室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法
【专利摘要】本发明提供一种室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型，如下式(5)所示，并提供了该预测模型的建立方法。本发明通过模型验证证实该模型能准确、客观、定量的反应室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的生长情况，为草莓风险评估模型研究提供数据基础，有利于草莓的品质控制和风险预警、评估。Ygro＝log10Nt?log10N0＝0.359+0.081×t (5)。
【专利说明】
室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法。
【背景技术】
[0002]鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)为革兰氏阴性肠杆菌，属于沙门氏菌 乙组，能导致多种宿主动物肠道疾病，可以通过被污染的饮用水及食物进入人体，引起腹 泻、呕吐、肠炎等疾病，严重时可致人死亡，其致病机理在于鼠伤寒沙门氏菌进入人体肠道 后，通过入侵小肠上皮细胞及在肠毒素、内毒素的作用下，能够引起肠膜水肿、充血、组织炎 症。沙门氏菌普遍存在动物粪便中，并通过农业设施中的灌溉水、施肥等途径传播。2015年9 月，美国因沙门氏菌污染紧急召回墨西哥进口黄瓜事件再次引起公众对食源性微生物疾病 的关注，该次事件已造成超过285人患病，其中53人入院，1人死亡。2008年美国爆发鼠伤寒 沙门氏菌中毒事件，原因是西红柿污染。2012年2月英国出现西瓜大规模中毒事件，也与沙 门氏菌感染有关[2]。
[0003] 我国草莓种植面积从1985年的0.33万平方公顷增加至2009年的9.01万平方公顷， 总产量达到220.6万吨，占世界总产量的35.7%，是世界草莓生产第一大国[2]。居民草莓消 费量近年来逐渐增加，2007年鲜果消费总量约为177万吨，2009年初步估计已超过200吨，按 13亿人口计算，人均消费量接近1.5kg[3]。然而，成熟后草莓果实娇嫩，含水量达到95%，采 摘、加工、运输、销售过程中极易受机械伤害而渗出汁液，为有害微生物生长提供丰富的营 养物质，常温条件下草莓储藏期仅1-2天[4]。
[0004] 近年来，我国各省市生食果蔬类的沙门氏菌阳性率调查结果显示，果蔬中沙门氏 菌的阳性率平均值为3.38%，个别地区沙门氏菌污染较为严重达到10% [5-8]。虽然我国尚 缺少草莓表面鼠伤寒沙门氏菌污染率和污染水平的相关报道，但施肥、灌溉等过程可能造 成细菌污染，且春季草莓成熟季节较温暖的温度可造成果实表面的细菌增长，对居民健康 造成风险。目前国内鲜见有关草莓表面沙门氏菌的定量风险评估研究，也缺少根据科学研 究结果对消费者家庭环节提出的健康消费指导。
[0005] 预测微生物模型是风险评估的重要数据基础，草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的预测模 型是风险评估中的数据缺陷，因此，本发明对春季室温条件下鼠伤寒沙门氏菌的数量变化 规律进行模型拟合，建立微生物预测方程，为风险评估模型研究提供数据基础。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型及其建立方法，可 以通过模型预测室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的生长情况，模型预测值与实验数据 偏差较小，可较好的拟合细菌生长与时间关系。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] -种室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型的建立方法，所述方法包括以 下步骤：
[0009] (I)鼠伤寒沙门氏菌活化培养，得到细菌培养液
[0010] (2)新鲜草莓用体积分数75 %的酒精浸泡灭菌，灭菌后的草莓浸泡于细菌培养液 中接种；
[0011] (3)接种后的草莓于室温下储藏，测定不同储藏时间下草莓上的菌株数;所述室温 为 22。。；
[0012] (4)将细菌计数后进行对数转换，用式(2)的线性模型进行生长曲线拟合
[0013] Ygr0 = logioNt-logioNo = a+b X t (2)
[0014] 其中，t为室温下储藏时间，单位为小时;Nt(CFU/g)为t时的细菌数，N0(CFU/g)为 样品初始带菌量;Ygro为t时细菌对数值变化量，a，b分别为线性方程待拟合的参数；
