别以无水乙醇和去离子水 洗柱；用3%的盐酸洗柱，待流出液pH约为1~2时关闭，盐酸浸泡2~4 h后继续用3%的 盐酸洗柱；去离子水洗柱至中性；用3%的氢氧化钠洗柱，待流出液pH达约12时关闭，浸泡 2~4 h后继续以氢氧化钠洗柱；去离子水洗柱至中性；分别用乙醇和去离子水洗柱待用。5. 根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：样品吸附层 析分离，用pH=2的磷酸缓冲液对柱子酸化；加入适量酶解液样品，吸附约1~3 h ;以pH=2 的磷酸缓冲液洗柱后对蛋白检测仪进行调零；分别用20%乙醇，40%乙醇和60%乙醇洗脱， 并收集洗脱峰；分别以无水乙醇和去离子水洗柱；对收集样品测220 nm吸光值，以无水乙 醇为对照。6. 根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：利用大孔树 脂按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，对收集到的样品进行冷冻干燥后可得到胃 蛋白酶20%乙醇浓度洗涤样品（PEP-1)、40%乙醇浓度洗涤样品（PEP-2)、胰蛋白酶40%乙醇 浓度洗涤样品（TRYP-2)及混合酶40%乙醇浓度洗涤样品四种抗炎症肽。
【文档编号】C12P21/06GK106086127SQ201510205933
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2015年4月28日
【发明人】钱炳俊, 敬璞, 刘小兵, 麦文镇
【申请人】海南椰岛（集团）股份有限公司