[0015] 线性拟合求出a、b。
[0016] 线性拟合求出a、b后，可以得到细菌对数值变化量与时间的关系如下式(5)，即为 室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型
[0017] Ygro = IogioNt-IogioNo = O. 359+0.081 X t (5)
[0018] 进一步，本发明使用鼠伤寒沙门氏菌（Salmone 11 a Typhimur ium)，编号 ATCC14028，由浙江省农业科学院农产品质量标准研究所提供。
[0019] 所述步骤（1)中，鼠伤寒沙门氏菌活化培养的步骤是：鼠伤寒沙门氏菌株保存于 Iml冷冻管中，储存于-80°C冰箱，使用前取出，融化后吸取Iml菌液培养于300mlNB肉汤培养 基中，37 °C条件下震荡培养12h，得到细菌浓度为108CFU/ml的细菌培养液备用。
[0020] 所述步骤(2)中，新鲜草莓用体积分数75%的酒精浸泡灭菌，一般将新鲜无伤口的 草莓浸泡于体积分数75%的酒精溶液中2分钟，以杀灭表面微生物，取出后用无菌水反复冲 洗，直至无酒精味后置于无菌烧杯中备用。
[0021] 所述步骤(2)中，灭菌后的草莓浸泡于细菌培养液中接种，具体步骤一般为:灭菌 后的草莓用细菌培养液浸没浸泡30分钟后将草莓取出置于无菌塑料盘上，于生物安全柜中 静置30分钟，确保菌液接种至草莓表面，得到接种后的草莓。
[0022] 所述步骤(3)中，室温下储藏，本发明选取春季平均室温22°C模拟草莓表面鼠伤寒 沙门氏菌生长过程。
[0023]储藏时间考虑消费者日常储存草莓的平均最长时间，选取72小时为最长时间周 期。
[0024]所述步骤(3)中，测定不同储藏时间下草莓上的菌株数，一般每隔一段时间取出草 莓样品，采用平板计数法计数。
[0025]更具体的，按以下方法进行计数:取出草莓样品后，迅速转移至含有20ml生理盐水 的均质袋中，用拍击式均质器拍打均质袋中的草莓l_2min，制成样品匀液，使用无菌枪头吸 取Iml样品匀液加入9mL生理盐水试管稀释，漩涡混匀后制成1:10的样品匀液，再用生理盐 水稀释2次，分别制成1:100、1:1000的样品匀液，用无菌枪头吸取0.1 mL不同稀释度样品匀 液，分别对应均匀涂布在10-1、10-2、10-3稀释度编号的XLD琼脂平板上，将涂布后的平板平 放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，36 ± 1°C培养24± 2h后计数。 这是本领域技术人员公知的平板计数法。
[0026] -般每个时间点做3个重复实验，取3次实验平均值。
[0027] 本发明所述方法还可以包括以下步骤(5)
[0028] (5)线性拟合求出a、b后，对模型进行验证，进一步，模型验证包括内验和外验，所 述内验采用相关系数(R2)及标准误平方根(RMSE)作为内验结果来验证模型拟合度;所述外 验是利用预测模型预测室温下不同储藏时间下草莓上的菌株数对数值变化量，然后进行验 证实验，将实际测量值与预测值进行比较，利用方程(3)及(4)计算Ross提出的偏差因子Bf 及精确因子Af，用于模型外验结果，以评价模型的准确性。
[0029] (3)
[0030] (4)
[0031] 其中，η为实验组数，pred为线性方程预测得出细菌对数值变化量;ObS为验证试验 中细菌对数值变化量的观测值。Bf用于检验预测的准确度，若Bf>l，表示预测结果大于实际 结果，反之亦然。Af用于检验预测的精确度，即预测值与观测值偏差的绝对值。
[0032] 本研究中细菌的变化量以平均数及标准偏差的形式表示，以Microsoft Excel 20 10(微软公司，雷德蒙，华盛顿州）进行数据处理。本研究以OriginPro 8. 1软件 (OriginLab，北安普敦，马萨诸塞州）中的线性拟合功能对数据进行拟合。
[0033] 本发明还提供室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型，如下式(2)所示：
[0034] Ygro = IogNt-IogNo = 0.359+0.081 X t (2)
[0035] 其中，t为室温下储藏时间，单位为小时，且t小于72小时;Nt(CFlVg)为t时的细菌 数，NO (CFU/g)为样品初始带菌量;Ygro为t时细菌对数值变化量。
[0036] 本发明在建立模型时发现，随时间延长，草莓表面鼠伤寒沙门氏菌总体呈线性规 律增长。对比22°C左右沙门氏菌在果蔬表面的生长规律可以发现，在水分活度和糖分较高 的水果表面，细菌生长速度较快。本发明中利用线性方程拟合细菌对数值变化量(log Nt-IogNO)与时间（t)关系，两者呈现良好的线性关系，模型的校正相关系数R2为0.95,残差平 方和较低，表明模型预测值与实验数据偏差较小，可较好的拟合细菌对数值变化量与时间 关系。
[0037] 利用本发明提供的预测模型预测室温下不同储藏时间下草莓上的菌株数，然后进 行验证实验，将细菌对数值变化量的实际测量值与预测值进行比较，计算得出偏差因子为 0.96,位于Ross提出的可接受范围0.9-1.05内[12]。模型精度因子为1.05,表示预测值与观 测值间仅误差5%。验证实验结果表明本发明的线性方程可用于室温条件下草莓表面鼠伤 寒沙门氏菌对数值变化量的的预测。
[0038] 本发明的有益效果在于:本发明提供了一种室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌 预测模型，并通过模型验证证实该模型能准确、客观、定量的反应室温条件下草莓表面鼠伤 寒沙门氏菌的生长情况，为草莓风险评估模型研究提供数据基础，有利于草莓的品质控制 和风险预警、评估。
【附图说明】
[0039]图1草莓表面鼠伤寒沙门氏菌在室温条件下的生长趋势图。
[0040]图2室温储藏时草莓表面鼠伤寒沙门氏菌对数值变化量随时间变化的线性方程拟 合图。
【具体实施方式】
[0041 ]下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
[0042] 1材料与方法
[0043] (1)菌株和细菌培养
[0044] 本实验使用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium)，编号ATCC14028,由浙江 省农业科学院农产品质量标准研究所提供。
[0045] 菌株保存于Iml冷冻管中，储存于-80°C冰箱，使用前取出，融化后吸取Iml菌液培 养于300mlNB肉汤培养基(购于陆桥技术股份有限公司）中，37°C条件下震荡培养12h，得到 细菌浓度为l〇8CFU/ml的细菌培养液备用。
[0046] (2)样品准备和接种
[0047]新鲜草莓购于附近超市，去除蒂头后逐一称重，选取大小均一的草莓（7 ±0.3g/ 个)进行实验。将草莓浸泡于体积分数75%的酒精溶液中2分钟以杀灭表面微生物，取出后 用无菌水反复冲洗，直至无酒精味后置于无菌烧杯中备用。
[0048]量取200ml细菌培养液倒至放置草莓的烧杯中，浸泡30分钟后将草莓取出置于无 菌塑料盘上，于生物安全柜中静置30分钟以确保菌液接种至草莓表面。
[0049] (3)室温条件储藏
[0050]本实验选取春季平均室温22°C模拟草莓表面鼠伤寒沙门氏菌生长过程，储存时间 考虑消费者日常储存草莓的平均最长时间，选取72小时为周期，每隔8小时取出草莓样品2 个草莓样品为平行试验，分别迅速转移至含有20ml生理盐水的均质袋中。整个实验重复3 次，取3次实验平均值。
[0051 ] (4)微生物分析
[0052]用拍击式均质器拍打均质袋中的草莓l_2min，制成样品匀液，使用无菌枪头吸取 Iml样品匀液加入9mL生理盐水试管稀释，漩涡混匀后制成1:10的样品匀液，再次稀释2次， 制成1:100、1:1000的样品匀液，用无菌枪头吸取0.1 mL不同稀释度样品匀液对号接种在10_ 1、10-2、10-3稀释度编号的XLD琼脂平板上(每个编号设三个重复）。将玻璃涂布棒用酒精灼 烧，冷却后再用玻璃涂布棒将菌液在平板上均匀涂布，从低浓度向高浓度涂布，将涂抹好的 平板平放于桌上20_30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，36 ± TC培养24 ± 2h 后计数。
[0053] (5)模型建立
[0054] 本研究中的细菌模拟生长条件较简单，仅考虑固定温度下的细菌数量变化，因此 可考虑运用常用初级预测模型中的指数方程进行拟合，指数方程对数转换后即为线性方 程。因此，可将细菌计数后进行对数转换，按照线性方程(1)计算细菌对数值变化量(Ygro)
[0055] Ygro = IogNt-IogNo (1)
[0056] 其中，Nt(CFlVg)为t时的细菌数，NO(CFlVg)为样品初始带菌量。
[0057]以线性模型进行生长曲线拟合，如方程(2)所示。
[0058] Ygr0 = logNt-logNo = a+b X t (2)
[0059] 其中，t为细菌培养时间，a，b分别为线性方程参数。
[0060] (6)模型验证
[0061]相关系数(R2)及标准误平方根(RMSE)作为内验结果验证模型拟合度。另外，如方 程(3)及(4)所示，再做4组验证实验结果用于计算Ross提出的偏差因子Bf及精确因子Af，用 于模型外验结果[12]。
[0062] (3)
[0063] (4)
[0064] 其中，η为实验组数，pred为线性方程预测得出细菌对数值变化量;obs为验证试验 中细菌对数值变化量的观测值。Bf用于检验预测的准确度，若Bf>l，表示预测结果大于实际 结果，反之亦然。Af用于检验预测的精确度，即预测值与观测值偏差的绝对值。
[0065] (7)数据分析
[0066] 本研究中细菌的生长量以平均数及标准偏差的形式表示，以Microsoft Excel 20 10(微软公司，雷德蒙，华盛顿州）进行数据处理。本研究以OriginPro 8. 1软件 (OriginLab，北安普敦，马萨诸塞州）中的线性拟合功能对数据进行拟合。
[0067] 2结果与讨论
[0068] (1)室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌的生长规律
[0069]对照试验显示草莓样品初始带菌量约为21og CFU/g。图1为草莓表面鼠伤寒沙门 氏菌在室温储藏条件下的生长曲线图，如图1所示，在72小时储藏时间内细菌增长量约为 61og CFU/g，随时间延长，草莓表面鼠伤寒沙门氏菌总体呈线性规律增长。对比22°C左右沙 门氏菌在果蔬表面的生长规律可以发现，在水分活度和糖分较高的水果表面，细菌生长速 度较快。Vandamm等人[9]研究表面22°C下西芹表面沙门氏菌3天内仅增长21og CFU/g，生长 曲线呈线性趋势。然而，Strawn等人[10]发现芒果切面上沙门氏菌在23°C时，低接种量的样 本呈现线性生长趋势，3天内细菌可增长超过51og CFU/gC3Rezende等人[11 ]同样发现柿子 切面上的沙门氏菌在20°C左右48小内可生长超过51og CFU/g，生长曲线呈缓和的线性趋 势。
[0070] 利用线性方程拟合细菌对数值变化量（log Nt-IogNO)与时间（t)关系，如图2所 示，两者呈现良好的线性关系。方程(5)为线性拟合结果，描述细菌对数值变化量与时间关 系。方差分析结果如表1所示。模型的校正相关系数为0.95,残差平方和较低，表明模型预测 值与实验数据偏差较小，可较好的拟合细菌生长与时间关系。
[0071] Ygro = IogNt-IogNo = 0.359+0.081 X t (5)
[0072]表1生长模型方差分析结果
[0074] (2)模型验证
[0075]同样条件下再做4组验证，将细菌对数值变化量的预测值与实际观测值比较，实验 结果如表2所示。计算得出偏差因子为0.96,位于Ross提出的可接受范围0.9-1.05内[12]。 模型精度因子为1.05,表示预测值与观测值间仅误差5%。验证实验结果表明该线性方程可 用于室温22°C下72小时内草莓表面鼠伤寒沙门氏菌对数值变化量的预测。
[0076] 表2 4组骀证实骀的观测倌和樽型预测倌
【主权项】
1. 一种室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模型的建立方法，其特征在于所述方 法包括以下步骤： (1) 鼠伤寒沙门氏菌活化培养，得到细菌培养液 (2) 新鲜草莓用体积分数75 %的酒精浸泡灭菌，灭菌后的草莓浸泡于细菌培养液中接 种； (3) 接种后的草莓于室温下储藏，测定不同储藏时间下草莓上的菌株数； (4) 将细菌计数后进行对数转换，用式(2)的线性模型进行生长曲线拟合 Ygr〇= logioNt-logioN〇 = a+b X t (2) 其中，t为室温下储藏时间，单位为小时;Nt为t时的细菌数，单位为CFU/g; NO为样品初 始带菌量，单位为CFU/g; Ygro为t时细菌对数值变化量，a，b分别为线性方程待拟合的参数； 线性拟合求出a、b。2. 按权利要求1所述的方法建立得到的室温条件下草莓表面鼠伤寒沙门氏菌预测模 型，其特征在于如下式(5) Ygr〇= logioNt-logioN〇 = 0.359+0.081 X t (5) 其中，t为室温下储藏时间，Nt为t时的细菌数，单位为CFU/g; NO为样品初始带菌量，单 位为CFU/g; Ygro为t时细菌对数值变化量。
【文档编号】G06Q10/04GK106086155SQ201610488762
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】杨桂玲, 汪雯, 王强, 周育, 蔡铮, 宋雯
【申请人】浙江省农业科学院